יישום כריתה זעיר פולשנית של גידולי מוח במכרסמים לאיסוף רקמות בעלות כדאיות גבוהה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כריתה סטנדרטית של גידולי מוח במכרסמים באמצעות גישה זעיר פולשנית עם מערכת שימור רקמות משולבת. לטכניקה זו יש השלכות על שיקוף מדויק של סטנדרט הטיפול במכרסמים ובמודלים אחרים של בעלי חיים.

Abstract

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פרדיגמה סטנדרטית לכריתת גידולי מוח של מכרסמים ושימור רקמות. בפרקטיקה הקלינית, כריתה מקסימלית של הגידול היא הטיפול הסטנדרטי עבור רוב גידולי המוח. עם זאת, רוב המודלים של גידולי מוח פרה-קליניים הזמינים כיום אינם כוללים כריתה, או משתמשים במודלים של כריתה כירורגית שגוזלים זמן רב ומובילים לתחלואה משמעותית לאחר הניתוח, לתמותה או לשונות ניסיונית. בנוסף, ביצוע כריתה במכרסמים יכול להיות מרתיע מכמה סיבות, כולל היעדר כלי ניתוח או פרוטוקולים דומים מבחינה קלינית והיעדר פלטפורמה מבוססת לאיסוף רקמות סטנדרטי. פרוטוקול זה מדגיש את השימוש בהתקן כריתה רב-תכליתי ולא אבלטיבי ובמערכת שימור רקמות משולבת המותאמת מהגרסה הקלינית של המכשיר. המכשיר שהופעל במחקר הנוכחי משלב יניקה הניתנת לכוונון ולהב גלילי בצמצם כדי לחקור, לחתוך ולינוק רקמות במדויק. מכשיר הכריתה הזעיר פולשני מבצע את תפקידיו דרך אותו חור בור המשמש להשתלת הגידול הראשונית. גישה זו ממזערת שינויים באנטומיה האזורית במהלך ניתוחי ביופסיה או כריתה ומפחיתה את הסיכון לאיבוד דם משמעותי. גורמים אלה הפחיתו באופן משמעותי את זמן הניתוח (<2 דקות/חיה), שיפרו את הישרדות בעלי החיים לאחר הניתוח, השתנות נמוכה יותר בקבוצות ניסוי, והביאו לכדאיות גבוהה של רקמות ותאים שנכרתו לניתוחים עתידיים. תהליך זה מתאפשר על ידי מהירות להב של ~ 1,400 מחזורים לדקה, המאפשרת קצירת רקמות למערכת סגורה סטרילית שניתן למלא בפתרון פיזיולוגי מועדף. בהתחשב בחשיבות המתפתחת של לימוד ומידול מדויק של ההשפעה של ניתוחים, שימור וניתוח השוואתי קפדני של דגימות כריתת גידולים אזוריות, וטיפולים תוך חלליים, פרוטוקול ייחודי זה ירחיב את ההזדמנויות לחקור שאלות ללא מענה על ניהול פריאופרטיבי וגילוי טיפולי עבור חולי גידולי מוח.

Introduction

גליובלסטומה (GBM) הוא גידול המוח הראשוני הנפוץ והאגרסיבי ביותר במבוגרים. למרות ההתקדמות האחרונה בתחום הנוירוכירורגיה, פיתוח תרופות ממוקדות מטרה וטיפול בהקרנות, שיעור ההישרדות של 5 שנים עבור חולי GBM הוא פחות מ -5%, נתון שלא השתפר באופן משמעותי במשך יותר משלושה עשורים¹. לפיכך, יש צורך באסטרטגיות טיפול יעילות יותר.

כדי לפתח טיפולים חדשים, מתברר יותר ויותר כי פרוטוקולים ניסיוניים צריכים (1) להשתמש במודלים פרה-קליניים הניתנים לתרגום המשחזרים במדויק את ההטרוגניות והמיקרו-סביבה של הגידול, (2) לשקף את משטר הטיפול הסטנדרטי המשמש בחולים עם GBM, הכולל כיום ניתוח, הקרנות וכימותרפיה, ו-(3) להסביר את ההבדל בין ליבה כרתית לשארית, רקמות גידול פולשניות 2,3,4,5. עם זאת, רוב המודלים של גידולי מוח פרה-קליניים הזמינים כיום אינם מיישמים כריתה כירורגית או משתמשים במודלים של כריתה כירורגית שגוזלים זמן רב יחסית, מה שמוביל לכמות משמעותית של איבוד דם או לחוסר סטנדרטיזציה. יתר על כן, ביצוע כריתה של גידולי מוח מכרסמים יכול להיות מאתגר בשל היעדר כלי ניתוח או פרוטוקולים דומים מבחינה קלינית והיעדר פלטפורמה מבוססת⁶ לאיסוף רקמות שיטתי (טבלה 1).

הפרוטוקול הנוכחי נועד לתאר פרדיגמה מתוקננת לכריתת גידולי מוח של מכרסמים ושימור רקמות באמצעות מערכת כריתה זעיר פולשנית זעיר פולשנית רב-תפקודית (MIRS) ומערכת שימור רקמות משולבת (TPS) (איור 1). צפוי כי טכניקה ייחודית זו תספק פלטפורמה סטנדרטית שניתן להשתמש בה במחקרים שונים במחקרים פרה-קליניים עבור GBM וסוגים אחרים של מודלים של גידולי מוח. חוקרים החוקרים שיטות טיפוליות או אבחוניות לגידולי מוח יכולים ליישם פרוטוקול זה כדי להשיג כריתה סטנדרטית במחקריהם.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת מרילנד והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. C57BL/6 נקבות עכברים, בנות 6-8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). כל תקנות הבטיחות הביולוגית ברמה 2 (BSL-2) בוצעו, כולל שימוש במסכות, כפפות ושמלות.

1. השתלת גידול תוך גולגולתי ראשונית

1. בשלב הראשוני של המחקר, הזריקו תוך גולגולתי לכל עכבר 100,000 תאים (GL261 קו תאי גליומה מורין) התלויים ב-4 μL של תמיסת מלח עם אגירת פוספטים (1x PBS) לעומק של 2.5 מ"מ בעקבות הדו"ח^{שפורסם קודם לכן 7}.
2. כימות אות הגידול בכל עכבר באמצעות מערכת ההדמיה in vivo ⁸ 9 ימים לאחר השתלת הגידול.
   הערה: במידת הצורך, חלקו את העכברים לשתי קבוצות על פי עומס הגידול. במחקר הנוכחי, שתי הקבוצות היו: (1) עכברים עם עומס גידול קטן יחסית (אות ביולומינסנטי ממוצע = 5.5e+006 ± 0.1e+006 פוטונים/s, n = 10) ו-(2) עכברים עם עומס גידול גדול יחסית (אות ביולומינסנטי ממוצע = 1.69e+007 ± 0.2e+007 פוטונים/s, n = 10), (p < 0.05, מבחן מאן-וויטני)⁹.
3. חלקו כל קבוצה לשתי תת-קבוצות דומות.
   הערה: במחקר זה, שתי תת-הקבוצות היו: עכברים לא מטופלים (n = 5) ועכברים עם גידולים שעברו כריתה כירורגית באמצעות MIRS (n = 5), (p > 0.05, מבחן מאן-וויטני)⁹.
4. החל מיום הכריתה, עקבו אחר התקדמות הגידול באמצעות מערכת ההדמיה in vivo בתדירות המבוססת על דפוס צמיחת הגידול.
   הערה: עבור קו התאים GL261, עקוב אחר התקדמות הגידול ביום הכריתה ולאחר מכן כל 3-6 ימים.

2. כריתת הגידול באמצעות מירס

1. הרדמת העכבר באמצעות תערובת גזים איזופלורן-O₂ בתא אינדוקציה או הזרקה תוך-צפקית של תמיסת קסילזין/קטמין.
   1. אם משתמשים בהרדמת הגז, הגדירו את קצב זרימת הגז ל-1.0 מ"ל/דקה ואת מכשיר האידוי ל-2.0% להשראת הרדמה, הדורשת בדרך כלל 3-5 דקות בתא (ראו טבלת חומרים).
   2. אם משתמשים בחומר ההרדמה הניתן להזרקה, מרדימים את העכברים על ידי הזרקת 0.2 מ"ל של תמיסת הרדמה (80-100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10-12.5 מ"ג/ק"ג של קסילזין, ראו טבלת חומרים) באופן תוך-צפקי.
2. להעריך את החיה עבור הרגעה נאותה על ידי צביטה של הבוהן. החל משחה אופטלמית על העיניים כדי למנוע יובש של הקרנית. מתן משכך כאבים (0.03-0.06 מ"ג / ק"ג buprenorphine תת עורית) לפני ההליך.
3. הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקטית (ראה טבלת חומרים) לאחר אישור טשטוש מלא.
   הערה: אם משתמשים בהרדמת גז, הניחו את אפו של העכבר בתוך חרוט אף, שם הוא ימשיך לקבל את תערובת האיזופלורן-O₂ במהלך ההליך (1.5%).
4. הסר את הסיכות הקודמות, ולאחר מכן הסר את השיער עם קרם דפילציה או על ידי גילוח. יש לחטא את העור במחזורים מתחלפים של פילינג על בסיס כלורהקסידין/בטאדין ואלכוהול. לאחר מכן, באמצעות אזמל סטרילי, יש ליצור חתך קו אמצע אורכי של 1 ס"מ לאורך הצלקת הניתוחית הקודמת.
5. חברו את ידית ה-MIRS לזרוע הסטריאוטקטית דרך מתאם הבמה/מחזיק הידית ליציבות ודיוק משופרים.
6. הגדר את מכונת MIRS (ראה טבלת חומרים) באמצעות ההגדרות הבאות (איור 1).
   1. הכנס את כבל החשמל שנקבע בלוח האחורי לכלי הקיבול של כבל החשמל. הפעל או כבה את אספקת החשמל למערכת על-ידי מעבר למצב (1 = מופעל, 0 = כבוי).
   2. הכנס קצה אחד של צינור החנקן (המסופק עם הקונסולה) לתוך ההתאמה הגברית בלוח האחורי של הקונסולה. סובב את אום החיבור בכיוון השעון כדי להדק את החיבור.
      הערה: הקצה הנגדי של הצינור צריך להיות מחובר לאספקת החנקן.
   3. לפני חיבור הצינור לאספקת החנקן, ודא כי לחץ האספקה אינו עולה על 100 psig, שהוא לחץ אספקת הקלט המומלץ עבור הקונסולה.
      הערה: הקונסולה תיצור שאיפה משלה כאשר היא מופעלת על ידי דוושת הרגל לאחר שהחנקן סופק לקונסולה.
   4. אבטחו את המכסה של יציאת הוואקום ואטמו אותו כדי למנוע דליפה במערכת הוואקום. כל דליפה במערכת השאיפה תשפיע על הביצועים של קונסולת מירס.
   5. אם השאיפה נמוכה מ-17 במהלך ההתקנה או ההדבקה, בדוק שידית השאיפה בחזית הקונסולה מוגדרת ברמה המרבית (100), ודא שאין דליפה במערכת השאיפה, וודא שלחץ אספקת קלט החנקן נכון.
   6. כדי לחבר את דוושת הרגל לקונסולה, הכנס את מחבר דוושת הרגל האפורה לכלי הקיבול האפור שלו עד שהוא ילחץ ויתאים למקומו.
      הערה: מחבר דוושת הרגל מתחבר לקונסולה בכיוון אחד, והוא ממוקלד.
   7. כדי לחבר את הידית לקונסולה, הכנס את מחבר הידית הכחולה לכלי הקיבול הכחול שלה עד שהוא ילחץ ויתאים למקומו.
      הערה: מחבר הידית מתחבר לקונסולה בכיוון אחד, והוא מוקלד.
   8. הכינו כל ידית לפני השימוש במערכת על ידי שאיפת נוזל סטרילי מקערה קטנה לתוך הפתח, דרך הצינורות והידית, ולאחר מכן לתוך המכל כדי להבטיח שהחלק הפנימי של הצינור והידית משומנים כדי להפחית את חסימות הרקמות.
   9. התכונן לשאיפה בלבד או לשאיפה עם חיתוך על ידי בחירת המצב המתאים בלוח הקדמי של הקונסולה. התחל באמצעות דוושת כף הרגל.
7. הכנס את צינורית 23 G MIRS לתוך חור הבור לעומק של 2.5 מ"מ.
8. התחל את תהליך הכריתה על ידי לחיצה על דוושת כף הרגל המחוברת לצינורית. בצע מחזור מלא אחד (360°) או יותר של כריתה באמצעות ידית הבקרה בידית.
   הערה: ככל שבוצעו יותר מחזורים, כך נפח גדול יותר של רקמת הגידול נכרת.
9. לאחר השלמת תהליך הכריתה, משכו את צינורית 23 G MIRS מחור הבור והשתמשו ב-5 מ"ל של PBS 1x כדי לשטוף את הצינורות ולהיפטר מכל שאריות הפסולת.
10. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית וסגור את הפצע באמצעות מהדק או חומר תפירה 4-0 (ראה טבלת חומרים).
11. הניחו את העכבר על כרית חימום או תחת אור מחמם במהלך ההתאוששות מההרדמה לפני שתחזירו לכלוב שלו.
12. לאחר סיום הניסוי, יש לטהר את הצינורית באמצעות שטיפה. החליפו עם מדיה צוננת ואוויר כדי "לדחוף" את כל הרקמה שנכרתה בחזרה למכל האיסוף. הסר את מכל האיסוף מהמערכת וסגור את המכסה עם המכסה שסופק.
13. לאחר השלמת שלב 2.12, מניחים את הקצה הדיסטלי של הצינורית לתוך 3% H 2O₂ ומורחים יניקה ב 24-25 ב Hg כדי למלא את קו היניקה בחזרה למכל איסוף היניקה ולתת לעמוד במשך 60-90 שניות. יש לשטוף עם מדיה סטרילית הפועמת באוויר ובמדיה לסירוגין.
14. עקוב אחר העכברים אחר סימנים נוירולוגיים (תנועות לא סדירות חריגות או התקפים) לאחר ההליך.
15. להרדים את העכברים עם ליקויים נוירולוגיים חמורים (להיות רדומים, יש מראה כחוש, מחובק לאחור, או יש תנועות לא יציבות).
    הערה: במחקר הנוכחי, נעשה שימוש ב-200 מ"ג/ק"ג של תמיסת המתת חסד מסחרית (ראו טבלת חומרים) כדי להרדים כל עכבר.

3. איסוף רקמות באמצעות TPS

1. לטבול את דגימת הגידול בצלחת תרבית רקמה המכילה מדיום ליזה RBC (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הרקמה שנקטפה מהמירס לתוך התב"ע תהיה בעיקר בצורה של תאים בודדים יחד עם גושי רקמה קטנים.
2. מניחים מסנן של 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) על צינור חרוטי של 50 מ"ל ומשתמשים בבוכנה של מזרק 5 מ"ל כדי להעביר את דגימת הגידול דרך המסנן.
3. עם פיפטה העברה, השתמש במדיה RPMI-1640 כדי להקל על מעבר של תאים וכל מסת רקמה דרך המסנן.
4. צנטריפוגה ב 428 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נאטנט על ידי פיפטה.
5. יש להשעות כל דגימה ב-5 מ"ל של מדיום RPMI-1640 מוכן.
6. כדי להגדיל את כדאיות הרקמות, במיוחד אם מדמיינים גושי רקמה גדולים ברושם הראשוני, הוסיפו את הנפחים הנדרשים של קוקטייל האנזים (המכיל DNAse I, collagenase IV, dispase, Papain ו-EDTA, ראו טבלת חומרים) לכל דגימה. השתמש במערבולת כדי לערבב את הפתרונות.
   הערה: שלב 3.6 הוא אופציונלי. הרכב קוקטייל האנזים (בנפח כולל של 5 מ"ל/דגימה): 300 μL של DNAse I דרגה II, 150 μL של קולגןאז/Dispase (פיברונקטין קליפס, קולגן IV, I, וחומצות אמינו לא קוטביות), 250 μL של פפאין (פרוטאז לא ספציפי), ו-6 μL של 0.5 M EDTA.
7. מניחים את הדגימות באינקובטור שייקר שנקבע ב-200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
8. לאחר 20 דקות, סובב את הדגימות ב 428 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט.
9. סנן תאים בודדים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר והסתובב כלפי מטה ב-274 x g למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בצע ניתוח כדאיות תאים¹⁰ עם טריפאן כחול והמוציטומטר (ראה טבלת חומרים).
   הערה: הכדאיות ביום 0 נעה בין 30%-70% ועולה משמעותית תוך 2-3 ימים.
10. המשך לשלבים 4, 5 או 6, בהתאם לבדיקת הכדאיות הדרושה.

4. גידול תאים בתרבית דבק

1. במכסה מנוע זרימה למינרית מאושר, יש להשעות את הכדור במדיום דבק המכיל סרום (כגון DMEM, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) של 1% פניצילין) ותאי צלחת בבקבוק תאים דבק.
2. לשמור על התאים בסביבה דגירה מבוקרת (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).

5. גידול תאים בתרבית השעיה (נוירוספרות)

1. במכסה מנוע זרימה למינרית מאושר, יש לתלות מחדש את הכדור בתא גזע שלם ללא סרום^{בינוני 11} וצלחת בבקבוק תלייה.
2. לשמור על התאים בסביבה דגירה מבוקרת (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך_2-3 ימים כדי לאפשר היווצרות נוירוספרה.
3. לאחר הדמיה של הנוירוספרות במדיום התרבית, השתמש בטריפסין-EDTA או Accutase (ראה טבלת חומרים) כדי להשיג תרחיפים חד-תאיים לצורך מעבר.
   הערה: כל עוד ננקטת זהירות מיוחדת במהלך הקציר ונעשה שימוש במדיה מתאימה התומכת בתאי גזע עצביים, תאי הגזע ברקמה שנקטפה חייבים ליצור נוירוספרות תוך מספר ימים.

6. הכנת תאים להשתלה מחדש

1. יש להשעות את הכדור בריכוז של 100,000 תאים חיים לכל 4 μL של PBS אחד.
2. יש להזריק מיד לעכברים תמימים בשיטת השתלת הגידול התוך גולגולתי (שלב 1).

7. ניתוח היסטולוגי

1. מיד לאחר הכריתה, חלצו וקבעו את המוחות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 24 שעות¹².
2. מעבירים את המוחות לתמיסת סוכרוז של 30% עד שהם רוויים בסוכרוז (שקוע עד לתחתית המיכל).
3. להעביר את המוח לתמיסת אתנול של 70%.
4. בצע הטמעת בלוק פרפין, חתך, והכתמה סטנדרטית של המטוקסילין ואאוסין (H&E) בעקבות דו"ח¹³ שפורסם בעבר.
   הערה: העובי של כל מקטע שנלקח להכתמה היה 10 מיקרומטר.

תוצאות

כריתה כירורגית באמצעות המירס מביאה לירידה משמעותית בנטל הגידול
בקבוצה עם עומס גידול קטן יותר, האות הביולומינסנטי הבסיסי הממוצע היה 5.5e+006 פוטונים/שנייה ± 0.2e+006 בתת-הקבוצה שעברה כריתה. לאחר כריתה, האות הביולומינסנטי הממוצע ירד ל-3.09e+006 פוטונים/שנייה ± 0.3e+006, (p <0.0001, מבחן מאן-וויט?...

Discussion

כריתת גידולים היא אבן פינה בתוכניות טיפול אונקולוגיות נוירוכירורגיות עבור גידולי מוח בדרגה נמוכה וגבוהה. ציטו-הפחתה והתפוררות של הגידול מתואמות עם שיפור בתפקוד הנוירולוגי והישרדות כללית בחולים עם גידולי מוח ^1,2,5,6. למר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD	309628
15 mL conical tubes	Corning	430052
200 proof ethanol	PharmCo	111000200
5 mL pipettes	CoStar	4487
70 micron filter	Fisher	08-771-2
Accutase	Millipore Sigma	SIG-SCR005
Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL)	Covetrus	33198
Anesthesia System	Patterson Scientific	78935903
Anesthesic Gas Waste Container	Patterson Scientific	78909457
Bench protector underpad	Covidien	10328
C57Bl/6, 6-8 week old mice	Charles River Laboratories	Strain Code 027
ChroMini Pro	Moser	Type 1591-Q
Collagenase-Dispase	Roche	#10269638001
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Countess II FL Hemacytometer	Thermo Fisher	A25750
Debris Removal Solution	Miltenyi Biotech	#130-109-398
D-Luciferin	Goldbio	LUCK-1G
DMEM F12 media	Corning	10-090-CV
DMEM media	Corning	10-013-CV
DNAse I	Sigma Aldrich	#10104159001
Eppendorf tubes	Posi-Click	1149K01
Euthanasia solution	Henry Schein	71073
FBS	Millipore Sigma	F4135
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10437-028
Formalin	Invitrogen	INV-28906
Gauze	Henry Schein	101-4336
hEGF	PeproTech EC	100-15
Heparin	Sigma	H-3149
hFGF-b	PeproTech EC	1001-18B
Induction Chamber	Patterson Scientific	78933388
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Isoflurane Vaporizer	Patterson Scientific	78916954
Ketamine	Covetrus	11695-0703-1
Kopf Stereotactic frame	Kopf Instruments	5001
Lightfield Microscope	BioTek	Cytation 5
Microinjection Unit	Kopf	5001
Micromotor drill	Foredom	F210418
MRI system	Bruker	7T Biospec Avance III MRI Scanner
NICO Myriad System	NICO Corporation
Ophthalmic ointment	Puralube vet ointment
Papain	Sigma Aldrich	#P4762
PBS	Invitrogen	#14190250
PenStrep	Millipore Sigma	N1638
Percoll solution	Sigma Aldrich	#P4937
Pipette controller	Falcon	A07260
Povidone-iodine solution	Aplicare	52380-1905-08
Progesterone	Sigma	P-8783
Putrescine	Sigma	P-5780
RPMI Media	Invitrogen	INV-72400120
Scalpel blade	Covetrus	7319
Scalpel handle	Fine Science Tools	91003-12
Skin marker	Time Out	D538,851
Staple remover	MikRon	ACR9MM
Stapler	MikRon	ACA9MM
Staples	Clay Adams	427631
Stereotactic Frame	Kopf Instruments	5000
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Suture, vicryl 4-0	Ethicon	J494H
T-75 culture flask	Sarstedt	83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x)	Lonza	BP10-548E
Trypsin-EDTA	Corning	MDT-25-053-CI