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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

IL-9-exprimierende T- und ILC2-Zellen werden während einer N. brasiliensis-Infektion induziert, ihre Charakterisierung wurde jedoch im infizierten Darm aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und differentiellen Kinetik weitgehend übersehen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung dieser Zellen aus verschiedenen Zielorganen und die Bestätigung ihrer Identität mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Infektionsstadien.

Zusammenfassung

IL-9 ist ein pleiotropes Zytokin, das mit verschiedenen Prozessen assoziiert ist, einschließlich der Antitumorimmunität, der Induktion allergischer Pathologien und der Immunantwort gegen Helmintheninfektionen, wo es eine wichtige Rolle bei der Vertreibung des Parasiten spielt. In einem murinen Modell der Nippostrongylus brasiliensis-Infektion wird IL-9 hauptsächlich von CD4+ T-Lymphozyten und angeborenen lymphatischen Zellen produziert, die in der Lunge, im Dünndarm und in drainierenden Lymphknoten vorkommen. Angesichts der technischen Schwierigkeiten, die mit der intrazellulären Färbung von IL-9 verbunden sind, sowie der Komplexität der Isolierung hämatopoetischer Zellen aus dem Dünndarm nach einer Infektion besteht ein dringender Bedarf an einem umfassenden, aber unkomplizierten Protokoll zur Analyse der Expression von IL-9 in verschiedenen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben in diesem Modell. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Kinetik von IL-9, die von CD4+ T-Zellen und angeborenen lymphatischen Zellen in der Lunge und im Dünndarm, den Hauptorganen, auf die N. brasiliensis abzielt, sowie in den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten während der gesamten Infektion produziert wird. Darüber hinaus gibt es die Anzahl der Larven an, die für die Infektion benötigt werden, abhängig vom Zelltyp und dem interessierenden Organ. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Standardisierung von Assays zu unterstützen, um Zeit und Ressourcen zu sparen, indem es die Möglichkeit bietet, sich auf die spezifischen Zellen, Organe und Krankheitsstadien zu konzentrieren, die im N. brasiliensis-Infektionsmodell von Interesse sind.

Einleitung

Hakenwürmer sind Darmparasiten, die weltweit etwa 700 Millionen Menschen infizieren, meist in tropischen Gebieten in unterentwickelten Ländern. Hochintensive Infektionen mit Ancylostoma duodenale und Necator americanus, den häufigsten Hakenwurmparasiten beim Menschen, verursachen Anämie und Proteinmangel, die zu verzögertem Wachstum und geistiger Entwicklung führen können1. N. americanus und der Nagetierparasit Nippostrongylus brasiliensis induzieren in ihrem Wirt eine prototypische Typ-2-Immunantwort und weisen Ähnlichkeiten in ihrem Lebenszyklus auf. Daher ist die Infektion von Mäusen mit N. brasiliensis das am häufigsten verwendete Modell für menschliche Hakenwurminfektionen. Stadium 3 (L3) infektiöse Larven von N. brasiliensis wandern in den ersten Stunden nach der Infektion von der Haut in die Lunge. Sobald sie in der Lunge sind, werden sie zu L4 und wandern die Luftröhre hinauf, um verschluckt zu werden, den Magen zu passieren und den Darm zu erreichen, um innerhalb von 4-5 Tagen erwachsen zu werden (L5). Im Darm legen L5-Würmer Eier, die mit dem Kot ausgeschieden werden, um den Lebenszyklus des Parasiten neu zu starten2.

Die durch N. brasiliensis induzierte Immunantwort ist gekennzeichnet durch einen Anstieg mehrerer Typ-2-Zytokine, darunter IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 und IL-13, zusammen mit Eosinophilie, Basophilie, Becher- und Mastzellhyperplasie und erhöhter IgG1- und IgE-Produktion. Die meisten Studien, die versuchen, die Immunantworten zu identifizieren und zu definieren, die bei einer Infektion mit N. brasiliensis ausgelöst werden, konzentrieren sich auf die Rolle von IL-4 oder IL-13 in diesem Modell3. Die Identifizierung und Charakterisierung von IL-9-exprimierenden Zellen und die Funktion dieses Zytokins wurden jedoch weitgehend übersehen, bis Licona-Limón et al. die erste Studie veröffentlichten, die eine entscheidende Rolle von IL-9 bei der Immunantwort gegen N. brasiliensis zeigte. Unter Verwendung von Reportermäusen wurden in dieser Studie T-Zellen (meist T-Helfer 9) und angeborene lymphatische Typ-2-Zellen (ILC2s) als die wichtigsten zellulären Untergruppen beschrieben, die IL-9 bei einer Infektion exprimieren4.

Die Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus Helminthen-infizierten Lungen ist machbar und wurde ausführlich beschrieben 3,4. Aufgrund des inhärenten Gewebeumbaus und der Schleimproduktion erwies sich dies im infizierten Darm jedoch als technische Herausforderung, bis zur jüngsten Veröffentlichung von Ferrer-Font et al.5. Die Gruppe skizzierte ein Protokoll zur Isolierung und Analyse von Einzelzellsuspensionen von Immununtergruppen aus Heligmosomoides polygyrus-infizierten murinen Därmen. Darauf aufbauend haben wir nun ein Protokoll zur Isolierung und zytometrischen Analyse von IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm standardisiert. Darüber hinaus haben wir die IL-9-Kinetik aus verschiedenen zellulären Quellen und anatomischen Lokalisationen während der gesamten Infektion festgestellt.

Die Charakterisierung der verschiedenen Zellpopulationen, die an dieser Infektion beteiligt sind, ist entscheidend für ein breiteres Verständnis der Immunantwort auf den Parasiten und seiner Interaktion mit dem Wirt. Dieses umfassende Protokoll bietet einen klaren Weg zur Isolierung und Analyse von IL-9-produzierenden Zellen aus gewünschten Organen in interessierenden Krankheitsstadien, was eine deutliche Verbesserung des Wissens über die Rolle dieser Zellen bei N. brasiliensis-Infektionen und Parasiteninfektionen im Allgemeinen ermöglicht.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden vom Internal Committee for Animal Handling (CICUAL) des Instituts für Zellphysiologie der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko genehmigt.

HINWEIS: Ein Flussdiagramm des gesamten Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Unterbringung von Mäusen

  1. Verwenden Sie 8-10 Wochen alte, weibliche oder männliche Gruppen von Mäusen, die in Tiereinrichtungen mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit in 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht sind und ad libitum Zugang zu Wasser und Futter haben.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen IL-9-Reportermausstamm im C57BL/6-Hintergrund, wie zuvor beschrieben4; Es konnten jedoch auch andere IL-9-Reporterstämme verwendet werden 6,7,8 sowie intrazelluläre IL-9-Färbungen mit unterschiedlichen Ergebnissen9.

2. Infektion von Mäusen

  1. Rasieren Sie den Rücken der Mäuse 1 Tag vor der Infektion von der Körpermitte bis in die Nähe des Schwanzansatzes. Die Verwendung von Anästhetika ist nicht unbedingt erforderlich.
  2. Impfen Sie jede Maus subkutan mit 200 lebensfähigen N. brasiliensis-Larven (L3) im dritten Stadium in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)10 im unteren Rückenbereich, wie zuvor beschrieben2,11, oder injizieren Sie 100 μl PBS allein als Kontrolle. Opfern Sie die Tiere an Tag 4, Tag 7 oder Tag 10 nach der Infektion.

3. Isolierung von Lungen-, Dünndarm-, mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten

  1. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation. Legen Sie die Maus auf den Rücken und besprühen Sie sie mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt und öffnen Sie die Haut, um den Bauch- und Brustbereich freizulegen.
    HINWEIS: Isofluran kann als alternative Euthanasiemethodeverwendet werden 12. Kohlendioxidkammern werden nicht empfohlen, da CO2 zu Schädigungen des Lungengewebes und Blutungen führt13.
  2. Isolierung von mediastinalen Lymphknoten und Lungen
    1. Machen Sie einen Einschnitt am Brustbein und schneiden Sie in eine "V" -Form, um die Rippen und Brustmuskeln zu entfernen. Sobald die Brusthöhle freigelegt ist, lokalisieren Sie die mediastinalen Lymphknoten neben der Speiseröhre unterhalb des Herzens (siehe ergänzende Abbildung 1).
    2. Extrahieren Sie die mediastinalen Lymphknoten und sammeln Sie sie in 1 ml R-10-Medium (Tabelle 1) in einer 12-Well-Kulturplatte. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
      HINWEIS: Die Proben sollten vor Licht geschützt werden, um zu vermeiden, dass das Fluoreszenzsignal der in diesen Experimenten verwendeten Reportermäuse verringert wird.
    3. Extrahieren Sie die Lunge und sammeln Sie sie in 1 ml R-10-Medium in einer 12-Well-Kulturplatte pro Maus. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
  3. Isolierung von mesenterialen Lymphknotenketten und Dünndarm
    1. Legen Sie die Bauchhöhle frei und bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig nach rechts, um die mesenteriale Lymphknotenkette (MLN) entlang des Dickdarms freizulegen.
    2. Entfernen Sie die MLN mit einer Pinzette, rollen Sie sie vorsichtig auf ein Papiertuch und ziehen Sie das Fett ab.
    3. Übertragen Sie die MLN auf 1 ml R-10-Medium in einer 12-Well-Kulturplatte. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
    4. Schneiden Sie den Dünndarm direkt unter dem Pylorusschließmuskel und über dem Blinddarm. Ziehen Sie den Darm langsam mit Hilfe einer Pinzette heraus und entfernen Sie das anhaftende Mesenterium und Fettgewebe.
    5. Legen Sie den Dünndarm auf ein Papiertuch und befeuchten Sie ihn großzügig mit PBS. Entfernen Sie die Peyer-Flecken mit einer Schere aus dem Dünndarm.
      HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit zu erhalten, entfernen Sie das restliche Fettgewebe und halten Sie den Dünndarm während des gesamten Prozesses mit PBS feucht.
    6. Schneiden Sie den Dünndarm mit einer Schere in Längsrichtung ab und schieben Sie die Pinzette vorsichtig über den offenen Darm, um den Kotinhalt und den Schleim zu entfernen.
    7. Halten Sie den Dünndarm mit einer Pinzette fest und waschen Sie ihn in 5 ml PBS auf Eis, indem Sie ihn einige Male vorsichtig untertauchen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
    8. Schneiden Sie den Dünndarm in kurze Stücke (ca. 5 mm) und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml HBSS14 mit 2% FBS (Tabelle 1). Isolieren Sie sofort intraepitheliale und Lamina propria-Zellen.

4. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Dünndarm, Lunge und Lymphknoten

HINWEIS: Bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus dem Dünndarm ist es äußerst wichtig, maximal sechs Mäuse pro Person zu verarbeiten, da die Zelllebensfähigkeit mit längeren Verarbeitungszeiten signifikant abnimmt. Diese Methode wurde aus dem Heligmosomoides polygyrus infection mouse model5 adaptiert.

  1. Der Schüttelinkubator, R-20-Medium, HBSS und HBSS-2 mM EDTA (Tabelle 1) werden bei 37 °C vorgewärmt.
  2. Bereiten Sie 10 ml Dünndarmverdauungsmedium (Tabelle 1) pro Probe vor.
  3. Schütteln Sie die Darmstücke aus Schritt 3.3.8 kräftig von Hand.
  4. Filtern Sie jede Probe durch ein Nylonnetz (ca. 10 cm x 10 cm) über einen Glastrichter. Waschen Sie die Probe, indem Sie 10 ml vorgewärmtes HBSS über das Netz geben und den Durchfluss verwerfen. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
    HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe ein neues Netz und verwenden Sie es während des gesamten Verfahrens wieder.
  5. Entfernen Sie das Netz aus dem Trichter und entnehmen Sie die Probe aus dem Netz in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml warmem HBSS-2 mM EDTA (Schritt 4.1). 10 min bei 37 °C inkubieren, bei 200 U/min schütteln.
  6. Wirbeln Sie 10 s lang bei maximaler Geschwindigkeit (3.200 U/min) und filtrieren Sie die Probe mit dem Netz über einen Glastrichter, wobei der Durchfluss in einem konischen 50-ml-Röhrchen zurückgewonnen wird.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 zweimal, wobei der Durchfluss im selben konischen 50-ml-Röhrchen wiederhergestellt wird. Die intraepithelialen Zellen befinden sich in dieser 30-ml-Fraktion. Bewahren Sie das restliche Gewebe auf.
  8. Einzelzell-Suspensionspräparat aus intraepithelialen Zellen
    1. Zentrifugieren Sie die 30 ml Zellsuspension, die in Schritt 4.7 gewonnen wurde, bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Verwerfen Sie den Überstand.
    2. 5 ml PBS zugeben und bei 450 x g 5 min bei RT zentrifugieren.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase (Tabelle 1). Auf Eis aufbewahren, vor Licht geschützt, bis sich die Zellen verfärben.
  9. Einzellige Suspensionszubereitung aus Lamina-propria-Zellen
    1. Waschen Sie das restliche Dünndarmgewebe aus Schritt 4.7, indem Sie über 10 ml warmes HBSS durch das Netz über den Trichter gießen. Wiederholen Sie den Waschvorgang. Sammeln Sie das Gewebe aus dem Netz in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Dünndarm-Verdauungsmedium.
    2. 30 min bei 37 °C inkubieren, bei 200 U/min schütteln. Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit für 10 s alle 5 Minuten.
    3. Fügen Sie 10 ml FACS-EDTA-Puffer (Tabelle 1) hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen, und legen Sie ihn auf Eis.
    4. Jede Probe wird mit einer serologischen Pipette durch ein 100-μm-Zellsieb filtriert, wobei die Suspension in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis zurückgewonnen wird.
    5. Zentrifugieren bei 600 x g für 6 min bei 4 °C.
    6. Verwerfen Sie den Überstand. Das Zellpellet wird mit 5 ml PBS gewaschen und bei 600 x g 6 min bei 4 °C zentrifugiert.
    7. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase. Auf Eis aufbewahren, vor Licht geschützt, bis sich die Zellen verfärben.
  10. Einzelzell-Suspensionspräparat aus der Lunge
    HINWEIS: Jede Lunge und jeder Dünndarm sollten parallel von zwei Personen bearbeitet werden, um längere Bearbeitungszeiten zu vermeiden, die zu einer geringen Zelllebensfähigkeit führen.
    1. Bereiten Sie 4 ml Lungenverdauungsmedium (Tabelle 1) pro verarbeiteter Probe vor.
    2. Entfernen Sie das RPMI-Medium aus der Vertiefung, die die Lunge aus Schritt 3.2.3 enthält. Schneiden Sie die Lunge mit einer feinen Schere in kleine Stücke.
    3. Übertragen Sie die Lungenstücke mit einem Spatel in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 4 ml Lungenverdauungsmedium hinzu (Tabelle 1).
    4. 30 min bei 37 °C inkubieren, bei 250 U/min schütteln. Wenn Sie fertig sind, halten Sie es auf Eis, bis jede Probe verarbeitet ist.
    5. Filtern Sie jede Probe durch ein 100-μm-Zellsieb, das in einer einzigen Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte positioniert ist. Dissoziieren Sie das Gewebe mit einem Spritzenkolben.
    6. Jede Probe wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen entnommen und 4 ml R-2-Medium hinzugefügt (Tabelle 1). Bleiben Sie auf Eis, während die anderen Proben verarbeitet werden.
    7. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1 ml R-5-Medium resuspendiert (Tabelle 1).
    8. Während des Zentrifugierens werden 4 ml 27,5%ige Dichtegradientenlösung (Tabelle 1) pro Probe hergestellt, um die hämatopoetische Zellfraktion15,16 anzureichern. Diese Strategie zur Einzelzelltrennung ist im Vergleich zu anderen ähnlichen Dichtegradientenmedien effizienter, kostengünstiger und weniger toxisch17.
    9. Zu der 1 ml Zellsuspension aus Schritt 4.10.7 werden 4 ml 27,5%ige Dichtegradientenlösung gegeben und kräftig geschüttelt.
    10. Fügen Sie langsam 1 ml R-5-Medium (Tabelle 1) auf die gemischte Suspension hinzu, um zwei Phasen zu erzeugen.
    11. Zentrifugieren bei 1.500 x g für 20 min bei RT, mit geringer Beschleunigung und ausgeschalteter Bremse. Beobachten Sie den Ring, der sich zwischen den beiden Phasen gebildet hat.
    12. Der zwischen den beiden Phasen gebildete Ring wird mit einer 1-ml-Mikropipette zurückgewonnen und in 4 ml R-2-Medium resuspendiert.
    13. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml ACK-Puffer (Tabelle 1) und inkubieren Sie es 1 Minute lang bei RT.
    14. 4 ml R-5-Medium zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml R-10-Medium. Bis zur Färbung für die Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
  11. Einzelzell-Suspensionspräparat aus Lymphknoten
    1. Platzieren Sie die Lymphknoten aus den Schritten 3.2.2 oder 3.3.3 zwischen zwei Netzstücken in einer Vertiefung aus einer 6-Well-Kulturplatte und dissoziieren Sie sie mit einem Spritzenkolben.
    2. Die Zellsuspension wird in einem konischen 1,5-ml-Röhrchen gewonnen und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
    3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml R-10-Medium. Bis zur Färbung für die Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
      HINWEIS: Wenn Klumpen sichtbar sind, filtern Sie die Probe durch ein 100-μm-Zellsieb.

5. Zellfärbung für die Durchflusszytometrie (Abbildung 2 und Abbildung 3)

ANMERKUNG: Zentrifugieren Sie die Lymphknotenzellsuspensionen aus Schritt 4.11.3 bei 450 x g für 5 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl FACS-Puffer (Tabelle 1).

  1. Zellfärbung zur Identifizierung von ILC2s (Abbildung 3 und ergänzende Abbildung 2)
    HINWEIS: Dieses Färbeverfahren ist spezifisch für die Identifizierung von IL-9-exprimierenden ILC2-Zellen.
    1. Platte 150 μl pro Lungenprobe (ca. 1,8 x 10 6 Zellen) aus Schritt 4.10.14 und 50 μl pro Lymphknotenprobe aus Schritt 4.11.3 (ca. 0,7 x 10 6 bzw. 2,2 x 106 Zellen für mediastinale bzw. mesenteriale Lymphknotenproben) in einer konischen 96-Well-Bodenkulturplatte. 100 μl FACS-Puffer zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    2. Platte 100 μl pro Dünndarmprobe (ca. 2,7 x 10 6 bzw. 0,6 x 106 Zellen für intraepitheliale bzw. Lamina propria-Proben) aus den Schritten 4.8.3 und 4.9.7 in einer konischen 96-Well-Bodenkulturplatte. 150 μl FACS-Puffer zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    3. Der Überstand wird verworfen und jedes Zellpellet in 50 μl des biotinylierten Antikörpercocktails (Tabelle 2), verdünnt in FACS-Puffer, resuspendiert. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie FACS-Puffer mit 20 μg/ml DNase für intraepitheliale und Lamina-propria-Proben.
    4. Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.
    5. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    6. Das Zellpellet wird in 50 μl des Antikörper-Färbungs-Cocktails (Tabelle 2) resuspendiert und 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert.
    7. Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.
    8. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang (Schritt 5.1.7) und entsorgen Sie den Überstand.
    9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl FACS-Puffer und analysieren Sie es mittels Durchflusszytometrie.
    10. Verwenden Sie für die Dünndarm- und Lungenproben die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, hämatopoetische Zellen, CD90+Lineage-Zellen, ST2+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 3A, B und ergänzende Abbildung 2A). Verwenden Sie für die Lymphknotenproben die Gating-Strategie: lebende Zellen, Einzelzellen, CD90+-Linienzellen, ST2+-Zellen und IL-9+-Zellen (ergänzende Abbildung 2B, C).
  2. Zellfärbung zur Identifizierung von IL-9-produzierenden Lymphozyten (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3)
    1. Transfer von 800 μl pro Lungenprobe aus Schritt 4.10.14 in ein 1,5-ml-Röhrchen (ca. 14,6 x 106 Zellen). Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
    2. Für Lymphknotenproben werden 400 μl der Zellsuspension aus Schritt 4.11.3 (ca. 5,6 x 10 6 bzw. 17,5 x 106 Zellen für mediastinale bzw. mesenteriale Lymphknotenproben) in zwei Schritten in eine konische Bodenplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.
      1. Zuerst 200 μl umfüllen, bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
      2. Weitere 200 μl in die entsprechende Vertiefung geben. Bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    3. Das Zellpellet wird in 50-400 μl des Antikörper-Färbe-Cocktails resuspendiert (Tabelle 3) und 30 Minuten bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert.
      HINWEIS: Lungenproben sollten in 400 μl, mediastinale Lymphknotenproben in 50 μl und mesenteriale Lymphknotenproben in 100 μl des Färbecocktails resuspendiert werden.
    4. Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer zu den mediastinalen Lymphknotenproben und 100 μl zu den mesenterialen Lymphknotenproben hinzu. Bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    5. Waschen Sie die Lungen- und Lymphknotenproben, indem Sie die Pellets in 1 ml bzw. 200 μl FACS-Puffer resuspendieren. Zentrifugieren bei 450 xg für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang.
    6. Resuspendieren Sie die Lungenproben in 600 μl FACS-Puffer und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, hämatopoetische Zellen, CD4+TCRβ+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 2A).
    7. Resuspendieren Sie die Lymphknotenproben in 300 μl FACS-Puffer und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, CD4+ TCRβ+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 2B und ergänzende Abbildung 3A).

6. Bestimmung der absoluten Anzahl von Zellen in Einzelzellsuspensionen

  1. Die Proben aus den Isolierschritten 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 und 4.11.3 werden mit PBS im Verhältnis 1:20 verdünnt (10 μl Probe + 190 μl PBS).
  2. Mischen Sie 10 μl jeder verdünnten Probe aus Schritt 6.1 mit 10 μl Trypanblau. Laden Sie 10 μl in ein Hämozytometer und zählen Sie die lebenden Zellen unter Berücksichtigung jeder Verdünnung.
  3. Man erhält die absolute Anzahl der Zellen, indem man den Prozentsatz der interessierenden Population lebender Zellen, der durch Durchflusszytometrie bestimmt wird (Viabilitätsfarbstoff-negative Zellen), mit der Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Einzelzellsuspension nach der Isolierung multipliziert und diese Zahl durch 100 dividiert (Ergänzende Abbildung 4, Ergänzende Abbildung 5 und Ergänzende Abbildung 6).
    Absolute Zahl = (Prozentsatz der interessierenden Population aus lebenden Zellen, bestimmt durch Durchflusszytometrie x Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Einzelzellsuspension)/100

Ergebnisse

Mäusen wurden subkutan 200 L3-Larven im Stadium N. brasiliensis oder PBS zur Scheinkontrolle injiziert. Die Anzahl der Larven, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurde angepasst, um lebensfähige Zellen aus der Lunge, dem lymphatischen Gewebe und dem Dünndarm zu isolieren, im Gegensatz zu früheren Berichten, in denen nur höhere Würmer zum Nachweis von Zellen in lymphatischen Geweben und Lungen verwendet wurden4. Lunge, mediastinale Lymphknoten, mesenteriale Lymphknoten und der...

Diskussion

Ein vollständiges Verständnis der intestinalen Parasiten-Wirt-Interaktionen und Immunantworten auf Helmintheninfektionen erfordert die Identifizierung und Analyse der verschiedenen Zellpopulationen und Effektormoleküle, die für die Induktion des Gewebeumbaus und der Wurmvertreibung entscheidend sind. Bodenübertragene Helmintheninfektionen stellen in Entwicklungsländern auf der ganzen Welt ein großes Problem dar. Bis vor kurzem war jedoch kein Protokoll verfügbar, das die Analyse seltener Zellpopulationen im Dünn...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken José Luis Ramos-Balderas für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den folgenden Zuschuss an PLL von CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027) unterstützt. OM-P und EO-M erhielten ein Stipendium von CONACYT (736162 bzw. 481437). MCM-M erhielt ein Stipendium von CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK bufferHomemade
Attune Nxt cytometerThermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
Collagenase DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorterBD Biosciences
FACS Melody cell sorterBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
FcεRIeBioscience13589885
Fetal bovine serumGibco26140079
FlowJoFlowJoFlow cytometry analysis data software
Gr-1Tonbo305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Homemade
IL-9biolegend514103
NK1.1 Biolegend108704
Nylon mesh ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Phosphate-buffered saline Homemade
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptavidinBiolegend405206
TCR-β Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γδ Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tricine buffer Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability DyeBiolegend423101

Referenzen

  1. Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
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