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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les cellules T et ILC2 exprimant l’IL-9 sont induites au cours de l’infection à N. brasiliensis , mais leur caractérisation a été largement négligée dans l’intestin infecté en raison de leur faible fréquence et de leur cinétique différentielle. Ce protocole décrit l’isolement de ces cellules à partir de différents organes cibles et la confirmation de leur identité par cytométrie en flux à différents stades de l’infection.

Résumé

L’IL-9 est une cytokine pléiotropique associée à divers processus, notamment l’immunité antitumorale, l’induction de pathologies allergiques et la réponse immunitaire contre les infections à helminthes, où elle joue un rôle important dans l’expulsion du parasite. Dans un modèle murin d’infection à Nippostrongylus brasiliensis, l’IL-9 est produite principalement par les lymphocytes T CD4+ et les cellules lymphoïdes innées présentes dans les poumons, l’intestin grêle et les ganglions lymphatiques drainants. Compte tenu des difficultés techniques liées à la coloration intracellulaire de l’IL-9, ainsi que de la complexité de l’isolement des cellules hématopoïétiques de l’intestin grêle lors de l’infection, il existe un besoin urgent d’un protocole complet mais simple pour analyser l’expression de l’IL-9 dans différents tissus lymphoïdes et non lymphoïdes dans ce modèle. Le protocole décrit ici décrit la cinétique de l’IL-9 produite par les lymphocytes T CD4+ et les lymphoïdes innés dans les poumons et l’intestin grêle, les principaux organes ciblés par N. brasiliensis, ainsi que dans les ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques, tout au long de l’infection. En outre, il détaille le nombre de larves nécessaires à l’infection, en fonction du type de cellule et de l’organe d’intérêt. Ce protocole vise à aider à la normalisation des tests afin d’économiser du temps et des ressources en offrant la possibilité de se concentrer sur les cellules, les organes et les stades spécifiques de la maladie d’intérêt dans le modèle d’infection à N. brasiliensis.

Introduction

Les ankylostomes sont des parasites intestinaux qui infectent environ 700 millions de personnes dans le monde, principalement dans les zones tropicales des pays sous-développés. Les infections de haute intensité à Ancylostoma duodenale et Necator americanus, les parasites de l’ankylostome les plus courants chez l’homme, provoquent une anémie et une carence en protéines pouvant entraîner un retard de croissance et de développement mental1. N. americanus et le parasite rongeur Nippostrongylus brasiliensis induisent une réponse immunitaire prototypique de type 2 chez leur hôte et partagent des similitudes dans leur cycle de vie. Par conséquent, l’infection des souris par N. brasiliensis est le modèle le plus couramment utilisé pour les infections par l’ankylostome humain. Stade 3 (L3) Les larves infectieuses de N. brasiliensis se déplacent de la peau vers les poumons dans les premières heures suivant l’infection. Une fois dans les poumons, ils deviennent L4 et migrent vers le haut de la trachée pour être avalés, traversent l’estomac et atteignent l’intestin pour devenir adultes (L5) dans les 4-5 jours. Dans l’intestin, les vers L5 pondent des œufs qui sont excrétés dans les matières fécales pour relancer le cycle de vie du parasite2.

La réponse immunitaire induite par N. brasiliensis est caractérisée par une augmentation de plusieurs cytokines de type 2, y compris IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 et IL-13, ainsi que par une éosinophilie, une basophilie, une hyperplasie caliciforme et mastocytes et une production accrue d’IgG1 et d’IgE. La plupart des études visant à identifier et à définir les réponses immunitaires provoquées lors de l’infection à N. brasiliensis sont centrées sur le rôle de l’IL-4 ou de l’IL-13 dans ce modèle3. Cependant, l’identification et la caractérisation des cellules exprimant l’IL-9 et la fonction de cette cytokine avaient été largement négligées, jusqu’à ce que Licona-Limón et al. publient la première étude démontrant un rôle critique de l’IL-9 dans la réponse immunitaire contre N. brasiliensis. En utilisant des souris rapporteures, cette étude a décrit les cellules T (principalement T auxiliaires 9) et les cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2) comme les principaux sous-ensembles cellulaires exprimant l’IL-9 lors de l’infection4.

L’isolement et la caractérisation des cellules immunitaires des poumons infectés par des helminthes sont possibles et ont été largement rapportés 3,4. Cependant, en raison du remodelage tissulaire inhérent et de la production de mucus, le faire dans l’intestin infecté s’est avéré être un défi technique, jusqu’à la publication récente de Ferrer-Font et al.5. Le groupe a décrit un protocole pour isoler et analyser les suspensions unicellulaires de sous-ensembles immunitaires provenant d’intestins murins infectés par Heligmosomoides polygyrus. Sur cette base, nous avons maintenant normalisé un protocole d’isolement et d’analyse cytométrique des cellules lymphoïdes exprimant l’IL-9 de l’intestin infecté par N. brasiliensis. En outre, nous avons établi la cinétique IL-9 à partir de différentes sources cellulaires et emplacements anatomiques tout au long de l’infection.

La caractérisation des populations cellulaires distinctes impliquées dans cette infection est essentielle pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire au parasite et de son interaction avec l’hôte. Ce protocole complet fournit une voie claire pour isoler et analyser les cellules productrices d’IL-9 des organes souhaités aux stades d’intérêt de la maladie, permettant une nette amélioration des connaissances sur le rôle de ces cellules dans l’infection à N. brasiliensis et les infections parasitaires en général.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ici ont été approuvées par le Comité interne pour la manipulation des animaux (CICUAL) de l’Institut de physiologie cellulaire de l’Université nationale autonome du Mexique.

REMARQUE : un organigramme de l’ensemble du protocole est illustré à la figure 1.

1. Logement des souris

  1. Utilisez des groupes de souris femelles ou mâles âgées de 8 à 10 semaines, hébergées dans des animaleries avec une température et une humidité constantes dans des cycles lumière/obscurité de 12 h, avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
    NOTE: Ce protocole utilise une souche de souris rapporteur IL-9 en arrière-plan C57BL/6, comme décrit précédemment4; cependant, d’autres souches rapporteures d’IL-9 pourraient être utilisées 6,7,8, ainsi que la coloration intracellulaire de l’IL-9, avec des résultats variables 9.

2. Infection des souris

  1. Rasez le dos des souris du milieu du corps jusqu’à la base de la queue 1 jour avant l’infection. L’utilisation d’anesthésiques n’est pas indispensable.
  2. Inoculer par voie sous-cutanée à chaque souris 200 larves viables de N. brasiliensis (L3) au troisième stade dans 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)10 dans le bas du dos, comme décrit précédemment2,11, ou injecter 100 μL de PBS seul comme témoin. Sacrifiez les animaux le jour 4, le jour 7 ou le jour 10 après l’infection.

3. Isolement des ganglions lymphatiques pulmonaires, de l’intestin grêle, des médiastins et des mésentériques

  1. Euthanasier la souris par luxation cervicale. Placez la souris sur son dos et vaporisez-la avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision médiane à l’aide de ciseaux et ouvrez la peau pour exposer les zones abdominales et thoraciques.
    REMARQUE : L’isoflurane peut être utilisé comme méthode d’euthanasiealternative 12. Les chambres de dioxyde de carbone ne sont pas recommandées, car le CO2 entraîne des lésions des tissus pulmonaires et une hémorragie13.
  2. Isolement des ganglions lymphatiques médiastinaux et des poumons
    1. Faites une incision au sternum et coupez en forme de « V » pour enlever les côtes et les muscles thoraciques. Une fois que la cavité thoracique est exposée, localisez les ganglions lymphatiques médiastinaux près de l’œsophage, sous le cœur (voir la figure supplémentaire 1).
    2. Extraire les ganglions lymphatiques médiastinaux et les recueillir dans 1 mL de milieu R-10 (tableau 1) dans une plaque de culture de 12 puits. Conserver sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’au traitement.
      NOTE: Les échantillons doivent être protégés de la lumière pour éviter de diminuer le signal fluorescent des souris rapporteures utilisées dans ces expériences.
    3. Extraire les poumons et les recueillir dans 1 mL de milieu R-10 dans une plaque de culture de 12 puits par souris. Conserver sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’au traitement.
  3. Isolement des chaînes ganglionnaires mésentériques et de l’intestin grêle
    1. Exposez la cavité péritonéale et déplacez délicatement l’intestin grêle vers la droite pour exposer la chaîne du ganglion lymphatique mésentérique (MLN) le long du côlon.
    2. À l’aide d’une pince, retirez le MLN, roulez-le doucement sur une serviette en papier et retirez la graisse.
    3. Transférer le MLN à 1 mL de milieu R-10 dans une plaque de culture de 12 puits. Conserver sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’au traitement.
    4. Coupez l’intestin grêle juste en dessous du sphincter pylorique et au-dessus du caecum. Retirez l’intestin lentement à l’aide d’une pince, en enlevant le mésentère attaché et le tissu adipeux.
    5. Placez l’intestin grêle sur une serviette en papier et humidifiez-le généreusement avec du PBS. Retirez les plaques de Peyer de l’intestin grêle avec des ciseaux.
      REMARQUE: Pour maintenir la viabilité, retirez le tissu adipeux restant et gardez l’intestin grêle humide avec PBS pendant tout le processus.
    6. Coupez l’intestin grêle longitudinalement à l’aide de ciseaux et faites glisser doucement la pince sur l’intestin ouvert pour éliminer le contenu fécal et le mucus.
    7. Tenez l’intestin grêle avec une pince et lavez-le dans 5 ml de PBS sur de la glace en l’immergeant soigneusement plusieurs fois. Répétez deux fois.
    8. Couper l’intestin grêle en petits morceaux (environ 5 mm) et les recueillir dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de HBSS14 avec 2 % de FBS (tableau 1). Continuer immédiatement à isoler les cellules intraépithéliales et lamina propria.

4. Préparation de suspensions unicellulaires de l’intestin grêle, des poumons et des ganglions lymphatiques

REMARQUE: Il est extrêmement important de traiter un maximum de six souris par personne lors de la préparation de suspensions unicellulaires de l’intestin grêle, car la viabilité cellulaire diminue considérablement avec des périodes de traitement plus longues. Cette méthode a été adaptée de la souris Heligmosomoides polygyrus infection modèle5.

  1. Préchauffer l’incubateur agitateur, milieu R-20, HBSS et EDTA HBSS-2 mM (tableau 1) à 37 °C.
  2. Préparer 10 mL de milieu de digestion de l’intestin grêle (tableau 1) par échantillon.
  3. Secouez vigoureusement les morceaux d’intestin de l’étape 3.3.8 à la main.
  4. Filtrer chaque échantillon à travers un treillis de nylon (environ 10 cm x 10 cm) sur un entonnoir en verre. Lavez l’échantillon en ajoutant 10 ml d’HBSS préchauffé sur le filet et jetez l’écoulement continu. Répétez une fois de plus.
    REMARQUE: Utilisez un nouveau maillage pour chaque échantillon et réutilisez-le tout au long de la procédure.
  5. Retirer le treillis de l’entonnoir et prélever l’échantillon du treillis dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL d’EDTA HBSS-2 mM chaud (étape 4.1). Incuber pendant 10 min à 37 °C, en agitant à 200 tr/min.
  6. Vortex pendant 10 s à la vitesse maximale (3 200 tr/min) et filtrer l’échantillon avec le treillis sur un entonnoir en verre, en récupérant le flux continu dans un tube conique de 50 mL.
  7. Répétez les étapes 4.5 et 4.6 deux fois, en récupérant le débit dans le même tube conique de 50 mL. Les cellules intraépithéliales sont situées dans cette fraction de 30 mL. Conservez le reste du tissu.
  8. Préparation de suspension unicellulaire à partir de cellules intraépithéliales
    1. Centrifuger les 30 mL de suspension cellulaire, récupérés à l’étape 4.7, à 450 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Jetez le surnageant.
    2. Ajouter 5 mL de PBS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à TA. Jeter le surnageant.
    3. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 3 mL de DNase RPMI à 10 % FBS-20 μg/mL (tableau 1). Gardez sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à la coloration des cellules.
  9. Préparation de suspension unicellulaire à partir de cellules de lamina propria
    1. Lavez le reste du tissu de l’intestin grêle de l’étape 4.7 en versant plus de 10 ml de HBSS chaud à travers le filet au-dessus de l’entonnoir. Répétez le lavage. Prélever le tissu du filet dans un tube conique de 50 ml avec 10 mL de milieu de digestion de l’intestin grêle.
    2. Incuber pendant 30 min à 37 °C, en agitant à 200 tr/min. Vortex à vitesse maximale pendant 10 s toutes les 5 minutes.
    3. Ajouter 10 mL de tampon FACS-EDTA (tableau 1) pour arrêter la réaction de digestion et le placer sur de la glace.
    4. Filtrer chaque échantillon à travers une crépine cellulaire de 100 μm à l’aide d’une pipette sérologique, en récupérant la suspension dans un tube conique de 50 ml placé sur de la glace.
    5. Centrifuger à 600 x g pendant 6 min à 4 °C.
    6. Jetez le surnageant. Laver la pastille de la cellule avec 5 mL de PBS et centrifuger à 600 x g pendant 6 min à 4 °C.
    7. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNase. Gardez sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à la coloration des cellules.
  10. Préparation de suspension unicellulaire à partir de poumon
    REMARQUE: Chaque poumon et intestin grêle doit être traité en parallèle par deux personnes pour éviter des temps de manipulation prolongés, ce qui entraîne une faible viabilité cellulaire.
    1. Préparer 4 mL de milieu de digestion pulmonaire (tableau 1) par échantillon traité.
    2. Retirer le milieu RPMI du puits contenant les poumons à l’étape 3.2.3. Couper le poumon en petits morceaux avec des ciseaux fins.
    3. Transférer les morceaux de poumon dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une spatule. Ajouter 4 mL de milieu de digestion pulmonaire (tableau 1).
    4. Incuber pendant 30 min à 37 °C, en agitant à 250 tr/min. Lorsque vous avez terminé, gardez sur la glace jusqu’à ce que chaque échantillon soit traité.
    5. Filtrer chaque échantillon à travers une crépine cellulaire de 100 μm, positionnée dans un seul puits d’une plaque de culture à 6 puits. Dissocier le tissu avec un piston de seringue.
    6. Récupérer chaque échantillon dans un tube conique de 15 mL et ajouter 4 mL de milieu R-2 (tableau 1). Gardez sur la glace pendant que les autres échantillons sont traités.
    7. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu R-5 (tableau 1).
    8. Pendant la centrifugation, préparer 4 mL de solution à gradient de densité à 27,5 % (tableau 1) par échantillon pour enrichir la fraction cellulaire hématopoïétique15,16. Cette stratégie de séparation unicellulaire est plus efficace, rentable et moins toxique que d’autres milieux à gradient de densitésimilaire 17.
    9. Ajouter 4 mL de solution à gradient de densité à 27,5 % à la suspension cellulaire de 1 mL de l’étape 4.10.7 et agiter vigoureusement.
    10. Ajouter lentement 1 mL de milieu R-5 (tableau 1) sur la suspension mixte pour créer deux phases.
    11. Centrifuger à 1 500 x g pendant 20 min à RT, avec une faible accélération et le frein coupé. Observez l’anneau formé entre les deux phases.
    12. Récupérer l’anneau formé entre les deux phases à l’aide d’une micropipette de 1 mL, et remettre en suspension dans 4 mL de milieu R-2.
    13. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon ACK (tableau 1) et incuber pendant 1 min à TA.
    14. Ajouter 4 mL de milieu R-5 et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu R-10. Garder sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à coloration pour la cytométrie en flux.
  11. Préparation de suspension unicellulaire à partir de ganglions lymphatiques
    1. Placer les ganglions lymphatiques des étapes 3.2.2 ou 3.3.3 entre deux morceaux de maille dans un puits à partir d’une plaque de culture à 6 puits, et dissocier avec un piston de seringue.
    2. Récupérer la suspension cellulaire dans un tube conique de 1,5 mL et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu R-10. Garder sur la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à coloration pour la cytométrie en flux.
      REMARQUE : Si des amas sont visibles, filtrer l’échantillon à travers une crépine cellulaire de 100 μm.

5. Coloration cellulaire pour la cytométrie en flux (Figure 2 et Figure 3)

NOTA : Centrifuger les suspensions de cellules ganglionnaires de l’étape 4.11.3 à 450 x g pendant 5 minutes à 4 °C et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon FACS (tableau 1).

  1. Coloration cellulaire pour l’identification des ILC2 (Figure 3 et Figure supplémentaire 2)
    REMARQUE: Cette procédure de coloration est spécifique pour l’identification des cellules ILC2 exprimant l’IL-9.
    1. Plaque 150 μL par échantillon pulmonaire (environ 1,8 x 10 6 cellules) à l’étape 4.10.14, et 50 μL par échantillon de ganglion lymphatique à l’étape 4.11.3 (environ 0,7 x 10 6 et 2,2 x 10 6 cellules pour les échantillons de ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques, respectivement) dans une plaque de culture conique de fond à 96 puits. Ajouter 100 μL de tampon FACS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Plaque de 100 μL par échantillon d’intestin grêle (environ 2,7 x 10 6 et 0,6 x 106 cellules pour les échantillons intraépithéliaux et de lamina propria, respectivement) des étapes 4.8.3 et 4.9.7 dans une plaque de culture conique de fond à 96 puits. Ajouter 150 μL de tampon FACS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans 50 μL du cocktail d’anticorps biotinylés (tableau 2) dilué dans un tampon FACS. Incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Utilisez un tampon FACS contenant 20 μg/mL de DNase pour les échantillons intraépithéliaux et de lamina propria.
    4. Ajouter 150 μL de tampon FACS. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 μL de tampon FACS. Centrifuger à nouveau et jeter le surnageant.
    6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50 μL du cocktail anticorps/coloration (tableau 2) et incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
    7. Ajouter 150 μL de tampon FACS. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    8. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 μL de tampon FACS. Centrifuger à nouveau et jeter le surnageant. Répétez le lavage (étape 5.1.7) et jetez le surnageant.
    9. Resuspendre la pastille cellulaire dans 300 μL de tampon FACS, et analyser par cytométrie en flux.
    10. Pour les échantillons de l’intestin grêle et des poumons, utilisez la stratégie de déclenchement : lymphocytes, cellules individuelles, cellules vivantes, cellules hématopoïétiques, cellules de la lignée CD90+, cellules ST2+ et cellules IL-9+ (figure 3A, B et figure supplémentaire 2A). Pour les échantillons de ganglions lymphatiques, utilisez la stratégie de déclenchement : cellules vivantes, cellules individuelles, cellules de la lignée CD90+, cellules ST2+ et cellules IL-9+ (figure supplémentaire 2B,C).
  2. Coloration cellulaire pour l’identification des lymphocytes producteurs d’IL-9 (Figure 2 et Figure 3 supplémentaire)
    1. Transfèrent 800 μL par échantillon pulmonaire de l’étape 4.10.14 dans un tube de 1,5 mL (environ 14,6 x 106 cellules). Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    2. Pour les échantillons de ganglions lymphatiques, plaquer 400 μL de la suspension cellulaire de l’étape 4.11.3 (environ 5,6 x 10 6 et 17,5 x 106 cellules pour les échantillons de ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques, respectivement) dans une plaque inférieure conique à 96 puits en deux étapes.
      1. Transvaser d’abord 200 μL, centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
      2. Transférer 200 μL supplémentaires dans le puits correspondant. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    3. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50-400 μL du cocktail anticorps/coloration (tableau 3) et incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Les échantillons de poumons doivent être remis en suspension dans 400 μL, les échantillons de ganglions médiastinaux dans 50 μL et les échantillons de ganglions lymphatiques mésentériques dans 100 μL du cocktail de coloration.
    4. Ajouter 150 μL de tampon FACS aux échantillons de ganglions lymphatiques médiastinaux et 100 μL aux échantillons de ganglions lymphatiques mésentériques. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    5. Laver les échantillons de poumon et de ganglions lymphatiques en remettant les granulés en suspension dans 1 mL et 200 μL de tampon FACS, respectivement. Centrifuger à 450 xg pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant et répétez le lavage.
    6. Resuspendre les échantillons pulmonaires dans 600 μL de tampon FACS, et les analyser par cytométrie en flux. Utilisez la stratégie de déclenchement : lymphocytes, cellules individuelles, cellules vivantes, cellules hématopoïétiques, cellules CD4+TCRβ+ et cellules IL-9+ (Figure 2A).
    7. Resuspendre les échantillons de ganglions lymphatiques dans 300 μL de tampon FACS, et analyser par cytométrie de flux. Utilisez la stratégie de déclenchement : lymphocytes, cellules individuelles, cellules vivantes, cellules CD4+ TCRβ+ et cellules IL-9+ (Figure 2B et Figure supplémentaire 3A).

6. Détermination du nombre absolu de cellules dans les suspensions unicellulaires

  1. Diluer les échantillons des étapes d’isolement 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 et 4.11.3 avec du PBS dans un rapport de 1:20 (10 μL d’échantillon + 190 μL de PBS).
  2. Mélanger 10 μL de chaque échantillon dilué de l’étape 6.1 avec 10 μL de bleu de trypan. Chargez 10 μL dans un hémocytomètre et comptez les cellules vivantes, en tenant compte de chaque dilution.
  3. Obtenir le nombre absolu de cellules en multipliant le pourcentage de la population d’intérêt à partir de cellules vivantes déterminé par cytométrie en flux (cellules à colorant négatif de viabilité) par le nombre total de cellules vivantes dans la suspension unicellulaire après isolement, et en divisant ce nombre par 100 (figure supplémentaire 4, figure supplémentaire 5 et figure supplémentaire 6).
    Nombre absolu = (Pourcentage de la population d’intérêt provenant de cellules vivantes déterminé par cytométrie en flux x Nombre total de cellules vivantes dans la suspension unicellulaire)/100

Résultats

Des souris ont reçu une injection sous-cutanée de 200 larves de N. brasiliensis de stade L3 ou de PBS pour des contrôles fictifs. Le nombre de larves utilisées dans ce protocole a été ajusté afin d’isoler les cellules viables des poumons, du tissu lymphoïde et de l’intestin grêle, contrairement aux rapports précédents où des charges plus élevées de vers ont été utilisées pour détecter des cellules dans les tissus lymphoïdes et les poumons seulement4. Les poumons, le...

Discussion

Une compréhension complète des interactions parasite-hôte intestinal et des réponses immunitaires à l’infection par les helminthes nécessite l’identification et l’analyse des différentes populations cellulaires et molécules effectrices qui sont essentielles pour l’induction du remodelage tissulaire et l’expulsion des vers. Les géohelminthiasies représentent un gros problème dans les pays en développement du monde entier. Cependant, jusqu’à récemment, un protocole permettant d’analyser les popu...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier José Luis Ramos-Balderas pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par la subvention suivante à PLL de CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P et EO-M ont reçu une bourse du CONACYT (736162 et 481437, respectivement). MCM-M a reçu une bourse du CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK bufferHomemade
Attune Nxt cytometerThermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
Collagenase DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorterBD Biosciences
FACS Melody cell sorterBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
FcεRIeBioscience13589885
Fetal bovine serumGibco26140079
FlowJoFlowJoFlow cytometry analysis data software
Gr-1Tonbo305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Homemade
IL-9biolegend514103
NK1.1 Biolegend108704
Nylon mesh ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Phosphate-buffered saline Homemade
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptavidinBiolegend405206
TCR-β Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γδ Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tricine buffer Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability DyeBiolegend423101

Références

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

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