JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تحفيز الخلايا التائية و ILC2 المعبرة عن IL-9 أثناء عدوى N. brasiliensis ، ومع ذلك فقد تم التغاضي عن توصيفها إلى حد كبير في الأمعاء المصابة بسبب ترددها المنخفض وحركيتها التفاضلية. يصف هذا البروتوكول عزل هذه الخلايا عن الأعضاء المستهدفة المختلفة وتأكيد هويتها عن طريق قياس التدفق الخلوي في مراحل العدوى المختلفة.

Abstract

IL-9 هو سيتوكين متعدد الاتجاهات مرتبط بعمليات مختلفة ، بما في ذلك المناعة المضادة للأورام ، وتحريض أمراض الحساسية ، والاستجابة المناعية ضد عدوى الديدان الطفيلية ، حيث يلعب دورا مهما في طرد الطفيلي. في نموذج الفئران لعدوى Nippostrongylus brasiliensis ، يتم إنتاج IL-9 بشكل أساسي بواسطة الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + والخلايا اللمفاوية الفطرية الموجودة في الرئة والأمعاء الدقيقة والغدد الليمفاوية المستنزفة. نظرا للصعوبات التقنية التي ينطوي عليها تلطيخ IL-9 داخل الخلايا ، فضلا عن تعقيد عزل الخلايا المكونة للدم من الأمعاء الدقيقة عند الإصابة ، هناك حاجة ملحة لبروتوكول شامل ولكن مباشر لتحليل تعبير IL-9 في الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية المختلفة في هذا النموذج. يحدد البروتوكول الموصوف هنا حركية IL-9 التي تنتجها الخلايا التائية CD4 + والخلايا اللمفاوية الفطرية في الرئة والأمعاء الدقيقة ، وهي الأعضاء الرئيسية التي تستهدفها N. brasiliensis ، وكذلك في الغدد الليمفاوية المنصفية والمساريقية ، طوال فترة العدوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يفصل عدد اليرقات اللازمة للعدوى ، اعتمادا على نوع الخلية والعضو محل الاهتمام. يهدف هذا البروتوكول إلى المساعدة في توحيد المقايسات لتوفير الوقت والموارد من خلال إتاحة الفرصة للتركيز على الخلايا والأعضاء المحددة ومراحل المرض ذات الأهمية في نموذج عدوى N. brasiliensis.

Introduction

الديدان الخطافية هي طفيليات معوية تصيب ما يقرب من 700 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ، معظمهم في المناطق الاستوائية في البلدان المتخلفة. تسبب العدوى عالية الكثافة مع Ancylostoma duodenale و Necator americanus ، وهي طفيليات الدودة الشصية الأكثر شيوعا في البشر ، فقر الدم ونقص البروتين الذي يمكن أن يؤدي إلى تأخر النمو والنمو العقلي1. N. americanus وطفيلي القوارض Nippostrongylus brasiliensis يحفزان استجابة مناعية نموذجية من النوع 2 في مضيفهما ويتشاركان أوجه التشابه في دورة حياتهما. وبالتالي ، فإن إصابة الفئران ب N. brasiliensis هي النموذج الأكثر استخداما لعدوى الدودة الشصية البشرية. المرحلة 3 (L3) تنتقل اليرقات المعدية N. brasiliensis من الجلد إلى الرئة في الساعات القليلة الأولى بعد الإصابة. بمجرد دخولها إلى الرئة ، تصبح L4 وتهاجر إلى القصبة الهوائية لتبتلعها ، وتمر عبر المعدة ، وتصل إلى القناة الهضمية لتصبح بالغين (L5) في غضون 4-5 أيام. في القناة الهضمية ، تضع ديدان L5 بيضا يفرز في البراز لإعادة تشغيل دورة حياة الطفيلي2.

تتميز الاستجابة المناعية التي تسببها N. brasiliensis بزيادة في العديد من السيتوكينات من النوع 2 ، بما في ذلك IL-4 و IL-5 و IL-9 و IL-10 و IL-13 ، جنبا إلى جنب مع فرط الحمضات ، و basophilia ، وتضخم الخلايا البدينة والكأس ، وزيادة إنتاج IgG1 و IgE. تتركز معظم الدراسات التي تحاول تحديد وتعريف الاستجابات المناعية المستمدة من عدوى N. brasiliensis على دور IL-4 أو IL-13 في هذا النموذج3. ومع ذلك ، فقد تم التغاضي إلى حد كبير عن تحديد وتوصيف الخلايا المعبرة عن IL-9 ووظيفة هذا السيتوكين ، حتى نشر Licona-Limón et al. أول دراسة توضح دورا حاسما ل IL-9 في الاستجابة المناعية ضد N. brasiliensis. باستخدام الفئران المراسلة ، وصفت هذه الدراسة الخلايا التائية (معظمها T helper 9) والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 2 (ILC2s) كمجموعات فرعية خلوية رئيسية تعبر عن IL-9 عند الإصابة4.

من الممكن عزل وتوصيف الخلايا المناعية من الرئتين المصابة بالديدان الطفيلية ، وقد تم الإبلاغ عنها على نطاق واسع 3,4. ومع ذلك ، بسبب إعادة تشكيل الأنسجة المتأصلة وإنتاج المخاط ، ثبت أن القيام بذلك في الأمعاء المصابة يمثل تحديا تقنيا ، حتى نشر Ferrer-Font et al.5 مؤخرا. حددت المجموعة بروتوكولا لعزل وتحليل معلقات الخلية المفردة لمجموعات فرعية مناعية من أمعاء الفئران المصابة ب Heligmosomoides polygyrus. بناء على ذلك ، قمنا الآن بتوحيد بروتوكول للعزل والتحليل الخلوي للخلايا اللمفاوية المعبرة عن IL-9 من الأمعاء المصابة ب N. brasiliensis. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأنا حركية IL-9 من مصادر خلوية مختلفة ومواقع تشريحية طوال فترة العدوى.

يعد توصيف مجموعات الخلايا المتميزة المشاركة في هذه العدوى أمرا حيويا لفهم أوسع للاستجابة المناعية للطفيلي وتفاعله مع المضيف. يوفر هذا البروتوكول الشامل طريقا واضحا لعزل وتحليل الخلايا المنتجة ل IL-9 من الأعضاء المرغوبة في مراحل المرض ذات الاهتمام ، مما يسمح بتحسن حاد في المعرفة حول دور هذه الخلايا في عدوى N. brasiliensis وعدوى الطفيليات بشكل عام.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة هنا من قبل اللجنة الداخلية للتعامل مع الحيوانات (CICUAL) التابعة لمعهد علم وظائف الأعضاء الخلوية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك.

ملاحظة: يظهر مخطط انسيابي للبروتوكول بأكمله في الشكل 1.

1. إسكان الفئران

  1. استخدم مجموعات من الفئران البالغة من العمر 8-10 أسابيع ، إناثا أو ذكورا ، موجودة في مرافق حيوانية ذات درجة حرارة ورطوبة ثابتة في دورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، مع إمكانية الوصول إلى الماء والغذاء.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول سلالة الماوس مراسل IL-9 في خلفية C57BL/6، كما هو موضح سابقا4; ومع ذلك ، يمكن استخدام سلالات مراسل IL-9 الأخرى6،7،8 ، بالإضافة إلى تلطيخ IL-9 داخل الخلايا ، مع نتائج متغيرة9.

2. إصابة الفئران

  1. حلق الجزء الخلفي من الفئران من منتصف الجسم إلى بالقرب من قاعدة الذيل 1 يوم قبل الإصابة. استخدام التخدير ليس ضروريا.
  2. تلقيح كل فأر تحت الجلد ب 200 يرقات N. brasiliensis (L3) قابلة للحياة في المرحلة الثالثة في 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) 10 في أسفل الظهر ، كما هو موضح سابقا2،11 ، أو حقن 100 ميكرولتر من PBS وحده كعنصر تحكم. التضحية بالحيوانات في اليوم 4 أو اليوم 7 أو اليوم 10 بعد الإصابة.

3. عزل الرئة والأمعاء الدقيقة والغدد الليمفاوية المنصفية والمساريقي

  1. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم. ضع الماوس على ظهره ورشه بنسبة 70٪ إيثانول. قم بعمل شق في خط الوسط باستخدام المقص وافتح الجلد لكشف مناطق البطن والصدر.
    ملاحظة: يمكن استخدام الإيزوفلوران كطريقة بديلة للقتل الرحيم12. لا ينصح بغرف ثاني أكسيد الكربون ، لأن CO2 يؤدي إلى تلف أنسجة الرئة والنزيف13.
  2. عزل الغدد الليمفاوية المنصفية والرئتين
    1. قم بعمل شق في القص وقطعه على شكل حرف "V" لإزالة الأضلاع والعضلات الصدرية. بمجرد انكشاف التجويف الصدري ، حدد موقع الغدد الليمفاوية المنصفية بجوار المريء ، أسفل القلب (انظر الشكل التكميلي 1).
    2. استخراج الغدد الليمفاوية المنصفية وجمعها في 1 مل من وسط R-10 (الجدول 1) في لوحة استزراع 12 بئرا. الحفاظ على الجليد ، محمية من الضوء حتى المعالجة.
      ملاحظة: يجب حماية العينات من الضوء ، لتجنب تقليل إشارة الفلورسنت من الفئران المراسلة المستخدمة في هذه التجارب.
    3. استخراج الرئتين وجمعها في 1 مل من وسط R-10 في لوحة ثقافة 12 بئرا لكل فأر. الحفاظ على الجليد ، محمية من الضوء حتى المعالجة.
  3. عزل سلاسل العقدة الليمفاوية المساريقية والأمعاء الدقيقة
    1. كشف التجويف البريتوني ، وتحريك الأمعاء الدقيقة بعناية إلى اليمين لفضح سلسلة العقدة الليمفاوية المساريقية (MLN) على طول القولون.
    2. باستخدام الملقط ، قم بإزالة MLN ، ولفها برفق على منشفة ورقية ، واسحب الدهون.
    3. انقل MLN إلى 1 مل من وسط R-10 في لوحة استزراع ذات 12 بئرا. الحفاظ على الجليد ، محمية من الضوء حتى المعالجة.
    4. قطع الأمعاء الدقيقة أسفل العضلة العاصرة البوابية مباشرة وفوق الأعور. اسحب الأمعاء ببطء بمساعدة الملقط ، وأزل المساريق والأنسجة الدهنية المرفقة.
    5. ضع الأمعاء الدقيقة على منشفة ورقية وقم بترطيبها بسخاء باستخدام برنامج تلفزيوني. قم بإزالة بقع باير من الأمعاء الدقيقة بالمقص.
      ملاحظة: للحفاظ على البقاء ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية المتبقية ، والحفاظ على رطوبة الأمعاء الدقيقة باستخدام برنامج تلفزيوني أثناء العملية بأكملها.
    6. قطع الأمعاء الدقيقة طوليا باستخدام المقص ، وحرك الملقط برفق فوق الأمعاء المفتوحة لإزالة محتوى البراز والمخاط.
    7. امسك الأمعاء الدقيقة بالملقط ، واغسلها في 5 مل من برنامج تلفزيوني على الثلج عن طريق غمرها بعناية عدة مرات. كرر مرتين.
    8. قطع الأمعاء الدقيقة إلى قطع قصيرة (حوالي 5 مم) ، وجمعها في أنبوب مخروطي 50 مل مع 10 مل من HBSS14 مع 2٪ FBS (الجدول 1). استمر فورا في عزل الخلايا المخصوصة داخل الظهارة والصفيحة.

4. تحضير معلقات أحادية الخلية من الأمعاء الدقيقة والرئة والغدد الليمفاوية

ملاحظة: من المهم للغاية معالجة ستة فئران كحد أقصى لكل شخص عند تحضير معلقات أحادية الخلية من الأمعاء الدقيقة ، حيث تقل صلاحية الخلية بشكل كبير مع فترات معالجة أطول. تم تكييف هذه الطريقة من نموذج فأر عدوى Heligmosomoides polygyrus 5.

  1. قم بتسخين حاضنة الاهتزاز مسبقا ، ووسط R-20 ، و HBSS ، و HBSS-2 mM EDTA (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية.
  2. تحضير 10 مل من وسط هضم الأمعاء الدقيقة (الجدول 1) لكل عينة.
  3. هز قطع الأمعاء من الخطوة 3.3.8 بقوة باليد.
  4. قم بتصفية كل عينة من خلال شبكة نايلون (حوالي 10 سم × 10 سم) فوق قمع زجاجي. اغسل العينة بإضافة 10 مل من HBSS المسخن مسبقا فوق الشبكة وتجاهل التدفق. كرر مرة أخرى.
    ملاحظة: استخدم شبكة جديدة لكل عينة وأعد استخدامها طوال الإجراء.
  5. قم بإزالة الشبكة من القمع ، واجمع العينة من الشبكة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 10 مل من HBSS-2 mM EDTA الدافئ (الخطوة 4.1). احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، مع رج عند 200 دورة في الدقيقة.
  6. دوامة لمدة 10 ثوان بأقصى سرعة (3200 دورة في الدقيقة) وتصفية العينة بالشبكة فوق قمع زجاجي ، واستعادة التدفق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  7. كرر الخطوتين 4.5 و 4.6 مرتين ، واستعد التدفق في نفس الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. توجد الخلايا داخل الظهارة في هذا الجزء 30 mL. احفظ الأنسجة المتبقية.
  8. إعداد تعليق خلية واحدة من الخلايا داخل الظهارة
    1. أجهزة الطرد المركزي 30 مل من تعليق الخلية ، التي تم استردادها في الخطوة 4.7 ، عند 450 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من المادة الطافية.
    2. أضف 5 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من RPMI 10٪ FBS-20 ميكروغرام / مل DNase (الجدول 1). الحفاظ على الجليد ، محمية من الضوء حتى تلطيخ الخلية.
  9. تحضير معلق أحادي الخلية من خلايا الصفيحة المخصوصة
    1. اغسل أنسجة الأمعاء الدقيقة المتبقية من الخطوة 4.7 عن طريق سكب أكثر من 10 مل من HBSS الدافئ عبر الشبكة فوق القمع. كرر الغسيل. اجمع الأنسجة من الشبكة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 10 مل من وسط هضم الأمعاء الدقيقة.
    2. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع رج عند 200 دورة في الدقيقة. دوامة بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان كل 5 دقائق.
    3. أضف 10 مل من المخزن المؤقت FACS-EDTA (الجدول 1) لوقف تفاعل الهضم ، وضعه على الثلج.
    4. قم بتصفية كل عينة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر باستخدام ماصة مصلية ، واستعادة التعليق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يوضع على الجليد.
    5. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. تخلص من المادة الطافية. اغسل حبيبات الخلية ب 5 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من RPMI 10٪ FBS-20 ميكروغرام / مل DNase. الحفاظ على الجليد ، محمية من الضوء حتى تلطيخ الخلية.
  10. إعداد تعليق خلية واحدة من الرئة
    ملاحظة: يجب معالجة كل رئة وأمعاء دقيقة بالتوازي من قبل شخصين لتجنب أوقات المناولة الممتدة ، مما يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا.
    1. تحضير 4 مل من وسط هضم الرئة (الجدول 1) لكل عينة معالجة.
    2. قم بإزالة وسيط RPMI من البئر الذي يحتوي على الرئتين من الخطوة 3.2.3. قطع الرئة إلى قطع صغيرة مع مقص غرامة.
    3. انقل قطع الرئة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ملعقة. أضف 4 مل من وسط هضم الرئة (الجدول 1).
    4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع رج عند 250 دورة في الدقيقة. عند الانتهاء ، احتفظ بالثلج حتى تتم معالجة كل عينة.
    5. قم بتصفية كل عينة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، موضوعة في بئر واحدة من لوحة استزراع 6 آبار. فصل الأنسجة مع مكبس حقنة.
    6. استرجع كل عينة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وأضف 4 مل من وسط R-2 (الجدول 1). احتفظ بالثلج أثناء معالجة العينات الأخرى.
    7. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط R-5 (الجدول 1).
    8. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد 4 مل من محلول تدرج الكثافة بنسبة 27.5٪ (الجدول 1) لكل عينة لإثراء جزء الخلية المكونة للدم15,16. تعد إستراتيجية الفصل أحادي الخلية هذه أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة وأقل سمية مقارنة بوسائط التدرج المماثلةالأخرى 17.
    9. أضف 4 مل من محلول تدرج الكثافة بنسبة 27.5٪ إلى 1 مل من تعليق الخلية من الخطوة 4.10.7 ، ورج بقوة.
    10. أضف ببطء 1 مل من وسط R-5 (الجدول 1) أعلى التعليق المختلط لإنشاء مرحلتين.
    11. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 20 دقيقة في RT ، مع تسارع منخفض وإيقاف تشغيل الفرامل. راقب الحلقة التي تشكلت بين المرحلتين.
    12. استرجع الحلقة المتكونة بين المرحلتين باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل ، وأعد تعليقها في 4 مل من وسط R-2.
    13. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت ACK (الجدول 1) ، واحتضانها لمدة دقيقة واحدة في RT.
    14. أضف 4 مل من R-5 المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط R-10. الحفاظ على الجليد ، محمية من الضوء حتى تلطيخ لقياس التدفق الخلوي.
  11. إعداد تعليق خلية واحدة من الغدد الليمفاوية
    1. ضع الغدد الليمفاوية من الخطوات 3.2.2 أو 3.3.3 بين قطعتين من الشبكة في بئر من صفيحة استزراع ذات 6 آبار ، وانفصلها بمكبس حقنة.
    2. استعادة تعليق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط R-10. الحفاظ على الجليد ، محمية من الضوء حتى تلطيخ لقياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: إذا كانت الكتل مرئية ، فقم بتصفية العينة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.

5. تلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي (الشكل 2 والشكل 3)

ملاحظة: قم بالطرد المركزي لمعلقات خلايا العقدة الليمفاوية من الخطوة 4.11.3 عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (الجدول 1).

  1. تلطيخ الخلايا لتحديد ILC2s (الشكل 3 والشكل التكميلي 2)
    ملاحظة: إجراء التلوين هذا خاص بتحديد خلايا ILC2 المعبرة عن IL-9.
    1. لوحة 150 ميكرولتر لكل عينة رئة (حوالي 1.8 × 10 6 خلايا) من الخطوة 4.10.14 ، و 50 ميكرولتر لكل عينة عقدة ليمفاوية من الخطوة 4.11.3 (حوالي 0.7 × 10 6 و 2.2 × 106 خلايا لعينات العقدة الليمفاوية المنصفية والمساريقية ، على التوالي) في صفيحة استزراع سفلية مخروطية الشكل مكونة من 96 بئرا. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. صفيحة 100 ميكرولتر لكل عينة أمعاء دقيقة (حوالي 2.7 × 10 6 و0.6 × 106 خلايا لعينات البروبريا داخل الظهارة والصفيحة ، على التوالي) من الخطوتين 4.8.3 و 4.9.7 في صفيحة استزراع قاع مخروطية الشكل ذات 96 بئرا. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كل حبيبة خلية في 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة البيوتينيلية (الجدول 2) المخفف في المخزن المؤقت FACS. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
      ملاحظة: استخدم المخزن المؤقت FACS مع 20 ميكروغرام / مل DNase لعينات البروبريا داخل الظهارة والصفيحة.
    4. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل الطاف.
    6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 50 ميكرولتر من كوكتيل الجسم المضاد / البقع (الجدول 2) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    7. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    8. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل الطاف. كرر الغسيل (الخطوة 5.1.7) ، وتخلص من المادة الطافية.
    9. أعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وقم بتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    10. بالنسبة لعينات الأمعاء الدقيقة والرئة ، استخدم استراتيجية البوابة: الخلايا الليمفاوية ، الخلايا المفردة ، الخلايا الحية ، الخلايا المكونة للدم ، خلايا CD90 + Lineage ، خلايا ST2 + ، وخلايا IL-9 + (الشكل 3A ، B والشكل التكميلي 2A). بالنسبة لعينات العقدة الليمفاوية ، استخدم استراتيجية البوابة: الخلايا الحية ، الخلايا المفردة ، خلايا النسب CD90 + ، خلايا ST2 + ، وخلايا IL-9 + (الشكل التكميلي 2B ، C).
  2. تلطيخ الخلايا لتحديد الخلايا الليمفاوية المنتجة ل IL-9 (الشكل 2 والشكل التكميلي 3)
    1. انقل 800 ميكرولتر لكل عينة رئة من الخطوة 4.10.14 إلى أنبوب 1.5 مل (حوالي 14.6 × 106 خلايا). جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
    2. بالنسبة لعينات العقدة الليمفاوية ، لوحة 400 ميكرولتر من تعليق الخلية من الخطوة 4.11.3 (حوالي 5.6 × 10 6 و 17.5 × 106 خلايا لعينات العقدة الليمفاوية المنصفية والمساريقي ، على التوالي) في صفيحة سفلية مخروطية مكونة من 96 بئرا في خطوتين.
      1. نقل 200 ميكرولتر أولا ، جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
      2. نقل 200 ميكرولتر أخرى إلى البئر المقابلة. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 50-400 ميكرولتر من الجسم المضاد / كوكتيل البقع (الجدول 3) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
      ملاحظة: يجب إعادة تعليق عينات الرئة في 400 ميكرولتر ، وعينات العقدة الليمفاوية المنصفية في 50 ميكرولتر ، وعينات العقدة الليمفاوية المساريقية في 100 ميكرولتر من كوكتيل التلطيخ.
    4. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى عينات العقدة الليمفاوية المنصفية و 100 ميكرولتر إلى عينات العقدة الليمفاوية المساريقي. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    5. اغسل عينات الرئة والعقدة الليمفاوية عن طريق إعادة تعليق الكريات في 1 مل و 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، على التوالي. جهاز طرد مركزي عند 450 ×جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وكرر الغسيل.
    6. إعادة تعليق عينات الرئة في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. استخدم استراتيجية البوابة: الخلايا الليمفاوية ، الخلايا المفردة ، الخلايا الحية ، الخلايا المكونة للدم ، خلايا CD4 + TCRβ + ، وخلايا IL-9 + (الشكل 2 أ).
    7. إعادة تعليق عينات العقدة الليمفاوية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. استخدم استراتيجية البوابة: الخلايا الليمفاوية ، الخلايا المفردة ، الخلايا الحية ، خلايا CD4 + TCRβ + ، وخلايا IL-9 + (الشكل 2B والشكل التكميلي 3A).

6. تحديد الأعداد المطلقة للخلايا في معلقات الخلية الواحدة

  1. خفف العينات من خطوات العزل 4.8.3 و 4.9.7 و 4.10.14 و 4.11.3 باستخدام PBS بنسبة 1:20 (10 ميكرولتر من العينة + 190 ميكرولتر من PBS).
  2. امزج 10 ميكرولتر من كل عينة مخففة من الخطوة 6.1 مع 10 ميكرولتر من تريبان بلو. تحميل 10 ميكرولتر في مقياس الدم وحساب الخلايا الحية ، مع الأخذ في الاعتبار كل تخفيف.
  3. احصل على الأعداد المطلقة للخلايا بضرب النسبة المئوية للسكان محل الاهتمام من الخلايا الحية التي يحددها قياس التدفق الخلوي (الخلايا السالبة صبغة البقاء) في العدد الإجمالي للخلايا الحية في معلق الخلية الواحدة بعد العزل ، وقسمة هذا الرقم على 100 (الشكل التكميلي 4 ، الشكل التكميلي 5 ، والشكل التكميلي 6).
    العدد المطلق = (النسبة المئوية للسكان محل الاهتمام من الخلايا الحية التي يحددها قياس التدفق الخلوي × إجمالي عدد الخلايا الحية في تعليق الخلية الواحدة) / 100

النتائج

تم حقن الفئران تحت الجلد مع 200 يرقات L3 المرحلة N. brasiliensis ، أو مع PBS لضوابط وهمية. تم تعديل عدد اليرقات المستخدمة في هذا البروتوكول من أجل عزل الخلايا القابلة للحياة من الرئتين والأنسجة اللمفاوية والأمعاء الدقيقة ، على عكس التقارير السابقة حيث تم استخدام كميات أعلى من الديدان للكشف عن ال...

Discussion

يتطلب الفهم الكامل للتفاعلات بين الطفيليات المعوية والمضيف والاستجابات المناعية لعدوى الديدان الطفيلية تحديد وتحليل مجموعات الخلايا المختلفة وجزيئات المستجيبات التي تعتبر أساسية لتحريض إعادة تشكيل الأنسجة وطرد الديدان. تمثل عدوى الديدان الطفيلية المنقولة بالتربة مشكلة كبيرة في البل?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويود أصحاب البلاغ أن يعربوا عن تقديرهم لخوسيه لويس راموس - بالديراس لما قدمه من دعم تقني. تم دعم هذا العمل من خلال المنحة التالية ل PLL من CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). وحصل كل من OM-P وEO-M على زمالة من المجلس الوطني للخلايا (736162 و 481437 على التوالي). حصلت MCM-M على زمالة من CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK bufferHomemade
Attune Nxt cytometerThermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
Collagenase DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorterBD Biosciences
FACS Melody cell sorterBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
FcεRIeBioscience13589885
Fetal bovine serumGibco26140079
FlowJoFlowJoFlow cytometry analysis data software
Gr-1Tonbo305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Homemade
IL-9biolegend514103
NK1.1 Biolegend108704
Nylon mesh ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Phosphate-buffered saline Homemade
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptavidinBiolegend405206
TCR-β Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γδ Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tricine buffer Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability DyeBiolegend423101

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193 IL 9 Th9 ILC2 IL 9 N brasiliensis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved