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요약

IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.

초록

IL-9는 항 종양 면역, 알레르기 병리의 유도 및 기생충 감염에 대한 면역 반응을 포함한 다양한 과정과 관련된 다면발현 사이토 카인으로 기생충 퇴학에 중요한 역할을합니다. Nippostrongylus brasiliensis 감염의 쥐 모델에서 IL-9는 주로 폐, 소장 및 배액 림프절에서 발견되는 CD4+ T 림프구 및 선천성 림프 세포에 의해 생성됩니다. IL-9의 세포내 염색과 관련된 기술적 어려움과 감염 시 소장에서 조혈 세포를 분리하는 복잡성을 감안할 때, 이 모델의 다양한 림프 및 비림프 조직에서 IL-9의 발현을 분석하기 위한 포괄적이지만 간단한 프로토콜이 절실히 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 감염 전반에 걸쳐 종격동 및 장간막 림프절뿐만 아니라 N. brasiliensis가 표적으로 하는 주요 기관인 폐 및 소장에서 CD4+ T 세포와 선천성 림프 세포에 의해 생성되는 IL-9의 동역학을 설명합니다. 또한 관심 있는 세포 유형과 기관에 따라 감염에 필요한 유충의 수를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 모델에서 관심 있는 특정 세포, 기관 및 질병 단계에 집중할 수 있는 기회를 제공함으로써 시간과 자원을 절약하기 위한 분석의 표준화를 지원하는 것을 목표로 합니다.

서문

십이지장충은 전 세계적으로 약 7억 명의 사람들을 감염시키는 장내 기생충으로, 주로 저개발국의 열대 지역에서 발생합니다. 인간에게 가장 흔한 십이지장충 기생충인 십이지장 충 및 Necator americanus에 의한 고강도 감염은 빈혈과 단백질 결핍을 유발하여 성장과 정신 발달을 지연시킬 수 있습니다1. N. americanus 와 설치류 기생충 Nippostrongylus brasiliensis 는 숙주에서 원형의 제2형 면역 반응을 유도하고 수명 주기에서 유사성을 공유합니다. 따라서 N. brasiliensis 에 의한 생쥐의 감염은 인간 십이지장충 감염에 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다. 3 단계 (L3) N. brasiliensis 감염성 유충은 감염 후 처음 몇 시간 동안 피부에서 폐로 이동합니다. 일단 폐에 들어가면 L4가 되어 기관을 따라 이동하여 삼키고 위를 통과하여 장에 도달하여 4-5일 이내에 성인(L5)이 됩니다. 장에서 L5 벌레는 기생충 수명 주기2를 다시 시작하기 위해 대변으로 배설되는 알을 낳습니다.

N. brasiliensis에 의해 유도된 면역 반응은 호산구 증가증, 호염구증, 잔 및 비만 세포 증식증과 함께 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13을 포함한 여러 제2형 사이토카인의 증가, IgG1 및 IgE 생산 증가를 특징으로 합니다. N. brasiliensis 감염에 대한 면역 반응을 확인하고 정의하려는 대부분의 연구는 이 모델3에서 IL-4 또는 IL-13의 역할에 중점을 두고 있습니다. 그러나 IL-9 발현 세포의 식별 및 특성화와 이 사이토카인의 기능은 Licona-Limón et al. N. brasiliensis에 대한 면역 반응에서 IL-9의 중요한 역할을 입증하는 첫 번째 연구를 발표했습니다. 이 연구는 리포터 마우스를 사용하여 T 세포(대부분 T 헬퍼 9)와 제2형 선천성 림프 세포(ILC2s)를 감염 시 IL-9를 발현하는 주요 세포 하위 집합으로 설명했습니다4.

기생충에 감염된 폐에서 면역 세포의 분리 및 특성화가 가능하며 광범위하게 보고되었습니다 3,4. 그러나 내재된 조직 리모델링 및 점액 생성으로 인해 감염된 장에서 그렇게 하는 것은 Ferrer-Font et al.5의 최근 발표까지 기술적인 도전으로 판명되었습니다. 이 그룹은 Heligmosomoides polygyrus에 감염된 쥐 내장에서 면역 하위 집합의 단일 세포 현탁액을 분리하고 분석하는 프로토콜을 설명했습니다. 이를 기반으로 우리는 이제 N. brasiliensis에 감염된 장에서 IL-9 발현 림프 세포의 분리 및 세포 분석을 위한 프로토콜을 표준화했습니다. 또한, 우리는 감염 전반에 걸쳐 다양한 세포 소스와 해부학적 위치에서 IL-9 동역학을 확립했습니다.

이 감염과 관련된 뚜렷한 세포 집단을 특성화하는 것은 기생충에 대한 면역 반응과 숙주와의 상호 작용에 대한 더 넓은 이해에 매우 중요합니다. 이 포괄적인 프로토콜은 관심 질병 단계에서 원하는 기관에서 IL-9 생성 세포를 분리하고 분석하는 명확한 경로를 제공하여 N. brasiliensis 감염 및 일반적으로 기생충 감염에서 이러한 세포의 역할에 대한 지식을 급격히 향상시킬 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 동물 실험은 멕시코 국립 자치 대학교 세포 생리학 연구소의 내부 동물 취급위원회 (CICUAL)의 승인을 받았습니다.

참고: 전체 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 생쥐의 주거

  1. 8-10주령의 암컷 또는 수컷 생쥐를 12시간 명암 주기로 일정한 온도와 습도를 가진 동물 시설에 수용하고 물과 음식에 임의 로 접근할 수 있습니다.
    참고: 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 C57BL/6 배경에서 IL-9 리포터 마우스 균주를 사용합니다4; 그러나, 다른 IL-9 리포터 균주(reporter strain 6,7,8)와 세포내 IL-9 염색(intracellular IL-9 staining)을 사용할 수 있으며, 다양한 결과가 나온다9.

2. 생쥐 감염

  1. 감염 1 일 전에 몸의 중앙에서 꼬리 기저부 근처까지 생쥐의 등을 면도하십시오. 마취제의 사용은 필수적이지 않습니다.
  2. 앞서설명한 바와 같이 허리에 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)10에 200마리의 생존 가능한 3기 N. brasiliensis 유충(L3)을 각 마우스에 피하 접종하거나, 대조군으로 PBS 단독으로 100μL를 주사합니다. 감염 후 4일째, 7일째 또는 10일째에 동물을 희생합니다.

3. 폐, 소장, 종격동 및 장간막 림프절의 분리

  1. 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 등에 대고 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위로 정중선을 절개하고 피부를 열어 복부와 흉부 부위를 노출시킵니다.
    참고: 이소플루란은 대체 안락사 방법으로 사용할 수 있습니다12. 이산화탄소 챔버는CO2 가 폐 조직 손상과 출혈을 유발하므로 권장하지 않는다13.
  2. 종격동 림프절과 폐의 분리
    1. 흉골을 절개하고 "V"자 모양으로 잘라 갈비뼈와 흉부 근육을 제거합니다. 흉강이 노출되면 심장 아래 식도 옆에 있는 종격동 림프절을 찾습니다( 보충 그림 1 참조).
    2. 종격동 림프절을 추출하여 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지(표 1) 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 샘플은 이 실험에 사용된 리포터 마우스의 형광 신호가 감소하지 않도록 빛으로부터 보호되어야 합니다.
    3. 폐를 추출하고 마우스당 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
  3. 장간막 림프절 사슬과 소장의 분리
    1. 복강을 노출시키고 소장을 오른쪽으로 조심스럽게 움직여 결장을 따라 장간막 림프절(MLN) 사슬을 노출시킵니다.
    2. 집게를 사용하여 MLN을 제거하고 종이 타월로 부드럽게 굴려서 지방을 빼냅니다.
    3. MLN을 12-웰 배양 플레이트에서 1mL의 R-10 배지로 옮깁니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
    4. 유문 괄약근 바로 아래와 맹장 위의 소장을 자릅니다. 집게를 사용하여 장을 천천히 당겨 부착 된 장간막과 지방 조직을 제거하십시오.
    5. 소장을 종이 타월에 놓고 PBS로 충분히 적시십시오. 가위로 소장에서 Peyer의 패치를 제거하십시오.
      알림: 생존력을 유지하려면 남은 지방 조직을 제거하고 전체 과정에서 PBS로 소장을 촉촉하게 유지하십시오.
    6. 가위를 사용하여 소장을 세로로 자르고 집게를 열린 장 위로 부드럽게 밀어 배설물과 점액을 제거합니다.
    7. 겸자로 소장을 잡고 얼음 위에 PBS 5mL로 몇 번 조심스럽게 담그고 씻습니다. 두 번 반복하십시오.
    8. 소장을 짧은 조각(약 5mm)으로 자르고 2% FBS가 포함된 10mL의 HBSS14 가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다(표 1). 즉시 상피내 및 고유판 세포를 계속 분리하십시오.

4. 소장, 폐 및 림프절에서 단세포 현탁액의 제조

참고: 소장에서 단세포 현탁액을 준비할 때 1인당 최대 6마리의 마우스를 처리하는 것이 매우 중요한데, 이는 처리 기간이 길어질수록 세포 생존력이 크게 감소하기 때문입니다. 이 방법은 Heligmosomoides polygyrus 감염 마우스 모델5에서 채택되었습니다.

  1. 진탕 배양기, R-20 배지, HBSS, 및 HBSS-2 mM EDTA(표 1)를 37°C에서 예열하였다.
  2. 시료당 10mL의 소장 소화 배지(표 1)를 준비합니다.
  3. 3.3.8 단계의 내장 조각을 손으로 세게 흔듭니다.
  4. 유리 깔때기 위의 나일론 메쉬(약 10cm x 10cm)를 통해 각 샘플을 여과합니다. 메쉬 위에 예열된 HBSS 10mL를 추가하여 샘플을 세척하고 플로우 스루를 버립니다. 한 번 더 반복하십시오.
    알림: 각 샘플에 새 메쉬를 사용하고 절차 전반에 걸쳐 재사용하십시오.
  5. 깔때기에서 메쉬를 제거하고 50mL의 따뜻한 HBSS-10mM EDTA가 있는 2mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 샘플을 수집합니다(4.1단계). 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다.
  6. 최대 속도(3,200rpm)로 10초 동안 소용돌이치고 유리 깔때기 위에 메쉬로 샘플을 여과하여 50mL 원뿔형 튜브에서 유동을 회수합니다.
  7. 4.5단계와 4.6단계를 두 번 반복하여 동일한 50mL 원뿔형 튜브에서 플로우 스루를 회수합니다. 상피내 세포는 이 30mL 분획에 있습니다. 나머지 조직을 저장하십시오.
  8. 상피내 세포로부터의 단세포 현탁액 제제
    1. 4.7단계에서 회수한 30mL의 세포 현탁액을 실온(RT)에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
    2. 5mL의 PBS를 첨가하고 RT에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.
    3. 세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 3mL에 재현탁합니다(표 1). 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
  9. 고유판 세포로부터의 단일 세포 현탁액 제조
    1. 깔때기 위의 메쉬를 통해 따뜻한 HBSS 10mL 이상을 부어 4.7단계에서 남은 소장 조직을 세척합니다. 세탁을 반복하십시오. 10mL의 소장 소화 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 조직을 수집합니다.
    2. 37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다. 5분마다 최대 속도로 10초 동안 소용돌이칩니다.
    3. 10mL의 FACS-EDTA 완충액(표 1)을 첨가하여 소화 반응을 중지하고 얼음 위에 올려 놓는다.
    4. 혈청학적 피펫을 사용하여 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과하고 얼음 위에 놓인 50mL 원뿔형 튜브에서 현탁액을 회수합니다.
    5. 4 °C에서 600 x g 로 6분 동안 원심분리합니다.
    6. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 5 mL의 PBS로 세척하고, 4°C에서 6분 동안 600 x g 에서 원심분리하였다.
    7. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 1mL에 재현탁합니다. 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
  10. 폐에서 단일 세포 현탁액 준비
    참고: 각 폐와 소장은 세포 생존율이 낮은 취급 시간이 연장되는 것을 방지하기 위해 두 사람이 병렬로 처리해야 합니다.
    1. 처리된 샘플당 4mL의 폐 소화 배지(표 1)를 준비합니다.
    2. 단계 3.2.3에서 폐를 함유하는 웰로부터 RPMI 배지를 제거한다. 가는 가위로 폐를 작은 조각으로 자릅니다.
    3. 주걱을 사용하여 폐 조각을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 4mL의 폐 소화 배지를 추가합니다(표 1).
    4. 37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 250rpm에서 진탕합니다. 완료되면 각 샘플이 처리될 때까지 얼음에 보관하십시오.
    5. 6웰 배양 플레이트의 단일 웰에 위치한 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과합니다. 주사기 플런저로 조직을 분리하십시오.
    6. 각 샘플을 15mL 원뿔형 튜브에서 회수하고 4mL의 R-2 배지를 추가합니다(표 1). 다른 샘플이 처리되는 동안 얼음 위에 보관하십시오.
    7. 4 °C에서 5분 동안 600 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-5 배지에 재현탁합니다(표 1).
    8. 원심분리하는 동안, 조혈 세포 분획15,16을 농축하기 위해 시료 당 4 mL의 27.5% 밀도-구배 용액(표 1)을 준비한다. 단세포 분리를 위한 이러한 전략은 다른 유사한 밀도 구배 배지에 비해 더 효율적이고 비용 효율적이며 독성이 적다(17).
    9. 4.10.7 단계의 세포 현탁액 1 mL에 27.5 % 밀도 구배 용액 4 mL를 넣고 세게 흔든다.
    10. 혼합 현탁액 위에 R-5 배지 (표 1)를 천천히 추가하여 두 개의 상을 만듭니다.
    11. RT에서 1,500 x g 에서 20분 동안 원심분리기를 사용하고 가속을 낮추고 브레이크를 끕니다. 두 위상 사이에 형성된 고리를 관찰하십시오.
    12. 1mL 마이크로피펫으로 두 상 사이에 형성된 링을 회수하고 4mL의 R-2 배지에 재현탁합니다.
    13. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 1mL의 ACK 완충액에 재현탁하고(표 1), RT에서 1분 동안 인큐베이션합니다.
    14. 4 mL의 R-5 배지를 첨가하고 4 °C에서 5 분 동안 450 x g 에서 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-10 배지에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
  11. 림프절에서 단일 세포 현탁액 준비
    1. 3.2.2 또는 3.3.3 단계의 림프절을 6-웰 배양 플레이트의 웰에 있는 두 개의 메쉬 조각 사이에 놓고 주사기 플런저로 해리합니다.
    2. 세포 현탁액을 1.5 mL 원뿔형 튜브에서 회수하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하였다.
    3. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 R-10 배지 1mL에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
      알림: 덩어리가 보이면 s를 걸러냅니다.amp100μm 셀 스트레이너를 통해 s.

5. 유세포 분석을 위한 세포 염색(그림 2 및 그림 3)

참고: 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 단계 4.11.3의 림프절 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠릿을 500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다(표 1).

  1. ILC2s 식별을 위한 세포 염색(그림 3 및 보충 그림 2)
    참고: 이 염색 절차는 IL-9 발현 ILC2 세포의 식별에 특이적입니다.
    1. 플레이트 4.10.14 단계로부터의 폐 샘플 당 150 μL (대략 1.8 x 10 6 세포) 및 단계 4.11.3으로부터의 림프절 샘플 당 50 μL (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 0.7 x 10 6 및 2.2 x 106 세포) 96 웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서. 100 μL의 FACS 완충액을 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 원심분리한다.
    2. 96웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서 4.8.3 및 4.9.7 단계로부터의 소장 샘플(상피내 및 고유판 샘플의 경우 각각 약 2.7 x 10 6 및0.6 x 106 세포)당 100 μL를 플레이트에 넣는다. 150 μL의 FACS 완충액을 첨가하고 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.
    3. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 희석된 비오티닐화 항체 칵테일(표 2)의 50 μL에 각각의 세포 펠렛을 재현탁시켰다. 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양한다.
      참고: 상피내 및 고유판에 대해 20μg/mL DNase와 함께 FACS 버퍼를 사용하십시오.amp르.
    4. 150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.
    5. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    6. 세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50μL에 재현탁하고(표 2), 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
    7. 150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.
    8. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척 (5.1.7 단계)을 반복하고 상청액을 버립니다.
    9. 300 μL의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁하고, 유세포 분석에 의해 분석한다.
    10. 소장 및 폐 샘플의 경우 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD90+계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 3A, B 및 보충 그림 2A). 림프절 샘플의 경우 살아있는 세포, 단일 세포, CD90+ 계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(보충 그림 2B, C).
  2. IL-9 생성 림프구의 동정을 위한 세포 염색(그림 2 및 보충 그림 3)
    1. 폐 샘플당 800μL를 4.10.14단계에서 1.5mL 튜브(약 14.6 x 106 세포)로 옮깁니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
    2. 림프절 샘플의 경우, 400 μL의 세포 현탁액을 단계 4.11.3 (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 5.6 x 106 및 17.5 x 10 6 세포)을 96-웰 원뿔형 바닥 플레이트에 2단계로 플레이트한다.
      1. 먼저 200 μL를 옮기고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 버린다.
      2. 또 다른 200 μL를 해당 웰로 옮깁니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.
    3. 세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50-400μL에 재현탁하고(표 3), 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 폐 샘플은 400μL, 종격동 림프절 샘플은 50μL, 장간막 림프절 샘플은 염색 칵테일 100μL에 재현탁해야 합니다.
    4. 150 μL의 FACS 완충액을 종격동 림프절 샘플에 추가하고 100 μL의 장간막 림프절 샘플을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.
    5. 펠릿을 각각 1 mL 및 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁하여 폐 및 림프절 샘플을 세척한다. 4 °C에서 5분 동안 450 xg 로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세척을 반복하십시오.
    6. 폐 샘플을 600μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD4+TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2A).
    7. 림프절 샘플을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, CD4+ TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2B 및 보충 그림 3A).

6. 단세포 현탁액에서 세포의 절대 수 측정

  1. 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 및 4.11.3 분리 단계의 샘플을 PBS로 1:20 비율로 희석합니다(샘플 10μL + PBS 190μL).
  2. 6.1단계에서 희석된 각 샘플 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합합니다. 혈구계에 10 μL를 넣고 각 희석을 고려하여 살아있는 세포를 계수합니다.
  3. 유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포(생존율 염료 음성 세포)로부터 관심 대상 집단의 백분율에 분리 후 단세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수를 곱하고, 이 수를 100으로 나누어 세포의 절대 개수를 구한다(보충도 4, 보충도 5 및 보충도 6).
    절대 수 = (유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포에서 관심 모집단의 백분율 x 단일 세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수)/100

결과

마우스에 200 L3 단계 N. brasiliensis 유충 또는 가짜 대조군을 위한 PBS를 피하 주사했습니다. 이 프로토콜에 사용된 유충의 수는 림프 조직과 폐의 세포를 검출하는 데 더 많은 양의 벌레가 사용된 이전 보고서와 달리 폐, 림프 조직 및 소장에서 생존 가능한 세포를 분리하기 위해 조정되었습니다. 폐, 종격동 림프절, 장간막 림프절 및 소장을 감염 후 0, 4, 7 및 10일에 채취하여 ?...

토론

장내 기생충-숙주 상호 작용 및 기생충 감염에 대한 면역 반응에 대한 완전한 이해는 조직 리모델링 및 벌레 퇴학 유도에 핵심적인 다양한 세포 집단 및 이펙터 분자의 식별 및 분석이 필요합니다. 토양 매개 기생충 감염은 전 세계 개발 도상국에서 큰 문제입니다. 그러나 최근까지 이 감염의 영향을 받는 주요 기관인 소장에 존재하는 희귀 세포 집단을 분석할 수 있는 프로토콜은 사용할 수 없었?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 José Luis Ramos-Balderas의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 CONACYT(FORDECYT-PRONACE-303027)에서 PLL에 대한 다음 보조금으로 지원되었습니다. OM-P와 EO-M은 CONACYT(각각 736162 및 481437)로부터 펠로우십을 받았습니다. MCM-M은 CONACYT(Estancias Posdoctorales por México 2022(3))로부터 펠로우십을 받았습니다.

자료

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CD90.2Biolegend105314
Collagenase DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorterBD Biosciences
FACS Melody cell sorterBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
FcεRIeBioscience13589885
Fetal bovine serumGibco26140079
FlowJoFlowJoFlow cytometry analysis data software
Gr-1Tonbo305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Homemade
IL-9biolegend514103
NK1.1 Biolegend108704
Nylon mesh ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Phosphate-buffered saline Homemade
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptavidinBiolegend405206
TCR-β Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γδ Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tricine buffer Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability DyeBiolegend423101

참고문헌

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