JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أبلغنا عن تقنية تسمح بالتصوير الحي لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM) التي تغزو أنسجة المخ الفقارية. يسمح اقتران الحقن التقويمي لخلايا GBM الموسومة بالفلورسنت في دماغ الزرد الشفاف مع التصوير الداخلي عالي الدقة بقياس ديناميكيات الهيكل الخلوي أثناء غزو السرطان في الموقع .

Abstract

مع متوسط وقت البقاء على قيد الحياة الكئيب في السكان الحقيقيين - ما بين 6 إلى 15 شهرا - الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو ورم الدماغ الخبيث الأكثر تدميرا. يرجع فشل العلاج بشكل أساسي إلى غزو خلايا GBM ، مما يدل على الحاجة إلى فهم أفضل لخصائص GBM المتحركة. للتحقيق في الآلية الجزيئية التي تدعم غزو GBM ، هناك حاجة إلى نماذج فسيولوجية جديدة تتيح توصيفا متعمقا لديناميكيات البروتين أثناء الغزو. هذه الملاحظات من شأنها أن تمهد الطريق لاكتشاف أهداف جديدة لمنع تسلل الورم وتحسين نتائج المرضى. تشير هذه الورقة إلى كيفية السماح للطعم الخارجي التقويمي لخلايا GBM في دماغ الزرد بالتصوير الحي داخل الخلايا تحت الخلوية. بالتركيز على الأنابيب الدقيقة (MTs) ، نصف إجراء لوضع العلامات على MT في خلايا GBM ، والحقن الدقيق لخلايا GBM في الدماغ الشفاف لمدة 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) يرقات الزرد ، والتصوير داخل الجسم ل MTs في نشر الطعوم الأجنبية ، وتغيير ديناميكيات MT لتقييم دورها أثناء غزو GBM ، وتحليل البيانات المكتسبة.

Introduction

حركة الخلية هي عملية نمطية تتطلب إنشاء محور قطبية وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي المولدة للقوة. تعرف بلمرة الأكتين وارتباطها بالميوسين بأنهما المساهمان الرئيسيان في القوى البارزة والانقباضية اللازمة لحركة الخلية1. تعتبر الأنابيب الدقيقة هي الجهات الفاعلة الرئيسية في استقطاب الخلايا وثبات الاتجاه أثناء الهجرة2. في السنوات الأخيرة ، ثبت أيضا أن MTs تخلق وتثبت نتوءات لدعم قوى الضغط الميكانيكي أثناء غزو الخلايا في 3D3. في الآونة الأخيرة ، شاركت MTs بشكل مباشر في النقل الميكانيكي في الالتصاقات البؤرية والهجرة الحساسة للميكانيكا4. يتكون عدم الاستقرار الديناميكي الذي يميز ديناميكيات نهاية MT-plus من مراحل متكررة من البلمرة (النمو) وإزالة البلمرة (الانكماش) ، والتي يتم التحكم فيها بواسطة عدد كبير من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة وشلالات الإشارات داخل الخلايا ، مثل تلك التي يحكمها RHO-GTPases5،6،7. جعل دور شبكة MT في هجرة الخلايا وغزوها التحقيق في ديناميكيات MT عنصرا أساسيا لفهم آليات توجيه الخلايا المناعية والتئام الجروح وغزو السرطان بشكل أفضل.

تعد قدرة الخلايا السرطانية على الهروب من قلب الورم الرئيسي ، والانتشار في الأنسجة ، وتوليد أورام ثانوية خطوة حاسمة في منع النجاح العالمي في الحرب ضد السرطان التي أعلنت قبل 50 عاما 8,9. كانت إحدى أكبر العقبات هي فهم كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة بنشاط. تعتمد آليات الغزو الرئيسية على نفس المبادئ التي تحكم هجرة الخلايا غير السرطانية10. ومع ذلك ، ظهرت خصائص هجرة الخلايا السرطانية11 ، مما أثار الحاجة إلى توصيف أفضل لهذا النوع من الهجرة. على وجه التحديد ، نظرا لأن البيئة المكروية للورم تظهر كلاعب رئيسي في تطور السرطان12 ، فإن مراقبة وتحليل غزو الخلايا السرطانية في سياق فسيولوجي ذي صلة أمر ضروري لكشف آليات نشر الخلايا السرطانية.

تعتبر MTs أساسية لتطور السرطان ، للحفاظ على كل من الانتشار والغزو. يمكن أن يساعد التحليل الدقيق لديناميكيات MT في الموقع في تحديد عوامل تغيير MT (MTA) في كلتا العمليتين. تختلف ديناميكيات MT بشكل كبير عند حدوث تغيير في البيئة. في المختبر ، يمنع العلاج بعوامل مزعزعة للاستقرار MT مثل نوكودازول تكوين نتوء الخلايا عندما يتم تضمين الخلايا في المواد الهلامية في 3D ، في حين أنه ليس له تأثير يذكر على هجرة الخلايا ثنائية الأبعاد13,14. على الرغم من التحدي الفني ، إلا أن التقدم في التصوير داخل الجسم يسمح بتحليل ديناميكيات MT أثناء غزو الخلايا السرطانية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، كشفت ملاحظة MTs في خلايا الساركوما الليفية المطعمة تحت الجلد في الفئران أن الضامة المرتبطة بالورم تؤثر على ديناميكيات MT في الخلايا السرطانية15. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران هذه تنطوي على إجراءات جراحية واسعة النطاق وتظل غير مرضية للسرطانات التي يصعب الوصول إليها ، مثل ورم الدماغ شديد التوغل ، GBM.

على الرغم من متوسط وقت البقاء على قيد الحياة الكئيب لمدة 15 شهرا16 ، لا يعرف سوى القليل عن طريقة انتشار GBM داخل حمة الدماغ أو العناصر الجزيئية الرئيسية التي تدعم غزو خلايا GBM في أنسجة المخ. قدم التحسين في نموذج xenograft التقويمي للفأر (PDX) وإنشاء نوافذ الجمجمة آفاقا جديدة لدراسات غزو خلايا GBM17,18. ومع ذلك ، نظرا لجودة التصوير دون المستوى الأمثل ، فقد سمح هذا النموذج في الغالب بالتصوير الطولي للطعوم الخارجية السطحية ولم يتم استخدامه بنجاح لدراسة التصوير تحت الخلوي لبروتينات الهيكل الخلوي حتى الآن. علاوة على ذلك ، في أعقاب الأمر القضائي "3Rs" للحد من استخدام القوارض واستبدالها بالفقاريات السفلية ، تم إنشاء نماذج بديلة.

الاستفادة من المناعة البدائية التي لوحظت في يرقات الزرد (Danio rerio) ، تم تطوير الحقن التقويمي لخلايا GBM في دماغ الأسماك19،20،21. الحقن بالقرب من البطينين في الدماغ المتوسط النامي يلخص معظم الفيزيولوجيا المرضية GBM البشرية21 ، ويلاحظ نفس النمط المفضل لغزو GBM كما هو الحال في خيار الأوعية البشرية22. بفضل شفافية يرقات الأسماك ، يسمح هذا النموذج بتصور خلايا GBM التي تغزو الدماغ من المناطق المحيطة بالبطين حيث يعتقد أن معظم GBMs تنشأ23.

نظرا لأن MTs ضرورية لغزو خلايا GBM في المختبر24,25 ، فهناك حاجة إلى توصيف أفضل لديناميكيات MT وتحديد المنظمين الرئيسيين أثناء غزو الخلايا. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم تتضمن البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام نموذج تقويم الزرد تحليلا تحت خلوي لديناميكيات MT أثناء عملية الغزو. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لدراسة ديناميكيات MT في الجسم الحي وتحديد دورها أثناء غزو سرطان الدماغ. بعد وضع علامات على الأنابيب الدقيقة المستقرة ، يتم حقن خلايا GBM الدقيقة عند 3 dpf في أدمغة يرقات الزرد وتصويرها في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية أثناء تقدمها في أنسجة المخ. يسمح التصوير المباشر ل MTs الفلوري بالتحليل النوعي والكمي لديناميكيات MT plus-end. علاوة على ذلك ، يتيح هذا النموذج تقييم تأثير MTAs على ديناميكيات MT وعلى الخصائص الغازية لخلايا GBM في الوقت الفعلي. هذا البروتوكول غير الجراحي نسبيا جنبا إلى جنب مع عدد كبير من اليرقات التي يتم التعامل معها في وقت واحد وسهولة تطبيق الدواء (في مياه السمك) يجعل النموذج أحد الأصول للاختبار قبل السريري.

Protocol

أجريت التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات الاتحاد الأوروبي للتعامل مع المختبر. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات في معهد باستور - CEEA 89 ووزارة البحث والتعليم الفرنسية (تصريح # 01265.03). أثناء الحقن أو جلسات التصوير الحية ، تم تخدير الحيوانات Tricaine.At نهاية الإجراءات التجريبية ، وتم قتلها رحيما بجرعة زائدة من التخدير. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بالمواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول. يتم وصف سير العمل العام للبروتوكول في الشكل 1.

1. توليد خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تعبر بثبات عن α-tubulin-mKate2

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية BSL2 +.

  1. إنتاج جزيئات عدسية تعبر عن mKate2-tubulin باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم لنقل 7 × 106 خلايا HEK-293T.
    1. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، أضف 10 ميكروغراممن الجيل الثاني من بلازميد البلازميد psPAX2 ، و 5 ميكروغرام من بلازميد المغلف الفيروسي pMD2.G ، و 10 ميكروغرام من البلازميد محل الاهتمام ، pGK-mKate2-human tubulin α1a مع 50 ميكرولتر من CaCl 2 (مخزون2.5 M). اضبط على 500 ميكرولتر باستخدام H2O المعقم الخالي من الحمض النووي.
      ملاحظة: من المهم إضافة CaCl2 أخيرا.
    2. امزج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. أثناء الحضانة ، قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن HEPES (HBS) ، درجة الحموضة 7.0 (2x).
    4. بعد 20 دقيقة ، أضف مزيج CaCl2 / DNA قطرة قطرة في محلول HBS (2x). تخلط عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. احتضان لمدة 12 دقيقة في RT.
    5. بعد 12 دقيقة ، أضف برفق CaCl2 / DNA الممزوج ب HBS مباشرة على طبق 10 سم من خلايا HEK-293T بنسبة 70٪ ، قطرة قطرة.
    6. اترك الخلايا في الحاضنة المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 36-48 ساعة.
    7. اجمع المادة الطافية وقم بتدويرها لأسفل بسرعة 3000 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي.
    8. لتركيز الجسيمات الفيروسية ، قم بتحميل المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي فائق وقم بتدويرها لأسفل عند 47,508 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    9. تخلص من المادة الطافية وضع الأنبوب رأسا على عقب على الورق لتجفيف الجزء الداخلي من الأنبوب.
    10. أضف 30 ميكرولتر من PBS على الحبيبات الفيروسية. لا تقم بإعادة تعليق الحبيبات. اتركيه عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
    11. أعد تعليق الجسيمات الفيروسية برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. تجنب صنع الفقاعات. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن إنتاج كميات أكبر من الجسيمات الفيروسية عن طريق نقل ألواح متعددة من خلايا HEK-2-93T.
  2. تصيب خلايا الورم الأرومي الدبقي بجزيئات الفيروسات العدسية.
    ملاحظة: تمت كتابة هذا البروتوكول لخطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي التجارية مثل U-87 MG أو U-373 MG أو T98. لاستخدام خلايا الورم الأرومي الدبقي الأولية المشتقة من المريض ، استخدم طبقة محددة من الألواح والوسط غير القائم على المصل26.
    1. قم بإعداد طبق 10 سم متقارب بنسبة 70٪ من خلايا الورم الأرومي الدبقي U-87 MG المزروعة في الحد الأدنى من الوسط الأساسي من Eagle (MEM) مع 10٪ مصل عجل الجنين ، البنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل التركيز النهائي للبنسلين و 100 ميكروغرام / مل للستربتومايسين) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1x).
    2. أضف الجسيمات الفيروسية بتخفيف 1 في 5000 مباشرة على الخلايا. تخلط مع دوامة لطيفة. اسمح للفيروسات بإصابة الخلايا لمدة لا تزيد عن 20 ساعة.
    3. قم بإزالة الوسط المحتوي على الفيروس واستبدله بوسط زراعة جديد. السماح للتعبير عن tubulin الموسومة لمدة 48-72 ساعة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية BSL2.
    4. تقوم FACS بفرز الخلايا لتحديد ألمع 15٪ من خلايا mKate2 + . بعد إزالة الحطام والخلايا المزدوجة باستخدام بوابة التشتت الأمامي والجانبي (FCS مقابل SSC) ، قم بتطبيق بوابة أخرى على ألمع خلايا mKate2 + بنسبة 30٪ للحفاظ على أعلى 15٪.
    5. تضخيم الخلايا التي تحمل علامة MT.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن إجراء الاختيار النسيلي بناء على مستويات عالية من tubulin-mKate2 تحت مجهر فوق التألق.

2. تحضير يرقات الزرد للحقن المجهري

  1. توليد بيض الزرد.
    1. ضع ثلاثة ذكور وأربع إناث من سلالة الزرد المرغوبة في خزان تزاوج مكمل بالرخام قبل 4 أيام من زراعة الزرد ، في وقت متأخر من بعد الظهر.
      ملاحظة: تستخدم خطوط Tg(fli1a:gfp) أو Tg(gfap:gfp) أو Tg(Huc:gfp) لتمييز الأوعية الداخلية والخلايا الجذعية العصبية/الخلايا النجمية والخلايا العصبية، على التوالي.
    2. اجمع البيض الناتج عن التفريخ الناجم عن الرخام في صباح اليوم التالي.
    3. نظف البيض عن طريق نقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مملوء بمياه من مصدر معدني27 مكمل بالمبيض (0.004٪ نهائي). اقلب الأنبوب برفق لمدة 5 دقائق. يغسل مرتين بالمياه المعدنية فقط.
    4. انقل البيض إلى طبق بتري يحتوي على المياه المعدنية المكملة ب 0.28 مجم / مل من الميثيلين الأزرق.
    5. قم بإزالة البويضات غير المخصبة والمحتجزة في النمو. احتضان الأجنة عند 28 درجة مئوية.
  2. إنشاء يرقات شفافة.
    1. أدخل N-phenylthiourea (PTU) (0.003٪ نهائي) إلى الوسط بعد 8 ساعات ، لمنع تصبغ الميلانين وضمان الشفافية البصرية. احتفظ ب PTU في الوسط لبقية البروتوكول.
      ملاحظة: نظرا لأن علاج PTU يمكن أن يسبب عيوبا في النمو ، حدد فقط اليرقات المطورة بشكل طبيعي لزراعة الأعضاء. كبديل للعلاج الكيميائي ، يمكن للمرء استخدام سلالة الزرد المتحولة كاسبر (الصدف وروي أوربيسون مزدوج الطفرة) ، حيث يكون التصبغ غائبا28.
    2. ارفع درجة حرارة الحضانة إلى 29 درجة مئوية.
    3. زيادة درجة الحرارة كل يوم بمقدار 1 درجة مئوية بحيث تصل يرقات 3 dpf إلى 32 درجة مئوية في يوم الحقن.
  3. تحضير لوحة الحقن المجهري.
    1. تحضير 20 مل من 1٪ أغاروز + 0.28 ملغ / مل من الميثيلين الأزرق مع المياه المعدنية.
    2. صب الأغاروز في طبق بتري 10 سم وقم بتطبيق قالب الحقن البلاستيكي بسرعة رأسا على عقب لإنشاء خنادق على شكل حرف V بعرض 2.5 مم (الشكل 2 ب).
      ملاحظة: القالب البلاستيكي متاح تجاريا أو يمكن بناؤه داخليا وفقا للتصميم الموضح في كتاب الزرد29.
    3. قم بإزالة القالب البلاستيكي بعناية عندما يصلب الأغاروز.
      ملاحظة: يمكن تخزين ألواح الحقن المجهري المصبوب في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  4. تحضير اليرقات لزرع الأجانب.
    1. في يوم الحقن ، قم بفحص التعبير الجيني المحورة الفلوري المحدد في يرقات 3 dpf. قم بإزالة الحيوانات غير الفلورية ذات المظهر غير الطبيعي.
    2. قم بفك اليرقات يدويا باستخدام ملقط صانع الساعات ذي الرؤوس الدقيقة. عند 3 dpf ، قم بوخز أو تمزيق الحبال برفق باستخدام زوجين من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة لتحرير اليرقات من المشيمية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام العلاج الأنزيمي مع pronase A ل dechorionate اليرقات ، عادة عند 24 hpf.
    3. الحفاظ على اليرقات dechoionated في وسط المياه المعدنية مع الميثيلين الأزرق (0.28 ملغ / مل) و PTU (0.003٪ النهائي).

3. إجراء زراعة الأعضاء

  1. تحضير إبر الحقن المجهري.
    1. خذ شعرية زجاجية من البورسليكات بدون خيوط مركزية وضعها في مجتذب إبرة عمودي.
    2. باستخدام الإعدادات التالية - زيادة 8.5 وسخان 3 - تمديد الشعيرات الدموية لتحويلها إلى إبرة الحقن المجهري.
  2. قم بإعداد الحاقن الدقيق.
    1. قم بتحميل الزيت المعدني في حاقن يدوي. إزالة فقاعات الهواء.
    2. قم بتوصيل حامل شعري عالمي بالحاقن الدقيق وقم بتثبيته بإحكام على معالج دقيق ميكانيكي (الشكل 2 أ).
  3. حصاد خلايا الورم الأرومي الدبقي.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في خزانة السلامة الأحيائية BSL2.
    1. تحضير صفيحة 10 سم من خلايا الورم الأرومي الدبقي بحيث تصل إلى 80٪ التقاء في يوم الزرع.
    2. (اختياري) قم بتسمية نوى الخلية بشكل عابر عن طريق إضافة Hoechst 35480 (200 نانوغرام / مل) إلى الخلايا. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخلايا المرطبة واغسل 2x مع PBS.
    3. أخرج صفيحة الخلايا من الحاضنة واغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. افصل الخلايا بإضافة 1 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA واحتضانها لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخلايا حتى يتم فصل جميع الخلايا تماما.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لأن ضعف التربسين سيؤدي إلى بقاء مجاميع الخلايا عالقة في الإبرة.
    4. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط خلية الورم الأرومي الدبقي الكامل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. أضف 45 مل من PBS المثلج وأجهزة الطرد المركزي عند 134 × جم لمدة 5 دقائق.
    5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 1 مل من PBS المثلج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل جيدا.
      ملاحظة: تساعد هذه الخطوة من التفكك الميكانيكي بشكل كبير على منع خطر انسداد الشعيرات الدموية أثناء الحقن المجهري.
    6. أضف 49 مل من PBS المثلج وأجهزة الطرد المركزي عند 134 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS المثلج. تخزينها على الجليد طوال مدة إجراء الزرع.
  4. الحقن الدقيق لخلايا الورم الأرومي الدبقي في الدماغ المتوسط ليرقات الزرد.
    1. املأ صفيحة مصبوبة بالحقن المجهري ب 6 مل من E3-medium30 مكملة ب 160 مجم / لتر تريكايين.
    2. نقل عشرات اليرقات dechorionated في لوحة الحقن المجهري. بمجرد عدم الاستجابة للمس ، قم بمحاذاتها في الخنادق على جانبها ، ورأسها لأعلى ، ودفع كيس الصفار على جدار الخندق ، بفرشاة طلاء مقاس 00 (الشكل 2B ، C).
    3. أعد تعليق خلايا الورم الأرومي الدبقي. قم بتحميل 5 ميكرولتر من الخلايا في الشعيرات الدموية الدقيقة باستخدام أطراف التحميل الدقيقة وأدخل الشعيرات الدموية في حامل الشعيرات الدموية العالمي.
    4. ضع صفيحة الحقن المجهري التي تحتوي على اليرقات غير المستجيبة تحت المجهر المجسم. ضع طرف الشعيرات الدموية الدقيقة على حدود لوحة الحقن الدقيق باستخدام مقابض micromanipulator. كسرها بمشرط لإنشاء نقطة دخول حادة ، بحجم قطر الخلية تقريبا.
    5. تحقق من أن الخلايا تتدفق من الشعيرات الدموية عن طريق تشغيل الزيت برفق في الحاقن الدقيق وإغراق طرف الإبرة في الوسط. ركز الخلايا عند طرف الشعيرات الدموية لزيادة عدد الخلايا المحقونة لكل حجم يتم إخراجه وتجنب ملء أنسجة المخ ب PBS (الشكل 2C).
    6. افحص بعناية الخلايا الخارجة من الشعيرات الدموية الدقيقة حيث يتم إدخال الزيت يدويا في الحاقن. حدد تجريبيا مقدار الدوران المطلوب على المقبض اليدوي لتوصيل 20 إلى 50 خلية. عادة ، إذا كانت الخلايا مركزة بدرجة كافية ، فإن دورة واحدة لطيفة تكفي لإخراج ~ 10 خلايا.
      ملاحظة: إذا لم يتدفق السائل بشكل صحيح من الشعيرات الدموية الدقيقة ، فحاول فك ارتباط الشعيرات الدموية الدقيقة في حامل الشعيرات الدموية. من خلال القيام بذلك ، قد يتسرب الزيت ويقطر على طول الشعيرات الدموية.
    7. اقترب من طرف الشعيرات الدموية مقابل الفتحة البصرية اليسرى (OT) ، فوق الوريد الدماغي الأوسط مباشرة (MCeV ، الشكل 2F).
    8. اضغط برفق على الشعيرات الدموية ضد اليرقات حتى ينكسر غشاء الجلد (الشكل 2د ، ه).
      ملاحظة: لا تضغط بشدة لأن هذا سيؤدي إلى حقن الخلايا في عمق الدماغ حيث يمنع الوضوح البصري المنخفض مراقبة MTs بالتفصيل. تقنية التصوير ممكنة لعمق يصل إلى 250-300 ميكرومتر. ومع ذلك ، يوصى بعدم حقن أعمق من 100 ميكرومتر من سطح السمك.
    9. بمجرد الوصول إلى موضع مناسب في OT ، أخرج الخلايا. راقب بعناية طرف الشعيرات الدموية لتصور تيار الخلايا داخل الحيوان ، وبالتالي ضمان الحقن الناجح.
      ملاحظة: احرص على عدم الحقن في البطينين (الشكل 2E). بمجرد دخول البطينين ، تميل الخلايا إلى التراكم وتتعثر بدلا من التسلل إلى الأنسجة (الشكل 2I). يتميز حقن البطين بتورم شديد في الدماغ وانتشار ملحوظ للخلايا المحقونة إلى الدماغ الأمامي والدماغ الخلفي (الشكل 2J).
    10. كرر الإجراء من الخطوات 3.4.9-3.4.11 لأكبر عدد ممكن من الحيوانات كما هو مطلوب. المضي قدما بسرعة لمنع تكتل الخلايا في الشعيرات الدموية.
      ملاحظة: اعتمادا على مدى سرعة المجرب في الحقن ، قد تكون هناك حاجة لتغيير الإبرة كل 10 إلى 20 يرقة.
    11. بمجرد اكتمال عملية الزرع ، قم بإزالة اليرقات من لوحة الحقن المجهري وفردها في صفيحة مكونة من 24 بئرا مملوءة بمياه مصدر معدني + PTU + وسط أزرق ميثيلين.
    12. التحقق من صحة الحقن الناجح من خلال مراقبة اليرقات تحت المجهر المجسم الفلوري (الشكل 2G). حدد فقط xenografts التي تحتوي على كتلة ورم واحدة تتكون من 20-50 خلية تقع في أعلى 200 ميكرومتر (في z) من OT (الشكل 2H مقابل الحقن غير الناجح في الشكل 2I-K).
      ملاحظة: يختلف عائد الطعوم الأجنبية المترجمة بنجاح من 10٪ في البداية إلى ما يقرب من 100٪ مع الممارسة.
    13. دع اليرقات تتعافى لمدة 4 ساعات على الأقل عند 32 درجة مئوية قبل التصوير.
      ملاحظة: إضافة المضادات الحيوية في الوسط لا يزيد من معدل بقاء اليرقات. في هذه المرحلة ، إذا تم إجراء الحقن المجهري بشكل صحيح ، فإن ما يقرب من 100 ٪ من الأسماك على قيد الحياة.

4. التصوير داخل الجسم من xenografts الورم الأرومي الدبقي

  1. جبل اليرقات للتصوير الحي.
    ملاحظة: يمكن تصوير اليرقات من 4 ساعات بعد الحقن (hpi). عادة ما يتم إجراء التصوير المباشر ل MT من 20 hpi ، عندما تبدأ خلايا GBM الغازية في تمديد النتوءات والهجرة بعيدا عن كتلة الورم.
    1. تحضير محلول أغاروز منخفض الانصهار بنسبة 1٪. انقل 500 ميكرولتر من محلول الأغاروز المغلي منخفض الانصهار بنسبة 1٪ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل واتركه يبرد عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية. أضف التريكائين (112 ميكروغرام / مل) إلى الأغاروز واخلطه جيدا.
    2. انقل واحدة إلى أربع يرقات مطعمة في طبق بتري 3.5 سم مملوء بمياه مصدر معدني + PTU + وسط ميثيلين مكمل بالتريكائين (112 ميكروغرام / مل). بمجرد أن لا تستجيب اليرقات للمس، قم بنقلها بعناية إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأغاروز والتريكائين باستخدام ماصة نقل ذات طرف رفيع.
      ملاحظة: حافظ على حجم الوسط إلى الحد الأدنى للحد من تخفيف الأغاروز.
    3. مزيج بلطف اليرقات مع agarose. باستخدام ماصة نقل عادية (لمبة كبيرة) ، ضع اليرقات المخلوطة في الأغاروز في وسط طبق تصوير فيديو ذو قاع زجاجي 3.5 سم. تحت المجهر المجسم ، ضع اليرقات بسرعة على ظهرها باستخدام طرف التحميل الدقيق للتلاعب بالأسماك.
      ملاحظة: نظرا لاستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب القرص الدوار لتصوير الدماغ داخل الجسم في هذا البروتوكول ، يتم تثبيت اليرقات ظهريا. اضبط موضع اليرقات وفقا لذلك في حالة استخدام مجهر متحد البؤر قائم.
    4. قم بإزالة الأغاروز الزائد للحفاظ على أنحف طبقة أغاروز ممكنة. بمجرد أن يصلب الأغاروز ، أضف 2.5 مل من مياه المصدر المعدني + PTU + 0.2x tricaine (وسيط تصوير) وانتقل إلى الخطوة التالية.
  2. التصوير الحي في الجسم الحي لديناميكيات MT في خلايا الورم الأرومي الدبقي الغازية
    ملاحظة: تعتمد الجودة البصرية للصور بشكل كبير على أداء المجهر المستخدم. تمت كتابة البروتوكول لمجهر متحد البؤر مقلوب القرص الدوار مزود بكاميرا sCMOS (حجم البكسل 6.5 ميكرومتر ، 2048 × 2044 بكسل) ، هدف مسافة العمل الطويلة ، وغرفة بيئية يتم التحكم في درجة حرارتها.
    1. ضع طبق التصوير بالفيديو الذي يحتوي على اليرقات المطعمة بالأغاروز في الغرفة البيئية للمجهر متحد البؤر المقلوب ، مع ضبط درجة الحرارة على 32 درجة مئوية. ابحث عن اليرقات في طبق تصوير الفيديو بهدف 10x ، باستخدام مرحلة XY الآلية.
    2. اضغط على ESC لخفض برج الأهداف ، وأضف الزيت المعدني إلى هدف زيت 60x (1.4 NA ، مسافة العمل: 0.13 مم) ، واضغط على ESC للعودة إلى الموضع البؤري الأولي.
    3. راقب خلايا الورم الأرومي الدبقي الغازية في القناة الحمراء (مصدر ليزر 561 نانومتر ، طاقة ليزر 20٪ ، تعرض للوقت: 200 مللي ثانية) وحدد خلية بها شبكة MT منتشرة وخيوط MT يمكن تمييزها بسهولة (الشكل 3 ب).
    4. اضبط إعدادات السلسلة z. باستخدام مرحلة بيزو بنطاق 200 ميكرومتر ، حدد المواضع العلوية والسفلية لشبكة MT: مكدس z بعمق 10-30 ميكرومتر يكفي لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة في نتوء الخلية المهاجرة ، مع خطوة شريحة z تبلغ 0.3 ميكرومتر.
    5. اضبط إعدادات اكتساب الفاصل الزمني للسماح بالتوازن الأمثل بين سرعة الاكتساب وعمق z-stack وإشارة الفلورسنت لتجنب التبييض الضوئي السريع. احصل على صور MTs كل 5-10 ثوان لعدة دقائق. الحصول على وحفظ المكدس الفائق 5D (x ، y ، z ، t ، c).
      ملاحظة: لتجنب الانجرافات في z أثناء الاقتناء ، استخدم مجهرا مزودا بنظام تركيز مثالي لتثبيت تركيز الأجهزة.
  3. (اختياري) تحديد تأثيرات عوامل تغيير الأنابيب الدقيقة (MTAs) على MTs.
    ملاحظة: تسمح الخطوات التالية باختبار تأثيرات MTAs على شبكة MT في خلايا الورم الأرومي الدبقي المهاجرة في الوقت الفعلي.
    1. قم بإزالة وسيط التصوير برفق من طبق تصوير الفيديو. لا تلمس قاع الطبق ، حيث سيتم فقد موضع xyz.
    2. إعداد وسيط تصوير جديد يحتوي على MTA بتركيزات مختلفة. أضف الوسط المحتوي على MTA برفق إلى طبق تصوير الفيديو قطرة قطرة.
    3. احصل على أفلام طويلة المدى (2-16 ساعة ، صورة واحدة كل 10-20 دقيقة) لمراقبة تأثيرات كل تركيز MTA على شبكة MT وهجرة الخلايا (الشكل 4 أ).
    4. (اختياري) اغسل MTA عن طريق إزالة الوسط برفق وإضافة 2.5 مل من وسيط التصوير الجديد بدون MTA. كرر إجراء الغسيل 3x لإزالة أي أثر ل MTA في الوسط.
    5. (اختياري) احصل على فيلم طويل المدى مماثل كما في 4.3.3 (الشكل 4 ب).
      ملاحظة: تحدد الخطوات المذكورة أعلاه الحد الأدنى من التركيز الذي يغير شبكة MT دون التأثير على بقاء اليرقات. تحدد خطوات الغسيل ما إذا كان تأثير الدواء قابلا للعكس.
  4. تقييم تأثير MTA على غزو الورم الأرومي الدبقي عن طريق التصوير المتسلسل.
    1. اتبع الخطوات من 4.1 إلى 4.2.1 بعد 4 ساعات من الحقن المجهري.
      ملاحظة: يمكن أيضا تحقيق هذا الجزء من البروتوكول مع خطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي الأخرى الموسومة بالفلورسنت. من الناحية المثالية ، شارك في تسمية GBM بعلامة cytosolic وعلامة النواة لضمان الكشف عن التشكل العالمي للخلية.
    2. قم بالتبديل إلى مسافة عمل طويلة 40x هدف الماء (NA: 1.15 ، WD: 0.6 مم).
    3. قم بتعيين نطاق z-series للحصول على منطقة OT. احصل على z-stack باستخدام كاميرا sCMOS عالية الحساسية (حجم البكسل 11 ميكرومتر ، 1200 × 1200 بكسل ، الكفاءة الكمية 95٪).
      ملاحظة: يبدأ المكدس z عادة في الجزء الظهري الأكثر من OT (بالقرب من السطح) وينتهي عميقا بما يكفي في الدماغ ليشمل كتلة الخلايا السرطانية بأكملها.
    4. قم بإزالة طبق تصوير الفيديو من المجهر. حرر اليرقات من الأغاروز باستخدام طرف التحميل الصغير ودس الأغاروز برفق حول الحيوان.
      ملاحظة: نظرا لأن 3 يرقات dpf لا تزال هشة للغاية ، كن حذرا عند إزالتها من الأغاروز.
    5. بمجرد تحرير الحيوان من الأغاروز ، قم بنقله برفق إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا مملوءة بمياه مصدر معدني + أزرق الميثيلين + وسط PTU. ضع علامة على البئر لتحديد اليرقات للتصوير اللاحق.
    6. يضاف MTA محل الاهتمام في الوسط عند التركيز المحدد سابقا (الخطوة 4.3.3). تحديث المتوسطة تستكمل مع المخدرات كل يوم. كرر إجراء التصوير من الخطوات 4.4.1 إلى 4.4.5 كل يوم لمدة 3-4 أيام.

5. تحليل الصور

  1. قم بتحليل ديناميكيات MT باستخدام مكونات FIJI الإضافية المتاحة مجانا.
    ملاحظة: تصف العديد من المراجعات والبروتوكولات طرق تحليل ديناميكيات MT في الخلايا31،32،33،34 ويمكن تطبيقها في هذه المرحلة. سيشير هذا البروتوكول بإيجاز إلى طريقتين لقياس الخصائص الديناميكية الأساسية ل MT.
    1. افتح المكدس الفائق 5D وقم بإنشاء مكدس 4D حيث تم عرض شرائح z في مستوى واحد لإنشاء إسقاط كثافة قصوى (MIP) في z (الصورة | أكوام | مشروع Z | أقصى كثافة) (الشكل 3 ب).
    2. افتح مكدس 4D MIP وتتبع يدويا نهاية MT القائم على البروز باستخدام وظيفة التتبع اليدوي في فيجي (الإضافات | تتبع | التتبع اليدوي). (الشكل 3 د). استخرج معلمات ديناميكيات MT مثل سرعة النمو وسرعة الانكماش وتكرار الإنقاذ وتكرار الكارثة.
    3. بدلا من ذلك ، ارسم خطا مجزأ بعرض 10 بكسل على طول MT لتحليله (الشكل 3 ب). استخدم وظيفة Multi Kymograph (تحليل | Multi Kymograph) (الشكل 3C) في فيجي. راقب وقياس مراحل نمو MT (G) ، وطول فترات التوقف (P) ، وتواتر كوارث MT.
  2. تحليل غزو الورم الأرومي الدبقي على المدى الطويل
    ملاحظة: يتطلب هذا التحليل استخدام التصور والتحليل 4D مع برنامج التصوير الحيوي.
    1. قم بتحويل مكدس z-stack الرابع الخام من الخطوة 4.4.3 (4 hpi) إلى تنسيق البرنامج المناسب ، باستخدام برنامج محول الملفات.
    2. افتح البرنامج واستورد ملف z-stack المحول في عرض Surpass (الشكل 5 أ).
    3. لتقسيم الخلايا السرطانية وتجاهل التألق الذاتي غير ذي الصلة في القناة الحمراء ، انقر فوق إضافة أسطح جديدة واتبع العملية المكونة من 5 خطوات.
      1. تحقق من صحة الإعدادات الافتراضية بالنقر فوق السهم التالي بمجرد ظهور النافذة. انتقل إلى الخطوة 2/5.
        ملاحظة: إذا تم الحصول على إشارة الفلورسنت في قناة 561 ، يمكن أن يكون التألق الذاتي من التصبغ المتبقي في العين قويا ويغير عملية التجزئة التلقائية. هذه مشكلة إذا كان xenograft يقع بالقرب من العين. في هذه الحالة ، يجب إنهاء التجزئة يدويا عن طريق قطع وحذف إشارات خلايا الورم الأرومي غير الدبقي.
      2. انتقل إلى القناة المصدر | قناة 561. قم بتنعيم الصورة (مرشح Gaussian) بإضافة 1.50 ميكرومتر في تفاصيل الأسطح وإضافة 2.5 ميكرومتر لقطر الكرات في خلفية الطرح. انقر فوق السهم التالي وانتقل إلى الخطوة 3/5.
      3. اعتمادا على شدة الإشارة ، اضبط العتبة (طرح الخلفية) يدويا لتضمين كل عملية خلية. انتقل إلى الخطوة 4/5.
      4. قم بتصفية الإشارة المجزأة عن طريق إزالة الأحداث التي لا تمثل جزءا من الخلية (على سبيل المثال ، الحطام ، التألق الذاتي). انقر فوق نوع التصفية | مستوى الصوت واضبط العتبة يدويا لاستبعاد جميع الأحداث الموجودة أسفل أصغر حجم يمثل جزءا من الخلية. انتقل إلى الخطوة 5/5.
        ملاحظة: إذا كانت إشارات التألق الذاتي أكبر في الحجم من أصغر جزء من الخلية ، فتابع على أي حال وقم بإزالة الإشارات غير المرغوب فيها يدويا عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر وحذفها .
      5. تجاهل خطوة التصنيف وإنهاء معالج التجزئة بالنقر فوق السهم الأخضر المزدوج لإنهاء إنشاء عرض سطحي للخلايا السرطانية (الشكل 5 ب).
    4. إذا كانت الخلايا المجزأة لا تلمس بعضها البعض ولا تشكل كائنا فريدا ، فقم بدمجها بشكل مصطنع لإنشاء جسم كتلة خلية ورمية. باختصار ، انقر فوق إحصائيات | | القيم المحددة | المجلد. حدد جميع الأحداث عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على الجزء العلوي ثم الضغط باستمرار على Shift والنقر بزر الماوس الأيسر على الحدث الأخير. انتقل إلى تحرير | التحديد | توحيد.
    5. تحديد النقطه الوسطى لكتلة الخلايا السرطانية. انقر فوق إضافة أماكن جديدة | تخطي | الإنشاء التلقائي إضافة (يتقاطع المؤشر مع) | مركز الكائن. اضغط مع الاستمرار على مفتاح shift وانقر بزر الماوس الأيسر لإنشاء البقعة ، وهي النقطه الوسطى لكتلة الخلايا السرطانية المجزأة.
    6. قياس المسافة 3D بين كل خلية GBM و centroid من كتلة الورم. للقيام بذلك ، قم بإنشاء مسافة إلى قناة centroid عن طريق البقاء في عرض Spot وتحديد رمز الأداة | تحويل المسافة. انتظر حتى يتم إنشاء مسافة جديدة إلى القناة المركزية ، جنبا إلى جنب مع القناة 488 و 561 (باللون الأزرق ، الشكل 5C).
      ملاحظة: تتوافق شدة كل فوكسل في هذه القناة مع مسافة 3D بين الفوكسل إلى النقطه الوسطى لكتلة الخلايا السرطانية.
    7. قم بقياس مسافة 3D إلى النقطه الوسطى لكل خلية مجزأة بالنقر فوق إضافة بقع جديدة | تخطي | الإنشاء التلقائي إضافة (يتقاطع المؤشر مع) | قناة محددة 561. اضغط مع الاستمرار على مفتاح shift وانقر بزر الماوس الأيسر على منطقة نواة الخلية. نفذ هذه المهمة لكل خلية (الشكل 5D).
      ملاحظة: قم بإزالة طريقة عرض Surface لتقدير إشارة التألق للخلايا بشكل أفضل. بدلا من ذلك ، إذا كانت موجودة ، استخدم إشارة النواة (إشارة 405 نانومتر أو 647 نانومتر) للحصول على دقة أفضل.
    8. انقر فوق إحصائيات | | التفصيلية قيم محددة | تعني الشدة Ch = المسافة إلى النقطة.
      ملاحظة: قيمة الشدة هي مسافة 3D بالميكرومتر بين منطقة نواة الخلية والنقطه الوسطى.
    9. متوسط هذه الشدة لحساب نصف قطر كتلة الورم عند 4 hpi. كرر الإجراء لكل نقطة زمنية للتحليل (24 نقطة في البوصة و 48 نقطة في البوصة و 72 نقطة في البوصة).
      ملاحظة: قم فقط بقياس 10 أو 20 خلية منتشرة لتجنب التقليل من غزو الخلايا. في الواقع ، قد يؤدي الضغط القسري للخلايا أثناء الحقن إلى منع الخلايا الموجودة في وسط كتلة الورم من الهجرة.
    10. احسب مؤشر الغزو (II) كنسبة بين متوسط مسافات 3D عند t = 24 hpi / 48 hpi / 72 hpi للخلايا الأكثر انتشارا على متوسط نصف قطر كتلة الورم عند t = 4 hpi (الشكل 5E).

النتائج

لتحليل الدور الذي تلعبه MTs أثناء غزو GBM في الجسم الحي ، نصف هنا الخطوات الرئيسية لأداء وضع علامات MT مستقرة في خلايا GBM عن طريق العدوى الفيروسية العدسية ، وزرع xenotransplantation التقويمي لخلايا GBM في 3 يرقات الزرد dpf ، والتصوير عالي الدقة داخل الجسم لديناميكيات MT ، وعلاج MTA وتأثيراته على غزو GBM ، وتحلي?...

Discussion

من المرجح أن يصبح تصوير الطعوم الخارجية للورم بدقة خلية واحدة أداة لا غنى عنها لتحسين فهمنا لبيولوجيا GBM. أدى التصوير المباشر في نماذج PDX للفأر إلى اكتشافات قيمة حول كيفية غزو GBM بشكل جماعي لأنسجة المخ18. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن الدقة الزمانية المكانية ليست عالية بما يكفي للكشف ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نحن ممتنون للغاية للدكتور ب. هيربوميل (معهد باستور ، فرنسا) ومختبره ، وخاصة فاليري بريولات ، وإيما كولوتشي جويون لتزويدنا بخطوط الزرد والعفن البلاستيكي لألواح الحقن المجهري ، ولخبرتهم القيمة في الإجراءات التجريبية لسمك الزرد. نحن نعرب عن امتناننا ل UtechS Photonic BioImaging (C2RT ، معهد باستور ، بدعم من وكالة البحوث الوطنية الفرنسية France BioImimaging ، و ANR-10-INBS-04; استثمارات للمستقبل). تم دعم هذا العمل من قبل الرابطة لمكافحة السرطان (EL2017. LNCC) ، والمركز الوطني للبحوث العلمية ، ومعهد باستور وبالتبرعات السخية للسيدة مارغريت ميشيل والسيد بوركيه.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serumEurobioCVFSVF00-01Reagent
MEM NEAAGibco11140-050Reagent
Modified Eagle's mediumEurobioCM1MEM18-01Reagent
Penicillin–streptomycinGibco15140-122Reagent
U-87 MGECACC89081402-1VLCells
Lenitivirus production
BD FACSAria IIIBD bioscienceInstrument
BD FACSDiva software v8.0BD bioscienceSoftware
HEK-293TMerck12022001Cells
pMD2.GAddgenePlasmid #12259Reagent
psPAX2AddgenePlasmid #12260Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80Beckman CoulterInstrument
Cell passaging and staining
dPBSGibco14190-094Chemical
Hoechst 34580Sigma-Aldrich63493Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%)Gibco25300-054Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FCLEICAhttps://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/Instrument
Methylene Blue hydrateSigma-AldrichM4159Chemical
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629-25GChemical
Transfer Pipettes fine tipsSamco Scientific232Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mLSamco Scientific225Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichCat#: A5040Chemical
Volvic Source WaterDUTSCHER DOMINIQUE SAS999556Reagent
Xenotransplantation
24-well plateTPP92024Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)Harvard Apparatus(#30-0017 GC100-15Equipment
CellTram oil vario microinjectorEppendorf5176000.025Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µLEppendorf 5242956003Equipment
MicromanipulatorNARISHIGEhttps://products.narishige-group.com/group1/injection/english.htmlEquipment
Mineral OilSigmaM8410-100mlEquipment
StereomicroscopeOlympusKL 2500 LCDInstrument
Universal capillary holderEppendorf5176190002Equipment
Vertical Pipette pullerKOPF (Roucaire)Model 720Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dishMatTek Life Sciences, MA, USAP35G-1,5-14-CEquipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21NikonSoftware
Heat-BlockTechneDRI-BLOCK DB-2DEquipment
Microscope head Nikon Ti2ENikonInstrument
sCMOS camera Prime 95BPhotometricsInstrument
sCMOS camera Orca Flash 4HammatsuInstrument
Ultrapure Low melting point agaroseInvitrogen16520-050Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unitHammatsuInstrument
Drug Treatment
DMSOSigma-AldrichD2650-100MLChemical
NocodazoleSigma-AldrichM1404-2MGChemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 softwareOxford InstrumentsSoftware
ImarisFileConverter 9.5.1Oxford InstrumentsSoftware

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022)
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , (2000).
  30. E3, M. . Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185 PDX 5D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved