Imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome envahissant le cerveau du poisson zèbre

Résumé

Nous rapportons une technique permettant l’imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome (GBM) envahissant un tissu cérébral de vertébrés. Le couplage de l’injection orthotopique de cellules GBM marquées par fluorescence dans un cerveau de poisson-zèbre transparent avec une imagerie intravitale à haute résolution permet de mesurer la dynamique du cytosquelette lors de l’invasion in situ du cancer.

Résumé

Avec un temps de survie médian lamentable dans les populations réelles - entre 6 et 15 mois - le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale maligne la plus dévastatrice. L’échec du traitement est principalement dû au caractère invasif des cellules GBM, ce qui témoigne de la nécessité d’une meilleure compréhension des propriétés mobiles du GBM. Pour étudier le mécanisme moléculaire soutenant l’invasion du GBM, de nouveaux modèles physiologiques permettant une caractérisation approfondie de la dynamique des protéines pendant l’invasion sont nécessaires. Ces observations ouvriraient la voie à la découverte de nouvelles cibles pour bloquer l’infiltration tumorale et améliorer les résultats pour les patients. Cet article rapporte comment une xénogreffe orthotopique de cellules GBM dans le cerveau du poisson zèbre permet l’imagerie vivante intravitale subcellulaire. En nous concentrant sur les microtubules (MT), nous décrivons une procédure de marquage MT dans les cellules GBM, la microinjection de cellules GBM dans le cerveau transparent de larves de poisson zèbre 3 jours après la fécondation (dpf), l’imagerie intravitale des MT dans les xénogreffes disséminées, la modification de la dynamique MT pour évaluer leur rôle lors de l’invasion GBM et l’analyse des données acquises.

Introduction

La motilité cellulaire est un processus stéréotypé nécessitant l’établissement d’un axe de polarité et des réarrangements cytosquelettiques générateurs de force. La polymérisation de l’actine et son association avec la myosine sont reconnues comme les principaux contributeurs aux forces protrusives et contractiles nécessaires au mouvement cellulaire¹. Les microtubules sont considérés comme les principaux acteurs de la polarisation cellulaire et de la persistance directionnelle pendant la migration². Ces dernières années, il a également été démontré que les MT créent et stabilisent des protubérances pour soutenir les forces mécanocompressives lors de l’invasion cellulaire en 3D³. Plus récemment, les MT ont été directement impliquées dans la mécanotransduction aux adhérences focales et la migration mécanosensible⁴. L’instabilité dynamique qui caractérise la dynamique terminale MT-plus est constituée de phases répétées de polymérisation (croissance) et de dépolymérisation (retrait), qui sont contrôlées par une pléthore de protéines de liaison aux microtubules et de cascades de signalisation intracellulaires, telles que celles régies par les RHO-GTPases ^5,6,7. Le rôle du réseau MT dans la migration et l’invasion cellulaire a fait de l’étude de la dynamique de la MT un élément clé pour mieux comprendre les mécanismes de la localisation des cellules immunitaires, de la cicatrisation des plaies et de l’invasion du cancer.

La capacité des cellules cancéreuses à s’échapper du noyau tumoral primaire, à se propager dans les tissus et à générer des tumeurs secondaires est une étape cruciale pour empêcher le succès mondial dans la guerre contre le cancer déclarée il y a 50 ans ^8,9. L’un des plus grands obstacles a été de comprendre comment les cellules cancéreuses envahissent activement le tissu. Les principaux mécanismes d’invasion reposent sur les mêmes principes que ceux régissant la migration des cellules non tumorales¹⁰. Cependant, des spécificités de migration des cellules cancéreuses ont^émergé11, déclenchant la nécessité d’une meilleure caractérisation de ce type de migration. Plus précisément, parce que le microenvironnement tumoral apparaît comme un acteur clé de la progression du cancer¹², l’observation et l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses dans un contexte physiologique pertinent sont essentielles pour démêler les mécanismes de dissémination des cellules cancéreuses.

Les MT sont essentielles à la progression du cancer, pour soutenir à la fois la prolifération et l’invasion. Une analyse précise de la dynamique de la MT in situ peut aider à identifier les agents altérant la MT (MTA) dans les deux processus. La dynamique de la traduction automatique varie considérablement en fonction d’un changement d’environnement. In vitro, le traitement avec des agents déstabilisants MT tels que le nocodazole empêche la formation de saillies cellulaires lorsque les cellules sont intégrées dans des gels en 3D, alors qu’il a peu d’effet sur la migration cellulaire 2D^13,14. Bien que techniquement difficiles, les progrès de l’imagerie intravitale permettent une analyse in vivo de la dynamique de la MT pendant l’invasion des cellules cancéreuses. Par exemple, l’observation des MT dans les cellules de fibrosarcome xénogreffées par voie sous-cutanée chez la souris a révélé que les macrophages associés aux tumeurs affectent la dynamique de la MT dans les cellules tumorales¹⁵. Cependant, ces modèles murins impliquent des procédures chirurgicales étendues et restent insatisfaisants pour les cancers moins accessibles, tels que la tumeur cérébrale hautement invasive, GBM.

Malgré un temps de survie moyen lamentable de 15 mois¹⁶, on sait peu de choses sur le mode de dissémination du GBM dans le parenchyme cérébral ou sur les éléments moléculaires clés soutenant l’invasion des cellules GBM dans le tissu cérébral. L’amélioration du modèle de xénogreffe orthotopique de souris (PDX) et l’établissement de fenêtres crâniennes ont offert de nouvelles perspectives pour les études d’invasion cellulaire GBM^17,18. Cependant, en raison de la qualité d’imagerie sous-optimale, ce modèle a principalement permis l’imagerie longitudinale de xénogreffes superficielles et n’a pas été utilisé avec succès pour étudier l’imagerie subcellulaire des protéines du cytosquelette jusqu’à présent. De plus, à la suite de l’injonction des « 3R » visant à réduire l’utilisation des rongeurs et à les remplacer par des vertébrés inférieurs, des modèles alternatifs ont été établis.

Profitant de l’immunité primitive observée chez les larves de poisson zèbre (Danio rerio), l’injection orthotopique de cellules GBM dans le cerveau des poissons a été développée 19,20,21. L’injection au voisinage des ventricules dans le mésencéphale en développement récapitule la majeure partie de la physiopathologie du GBM humain²¹, et le même schéma préféré d’invasion du GBM que chez les humains - cooptation des vaisseaux - est observé²². Grâce à la transparence des larves de poissons, ce modèle permet de visualiser les cellules GBM envahissant le cerveau à partir des zones péri-ventriculaires où la plupart des GBM apparaîtraient²³.

Étant donné que les MT sont essentielles pour l’invasion cellulaire du GBM in vitro^24,25, une meilleure caractérisation de la dynamique de la magnétothérapie et l’identification des régulateurs clés pendant l’invasion cellulaire sont nécessaires. Cependant, à ce jour, les données générées avec le modèle orthotopique du poisson zèbre n’ont pas inclus l’analyse subcellulaire de la dynamique de la magnétoscopie pendant le processus d’invasion. Cet article fournit un protocole pour étudier la dynamique de la MT in vivo et déterminer son rôle lors de l’invasion du cancer du cerveau. Après un marquage stable des microtubules, les cellules GBM sont microinjectées à 3 dpf dans le cerveau des larves de poisson zèbre et imagées en temps réel à haute résolution spatio-temporelle au cours de leur progression dans le tissu cérébral. L’imagerie en direct des MT fluorescentes permet l’analyse qualitative et quantitative de la dynamique de la MT plus-end. De plus, ce modèle permet d’évaluer en temps réel l’effet des MTA sur la dynamique de la MT et sur les propriétés invasives des cellules GBM. Ce protocole relativement non invasif combiné à un grand nombre de larves manipulées à la fois et à la facilité d’application du médicament (dans l’eau des poissons) fait du modèle un atout pour les essais précliniques.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives de l’Union européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale de l’Institut Pasteur - CEEA 89 et le ministère Français de la Recherche et de l’Éducation (permis #01265.03). Lors d’injections ou de séances d’imagerie en direct, les animaux ont été anesthésiés Tricaine.At la fin des procédures expérimentales, ils ont été euthanasiés par surdosage anesthésique. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, l’équipement et les logiciels utilisés dans ce protocole. Le flux de travail général du protocole est décrit à la figure 1.

1. Génération de cellules de glioblastome exprimant de façon stable α-tubuline-mKate2

REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées dans une armoire de biosécurité BSL2+.

1. Produire des particules lentivirales exprimant la tbuline mKate2-en utilisant la méthode au phosphate de calcium pour la transfection de 7 × 10^{6 cellules} HEK-293T.
   1. Dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, ajouter 10 μg de plasmide d’emballage psPAX2 de 2e génération, 5 μg de plasmide d’enveloppe virale pMD2.G et 10 μg du plasmide d’intérêt, pGK-mKate2-tubuline humaine α1a avec 50 μL^de CaCl 2 (_2,5 M stock). Ajuster à 500 μL avec du_H2Ostérile sans ADNase.
      REMARQUE: Il est important d’ajouter CaCl₂ en dernier.
   2. Mélanger en retournant le tube plusieurs fois et incuber pendant 20 min à température ambiante (RT).
   3. Pendant l’incubation, préparer un autre tube microcentrifuge de 1,5 mL avec 500 μL de solution saline tamponnée HEPES (HBS), pH 7,0 (2x).
   4. Après 20 min, ajouter le mélange CaCl₂/ADN goutte à goutte dans la solution HBS (2x). Mélanger en inversant le tube plusieurs fois. Incuber pendant 12 min à TA.
   5. Après 12 min, ajouter doucement le CaCl₂/ADN mélangé avec HBS directement sur une boîte confluente à 70% de cellules HEK-293T de 10 cm, goutte à goutte.
   6. Laisser les cellules dans l’incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 36-48 h.
   7. Recueillir le surnageant et le faire tourner vers le bas à 3 000 × g pendant 5 minutes pour éliminer les débris cellulaires.
   8. Pour concentrer les particules virales, chargez le surnageant dans un tube à ultracentrifugation et faites-le tourner vers le bas à 47 508 × g pendant 90 min à 4 °C.
   9. Jetez le surnageant et placez le tube à l’envers sur du papier pour sécher l’intérieur du tube.
   10. Ajouter 30 μL de PBS sur la pastille virale. Ne pas remettre le granulé en suspension. Laisser à 4 °C pendant 2 h.
   11. Remettez doucement les particules virales en train de pipeter de haut en bas. Évitez de faire des bulles. Conserver à -80 °C.
       REMARQUE: De plus grandes quantités de particules virales peuvent être produites en transfectant plusieurs plaques de cellules HEK-2-93T.
2. Infecter les cellules de glioblastome avec des particules lentivirales.
   REMARQUE: Ce protocole est écrit pour les lignées cellulaires de glioblastome commerciales telles que U-87 MG, U-373 MG ou T98. Pour utiliser des cellules de glioblastome primaires dérivées du patient, utiliser un revêtement spécifique des plaques et un milieu non à base de sérum²⁶.
   1. Préparer une boîte confluente de 10 cm à 70 % de cellules de glioblastome U-87 MG cultivées dans le milieu essentiel minimal (MEM) d’Eagle, complétée par 10 % de sérum de veau fœtal, de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 100 unités/mL pour la pénicilline et 100 μg/mL pour la streptomycine) et d’acides aminés non essentiels (1x).
   2. Ajouter les particules virales à une dilution de 1 sur 5 000 directement sur les cellules. Mélanger avec un léger tourbillon. Laissez les virus infecter les cellules pendant 20 heures au maximum.
   3. Retirez le milieu contenant le virus et remplacez-le par un milieu de culture frais. Laisser l’expression de la tubuline marquée pendant 48-72 h.
      NOTE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité BSL2.
   4. FACS-trier les cellules pour sélectionner les 15% les plus brillants de cellules mKate2⁺ . Après avoir enlevé les débris et les cellules doublet à l’aide de la diffusion avant et latérale (FCS vs SSC), appliquez un autre gating sur ^{les cellules} mKate2+ les plus brillantes à 30 % pour conserver les 15 % supérieurs.
   5. Amplifiez les cellules marquées par MT.
      NOTE: Alternativement, la sélection clonale basée sur des niveaux élevés de tubuline-mKate2 peut être effectuée sous un microscope à épifluorescence.

2. Préparer les larves de poisson zèbre pour la micro-injection

1. Générez des œufs de poisson zèbre.
   1. Placez trois mâles et quatre femelles de la souche de poisson-zèbre désirée dans un bassin d’accouplement complété par des billes 4 jours avant la xénotransplantation, en fin d’après-midi.
      REMARQUE: Les lignes Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) ou Tg(Huc:gfp) sont utilisées pour marquer les vaisseaux endogènes, les cellules souches neurales / astrocytes et les neurones, respectivement.
   2. Récoltez les œufs produits par le frai induit par le marbre le lendemain matin.
   3. Nettoyez les œufs en les transférant dans un tube à centrifuger de 50 ml rempli d’eau minérale²⁷ additionnée d’eau de Javel (0,004 % final). Retourner doucement le tube pendant 5 min. Laver deux fois avec de l’eau minérale seulement.
   4. Transférer les œufs dans une boîte de Pétri contenant de l’eau minérale additionnée de 0,28 mg/mL de bleu de méthylène.
   5. Retirez les œufs non fécondés et dont le développement est arrêté. Incuber les embryons à 28 °C.
2. Créez des larves transparentes.
   1. Introduire la N-phénylthiourée (PTU) (0,003% final) dans le milieu 8 h plus tard, pour prévenir la pigmentation de la mélanine et assurer la transparence optique. Gardez le PTU dans le milieu pour le reste du protocole.
      REMARQUE : Étant donné que le traitement par PTU peut causer des anomalies du développement, ne sélectionner que les larves normalement développées pour la xénotransplantation. Comme alternative au traitement chimique, on peut utiliser la souche mutante de poisson-zèbre casper (double mutant nacre et roy orbison), dans laquelle la pigmentation est absente²⁸.
   2. Augmenter la température d’incubation à 29 °C.
   3. Augmenter la température chaque jour de 1 °C afin que les larves de 3 dpf atteignent 32 °C le jour de l’injection.
3. Préparez la plaque de micro-injection.
   1. Préparer 20 mL d’agarose à 1 % + 0,28 mg/mL de bleu de méthylène avec de l’eau minérale.
   2. Versez l’agarose dans une boîte de Petri de 10 cm et appliquez rapidement le moule en plastique de micro-injection à l’envers pour créer des tranchées en forme de V de 2,5 mm de large (Figure 2B).
      REMARQUE: Le moule en plastique est disponible dans le commerce ou peut être construit en interne selon la conception décrite dans le livre²⁹ du poisson zèbre.
   3. Retirez soigneusement le moule en plastique lorsque l’agarose s’est solidifiée.
      REMARQUE: Les plaques moulées à micro-injection peuvent être conservées à 4 ° C jusqu’à 2 mois.
4. Préparer les larves pour la xénotransplantation.
   1. Le jour de l’injection, dépister l’expression du transgène fluorescent sélectionné chez les 3 larves de dpf. Enlevez les animaux non fluorescents et d’apparence anormale.
   2. Déchorionner les larves manuellement avec des pinces d’horloger à pointe fine. À 3 dpf, percez ou déchirez doucement les chorions avec deux paires de pinces à pointe fine pour libérer les larves du chorion.
      REMARQUE: Alternativement, un traitement enzymatique avec la pronase A peut être utilisé pour déchorioner les larves, généralement à 24 hpf.
   3. Maintenir les larves déchorionnées dans un milieu d’eau minérale avec du bleu de méthylène (0,28 mg/mL) et du PTU (0,003 % final).

3. Procédure de xénotransplantation

1. Préparez des aiguilles de micro-injection.
   1. Prenez un capillaire en verre borosilicaté sans filament central et placez-le dans un extracteur d’aiguille vertical.
   2. En utilisant les réglages suivants - augmenter 8,5 et chauffer 3 - étirer le capillaire pour le transformer en aiguille de micro-injection.
2. Configurez le micro-injecteur.
   1. Charger l’huile minérale dans un micro-injecteur manuel. Enlevez les bulles d’air.
   2. Branchez un support capillaire universel au micro-injecteur et fixez-le fermement à un micromanipulateur mécanique (Figure 2A).
3. Récolter les cellules du glioblastome.
   REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées dans une enceinte de biosécurité BSL2.
   1. Préparez une plaque de 10 cm de cellules de glioblastome afin qu’elles atteignent 80% de confluence le jour de la transplantation.
   2. (Facultatif) Marquez transitoirement les noyaux cellulaires en ajoutant Hoechst 35480 (200 ng / mL) aux cellules. Incuber pendant 20 min à 37 °C dans l’incubateur cellulaire humidifié et laver 2x avec du PBS.
   3. Sortez la plaque de cellules de l’incubateur et lavez-la une fois avec du PBS. Détacher les cellules en ajoutant 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % et en incubant pendant 5 à 10 minutes à 37 °C dans l’incubateur cellulaire jusqu’à ce que toutes les cellules soient complètement détachées.
      REMARQUE: Cette étape est essentielle car une mauvaise trypsinisation entraînera le blocage des agrégats cellulaires dans l’aiguille.
   4. Resuspendre les cellules dans 5 mL de milieu cellulaire de glioblastome complet dans un tube à centrifuger de 50 mL. Ajouter 45 ml de PBS glacé et centrifuger à 134 × g pendant 5 min.
   5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 1 mL de PBS glacé en les pipitant de haut en bas soigneusement.
      NOTE: Cette étape de dissociation mécanique aide grandement à prévenir le risque de colmatage dans le capillaire lors de la micro-injection.
   6. Ajouter 49 ml de PBS glacé et centrifuger à 134 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de PBS glacé. Conserver sur de la glace pendant toute la durée de la procédure de transplantation.
4. Microinjecter les cellules du glioblastome dans le mésencéphale des larves de poisson zèbre.
   1. Remplir une plaque moulée de microinjection avec 6 mL de E3-milieu³⁰ complété par 160 mg/L de tricaïne.
   2. Transférer une douzaine de larves déchorionnées dans la plaque de micro-injection. Une fois qu’ils ne répondent pas au toucher, alignez-les dans les tranchées sur le côté, la tête haute, et le sac vitellin poussé contre le mur de la tranchée, avec un pinceau de taille 00 (Figure 2B,C).
   3. Remettez les cellules du glioblastome en suspension. Chargez 5 μL de cellules dans le microcapillaire à l’aide d’embouts de microcharge et insérez le capillaire dans le support capillaire universel.
   4. Placez la plaque de microinjection contenant les larves qui ne répondent pas sous le stéréomicroscope. Placez l’extrémité du microcapillaire sur le bord de la plaque de micro-injection à l’aide des boutons du micromanipulateur. Casser avec un scalpel pour créer un point d’entrée pointu, à peu près de la taille du diamètre d’une cellule.
   5. Vérifiez que les cellules s’écoulent hors du capillaire en faisant couler doucement de l’huile dans le micro-injecteur et en plongeant l’extrémité de l’aiguille dans le milieu. Concentrez les cellules à l’extrémité du capillaire pour maximiser le nombre de cellules injectées par volume éjecté et éviter de remplir le tissu cérébral avec du PBS (Figure 2C).
   6. Examinez attentivement les cellules qui sortent du microcapillaire lorsque l’huile est introduite manuellement dans l’injecteur. Définissez empiriquement le tour nécessaire sur le bouton manuel pour fournir 20 à 50 cellules. En règle générale, si les cellules sont suffisamment concentrées, un tour doux suffit pour éjecter ~10 cellules.
      REMARQUE: Si le liquide ne s’écoule pas correctement hors du microcapillaire, essayez de desserrer la fixation du microcapillaire dans le support capillaire. Ce faisant, l’huile pourrait fuir et s’égoutter le long du capillaire.
   7. Approchez l’extrémité du capillaire contre le tectum optique gauche (OT), juste au-dessus de la veine cérébrale moyenne (MCeV, Figure 2F).
   8. Pressez doucement le capillaire contre les larves jusqu’à ce que la membrane cutanée se brise (Figure 2D,E).
      REMARQUE: Ne poussez pas trop fort car cela entraînerait l’injection des cellules trop profondément dans le cerveau où la clarté optique inférieure empêchera d’observer les MT en détail. La technique d’imagerie est possible pour une profondeur atteignant 250-300 μm. Cependant, il est recommandé de ne pas injecter à plus de 100 μm de profondeur de la surface du poisson.
   9. Une fois qu’une position appropriée dans l’OT est atteinte, éjectez les cellules. Observez attentivement l’extrémité du capillaire pour visualiser le flux de cellules entrant à l’intérieur de l’animal, assurant ainsi une injection réussie.
      REMARQUE : Veillez à ne pas injecter dans les ventricules (Figure 2E). Une fois dans les ventricules, les cellules ont tendance à s’accumuler et à rester coincées au lieu de s’infiltrer dans le tissu (Figure 2I). L’injection ventriculaire est caractérisée par un gonflement intense du cerveau et une dissémination observable des cellules injectées dans le cerveau antérieur et le cerveau postérieur (Figure 2J).
   10. Répétez la procédure des étapes 3.4.9 à 3.4.11 pour autant d’animaux que nécessaire. Procéder rapidement pour éviter l’agglutination des cellules dans le capillaire.
       REMARQUE: Selon la vitesse à laquelle l’expérimentateur s’injecte, un changement d’aiguille peut être nécessaire toutes les 10 à 20 larves.
   11. Une fois la xénotransplantation terminée, retirer les larves de la plaque de microinjection et les isoler dans une plaque de 24 puits remplie d’eau de source minérale + PTU + milieu bleu de méthylène.
   12. Valider la réussite de l’injection en observant les larves sous un stéréomicroscope fluorescent (Figure 2G). Sélectionner uniquement les xénogreffes contenant une seule masse tumorale formée de 20 à 50 cellules situées dans les 200 μm supérieurs (en z) de l’OT (Figure 2H vs injection infructueuse sur la Figure 2I-K).
       NOTE: Le rendement des xénogreffes localisées avec succès varie de 10% au début à presque 100% avec la pratique.
   13. Laisser les larves récupérer pendant au moins 4 h à 32 °C avant l’imagerie.
       REMARQUE: L’ajout d’antibiotiques dans le milieu n’augmente pas le taux de survie des larves. À ce stade, si la micro-injection a été correctement effectuée, près de 100% des poissons survivent.

4. Imagerie intravitale des xénogreffes de glioblastome

1. Montez les larves pour l’imagerie en direct.
   REMARQUE: Les larves peuvent être imagées à partir de 4 heures après l’injection (hpi). L’imagerie en direct de la MT est généralement réalisée à partir de 20 hpi, lorsque les cellules GBM invasives ont commencé à étendre les saillies et à migrer loin de la masse tumorale.
   1. Préparer une solution d’agarose à bas point de fusion à 1 %. Transvaser 500 μL de solution d’agarose bouillie à bas point de fusion à 1 % dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et laisser refroidir à 37 °C sur un bloc thermique. Ajouter la tricaïne (112 μg/mL) à l’agarose et bien mélanger.
   2. Transférer une à quatre larves xénogreffées dans une boîte de Petri de 3,5 cm remplie d’eau minérale + PTU + milieu méthylène complété par de la tricaïne (112 μg/mL). Une fois que les larves ne répondent pas au toucher, transférez-les soigneusement dans le tube contenant l’agarose et la tricaïne à l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine.
      NOTE: Maintenir le volume de milieu au minimum pour limiter la dilution de l’agarose.
   3. Mélangez délicatement les larves avec l’agarose. À l’aide d’une pipette de transfert normale (grande ampoule), placer les larves mélangées dans l’agarose au centre d’une antenne parabolique d’imagerie vidéo à fond de verre de 3,5 cm. Sous un stéréomicroscope, positionnez rapidement les larves sur son dos à l’aide d’une pointe de microchargement pour manipuler le poisson.
      REMARQUE: Parce qu’un microscope confocal à disque rotatif inversé est utilisé pour l’imagerie cérébrale intravitale dans ce protocole, les larves sont montées dorsalement. Ajustez le positionnement des larves en conséquence si vous utilisez un microscope confocal vertical.
   4. Enlevez l’agarose supplémentaire pour maintenir la couche d’agarose la plus mince possible. Une fois l’agarose solidifiée, ajouter 2,5 mL d’eau de source minérale + PTU + 0,2x tricaïne (milieu imageur) et passer à l’étape suivante.
2. Imagerie in vivo en direct de la dynamique de la MT dans les cellules envahissantes du glioblastome
   REMARQUE: La qualité optique des images dépend grandement de la performance du microscope utilisé. Le protocole est écrit pour un microscope confocal à disque rotatif inversé équipé d’une caméra sCMOS (taille des pixels 6,5 μm, 2048 x 2044 pixels), d’un objectif à longue distance de travail et d’une chambre environnementale à température contrôlée.
   1. Placer la boîte d’imagerie vidéo contenant les larves xénogreffées incrustées d’agarose dans la chambre environnementale d’un microscope confocal inversé, à une température réglée à 32 °C. Trouvez les larves dans la parabole d’imagerie vidéo avec un objectif 10x, à l’aide d’une scène XY motorisée.
   2. Appuyez sur l’ESC pour abaisser la tourelle des objectifs, ajoutez de l’huile minérale sur un objectif d’huile 60x (1,4 NA, distance de travail : 0,13 mm) et appuyez sur ESC pour revenir à la position focale initiale.
   3. Observez les cellules envahissantes du glioblastome dans le canal rouge (source laser 561 nm, puissance laser de 20 %, temps d’exposition : 200 ms) et sélectionnez une cellule avec un réseau de MT étalé et des filaments de MT facilement discernables (Figure 3B).
   4. Définissez les paramètres de la série z. À l’aide d’un étage piézoélectrique de 200 μm, sélectionnez les positions supérieure et inférieure du réseau MT : une pile z de 10 à 30 μm de profondeur suffit pour visualiser le réseau de microtubules dans la saillie de la cellule migrante, avec un pas de tranche z de 0,3 μm.
   5. Définissez les paramètres d’acquisition time-lapse pour permettre un équilibre optimal entre la vitesse d’acquisition, la profondeur de la pile z et le signal fluorescent afin d’éviter un photoblanchiment rapide. Obtenez des images de MT toutes les 5-10 s pendant plusieurs minutes. Acquérir et enregistrer l’hyperpile 5D (x,y,z,t,c).
      REMARQUE: Pour éviter les dérives en z lors de l’acquisition, utilisez un microscope équipé d’un système de mise au point parfait comme stabilisation matérielle de la mise au point.
3. (Facultatif) Déterminer les effets des agents altérant les microtubules (ATM) sur les MT.
   REMARQUE: Les étapes suivantes permettent de tester les effets des MTA sur un réseau de MT dans la migration des cellules de glioblastome en temps réel.
   1. Retirez délicatement le support d’imagerie de l’antenne d’imagerie vidéo. Ne touchez pas le fond du plat, car la position xyz sera perdue.
   2. Préparer un nouveau milieu d’imagerie contenant le MTA à différentes concentrations. Ajouter doucement le support contenant du MTA dans la parabole d’imagerie vidéo goutte à goutte.
   3. Acquérir des films à long terme (2-16 h, une image toutes les 10-20 min) pour observer les effets de chaque concentration de MTA sur le réseau de MT et la migration cellulaire (Figure 4A).
   4. (Facultatif) Lavez l’AMT en retirant doucement le milieu et en ajoutant 2,5 ml de milieu d’imagerie frais sans le MTA. Répétez la procédure de lavage 3x pour éliminer toute trace de MTA dans le milieu.
   5. (Facultatif) Acquérir un film à long terme similaire à celui de la section 4.3.3 (figure 4B).
      REMARQUE : Les étapes ci-dessus déterminent la concentration minimale modifiant le réseau MT sans affecter la survie des larves. Les étapes de lavage définissent si l’effet du médicament est réversible.
4. Évaluer l’impact de la MTA sur l’invasion du glioblastome par imagerie séquentielle.
   1. Suivez les étapes 4.1 à 4.2.1 4 h après la micro-injection.
      REMARQUE: Cette partie du protocole peut également être réalisée avec d’autres lignées cellulaires de glioblastome marquées par fluorescence. Idéalement, co-marquer le GBM avec une étiquette cytosolique et une étiquette de noyau pour assurer la détection de la morphologie globale de la cellule.
   2. Passez à un objectif d’eau 40x longue distance (NA: 1,15, WD: 0,6 mm).
   3. Définissez la gamme z-series pour acquérir la région OT. Acquérir le z-stack à l’aide d’une caméra sCMOS haute sensibilité (taille des pixels 11 μm, 1 200 x 1 200 pixels, efficacité quantique 95%).
      REMARQUE: La pile z commence généralement à la partie la plus dorsale de l’OT (près de la surface) et se termine assez profondément dans le cerveau pour inclure toute la masse cellulaire tumorale.
   4. Retirez l’antenne parabolique d’imagerie vidéo du microscope. Libérez les larves de l’agarose à l’aide d’une pointe de microchargement et en piquant doucement l’agarose autour de l’animal.
      NOTE: Comme les larves de 3 dpf sont encore très fragiles, soyez prudent lorsque vous les retirez de l’agarose.
   5. Une fois que l’animal est libéré de l’agarose, transférez-le doucement dans un seul puits d’une plaque de 24 puits remplie d’eau de source minérale + bleu de méthylène + milieu PTU. Marquez le puits pour identifier les larves en vue d’une imagerie ultérieure.
   6. Ajouter l’ATM d’intérêt dans le milieu à la concentration déterminée précédemment (étape 4.3.3). Rafraîchir le milieu complété avec le médicament tous les jours. Répétez la procédure d’imagerie des étapes 4.4.1 à 4.4.5 tous les jours pendant 3-4 jours.

5. Analyse d’images

1. Analysez la dynamique de la traduction automatique avec des plugins FIJI disponibles gratuitement.
   NOTE: De nombreuses revues et protocoles décrivent les méthodes d’analyse de la dynamique MT dans les cellules^31,32,33,34 et peuvent être appliqués à ce stade. Ce protocole fera brièvement référence à deux méthodes pour mesurer les propriétés dynamiques de base de la traduction automatique.
   1. Ouvrez l’hyperpile 5D et générez une pile 4D où les z-slices ont été projetées dans un seul plan pour créer une projection d’intensité maximale (MIP) en z (Image | Piles | Projet Z | Intensité maximale) (figure 3B).
   2. Ouvrez la pile MIP 4D et suivez manuellement la fin d’une traduction automatique basée sur la saillie à l’aide de la fonction de suivi manuel dans FIJI (Plugins | Suivi | Suivi manuel). (Figure 3D). Extrayez les paramètres de la dynamique MT tels que la vitesse de croissance, la vitesse de retrait, la fréquence de sauvetage et la fréquence des catastrophes.
   3. Vous pouvez également tracer une ligne segmentée de 10 pixels de large le long de la MT à analyser (Figure 3B). Utilisez la fonction Multi Kymograph (Analyser | Multi Kymographe) (Figure 3C) dans FIJI. Observez et mesurez les phases de croissance de la MT (G), la durée des pauses (P) et la fréquence des catastrophes de MT.
2. Analyse de l’invasion à long terme du glioblastome
   REMARQUE: Cette analyse nécessite l’utilisation de la visualisation et de l’analyse 4D avec un logiciel de bioimagerie.
   1. Convertissez la pile z 4D brute de l’étape 4.4.3 (4 hpi) dans le format logiciel approprié, à l’aide du logiciel File Converter.
   2. Ouvrez le logiciel et importez le fichier z-stack converti dans la vue Surpass (Figure 5A).
   3. Pour segmenter les cellules tumorales et éliminer l’autofluorescence non pertinente dans le canal rouge, cliquez sur Ajouter de nouvelles surfaces et suivez le processus en 5 étapes.
      1. Validez les paramètres par défaut en cliquant sur la flèche suivante une fois que la fenêtre apparaît. Passez à l’étape 2/5.
         REMARQUE: Si le signal fluorescent est acquis dans le canal 561, l’autofluorescence de la pigmentation résiduelle dans l’œil peut être forte et modifier le processus de segmentation automatique. Ceci est problématique si la xénogreffe est située près de l’œil. Dans ce cas, la segmentation doit être terminée manuellement en coupant et en supprimant les signaux de cellules autres que le glioblastome.
      2. Accédez à Canal source | canal 561. Lissez l’image (filtre gaussien) en ajoutant 1,50 μm dans Détails des surfaces et en ajoutant 2,5 μm pour le diamètre des sphères dans l’arrière-plan Soustraire. Cliquez sur la flèche suivante et passez à l’étape 3/5.
      3. En fonction de l’intensité du signal, ajustez manuellement le seuil (soustraction d’arrière-plan) pour inclure chaque processus cellulaire. Passez à l’étape 4/5.
      4. Filtrez le signal segmenté en supprimant les événements qui ne représentent pas une partie d’une cellule (par exemple, les débris, l’autofluorescence). Cliquez sur Type de filtre | volume et ajustez le seuil manuellement pour exclure tous les événements sous le plus petit volume représentant une partie d’une cellule. Passez à l’étape 5/5.
         REMARQUE: Si les signaux d’autofluorescence sont plus volumineux que la plus petite partie de cellule, procédez quand même et supprimez manuellement les signaux indésirables en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en les supprimant .
      5. Supprimez l’étape de classification et terminez l’assistant de segmentation en cliquant sur la double flèche verte pour terminer la création d’une vue de surface des cellules tumorales (Figure 5B).
   4. Si les cellules segmentées ne se touchent pas et ne forment pas un objet unique, fusionnez-les artificiellement pour créer un objet de masse de cellules tumorales. En bref, cliquez sur Statistiques | des valeurs détaillées | spécifiques | volume. Sélectionnez tous les événements en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur celui du haut, puis en maintenant la touche Maj enfoncée et en cliquant avec le bouton gauche sur le dernier. Naviguez pour modifier | sélection | unifier.
   5. Définir le centroïde de la masse cellulaire tumorale. Cliquez sur Ajouter de nouveaux spots | Ignorer la création automatique | Ajouter (le curseur croise avec) | Centre de l’objet. Maintenez la touche Maj enfoncée et faites un clic gauche pour créer la tache , qui est le centroïde de la masse cellulaire tumorale segmentée.
   6. Mesurer la distance 3D entre chaque cellule GBM et le centroïde de la masse tumorale. Pour ce faire, créez une distance au canal centroïde en restant sur la vue Spot et en sélectionnant l’icône de l’outil | Transformation de distance. Attendez qu’une nouvelle distance au canal centroïde soit créée, à côté du canal 488 et du canal 561 (en bleu, Figure 5C).
      REMARQUE: L’intensité de chaque voxel dans ce canal correspond à la distance 3D entre le voxel et le centroïde de la masse cellulaire tumorale.
   7. Mesurez la distance 3D au centroïde de chaque cellule segmentée en cliquant sur Ajouter de nouveaux spots | Ignorer la création automatique | Ajouter (le curseur croise avec) | Canal spécifique 561. Maintenez la touche Maj enfoncée et faites un clic gauche sur la zone du noyau cellulaire. Effectuez cette tâche pour chaque cellule (Figure 5D).
      Remarque : Supprimez la vue Surface pour mieux apprécier le signal de fluorescence des cellules. Alternativement, le cas échéant, utilisez le signal du noyau (signal de 405 nm ou 647 nm) pour une meilleure précision.
   8. Cliquez sur Statistiques | | détaillées Valeurs spécifiques | intensité moyenne Ch=distance au centroïde.
      REMARQUE: La valeur de l’intensité est la distance 3D en μm entre la zone du noyau cellulaire et le centroïde.
   9. Faites la moyenne de ces intensités pour calculer le rayon de la masse tumorale à 4 hpi. Répétez la procédure pour chaque point temporel de l’analyse (24 hpi, 48 hpi et 72 hpi).
      REMARQUE: Ne mesurez que les 10 ou 20 cellules les plus disséminées pour éviter de sous-estimer l’invasion cellulaire. En effet, le compactage forcé des cellules lors de l’injection peut empêcher les cellules situées au centre de la masse tumorale de migrer.
   10. Calculer l’indice d’invasion (II) comme le rapport entre les distances 3D moyennes à t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi des cellules les plus disséminées sur le rayon moyen de la masse tumorale à t = 4 hpi (Figure 5E).

Résultats

Pour analyser le rôle joué par les MT lors de l’invasion in vivo du GBM, nous décrivons ici les principales étapes pour effectuer un marquage MT stable dans les cellules GBM par infection lentivirale, la xénotransplantation orthotopique de cellules GBM chez 3 larves de poisson-zèbre dpf, l’imagerie intravitale à haute résolution de la dynamique MT, le traitement MTA et ses effets sur l’invasion GBM, et l’analyse d’images de la dynamique MT et de l’invasion in vivo (

Discussion

L’imagerie des xénogreffes tumorales à une résolution unicellulaire est susceptible de devenir un outil indispensable pour améliorer notre compréhension de la biologie du GBM. L’imagerie en direct dans des modèles PDX murins a conduit à des découvertes précieuses sur la façon dont le GBM envahit collectivement le tissu cérébral¹⁸. Cependant, à ce jour, la résolution spatio-temporelle n’est pas assez élevée pour révéler la dynamique des protéines contrôlant l’invasion du...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum	Eurobio	CVFSVF00-01	Reagent
MEM NEAA	Gibco	11140-050	Reagent
Modified Eagle's medium	Eurobio	CM1MEM18-01	Reagent
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Reagent
U-87 MG	ECACC	89081402-1VL	Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III	BD bioscience		Instrument
BD FACSDiva software v8.0	BD bioscience		Software
HEK-293T	Merck	12022001	Cells
pMD2.G	Addgene	Plasmid #12259	Reagent
psPAX2	Addgene	Plasmid #12260	Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80	Beckman Coulter		Instrument
Cell passaging and staining
dPBS	Gibco	14190-094	Chemical
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054	Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC	LEICA	https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/	Instrument
Methylene Blue hydrate	Sigma-Aldrich	M4159	Chemical
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-25G	Chemical
Transfer Pipettes fine tips	Samco Scientific	232	Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL	Samco Scientific	225	Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	Cat#: A5040	Chemical
Volvic Source Water	DUTSCHER DOMINIQUE SAS	999556	Reagent
Xenotransplantation
24-well plate	TPP	92024	Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)	Harvard Apparatus	(#30-0017 GC100-15	Equipment
CellTram oil vario microinjector	Eppendorf	5176000.025	Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL	Eppendorf	5242956003	Equipment
Micromanipulator	NARISHIGE	https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html	Equipment
Mineral Oil	Sigma	M8410-100ml	Equipment
Stereomicroscope	Olympus	KL 2500 LCD	Instrument
Universal capillary holder	Eppendorf	5176190002	Equipment
Vertical Pipette puller	KOPF (Roucaire)	Model 720	Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish	MatTek Life Sciences, MA, USA	P35G-1,5-14-C	Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21	Nikon		Software
Heat-Block	Techne	DRI-BLOCK DB-2D	Equipment
Microscope head Nikon Ti2E	Nikon		Instrument
sCMOS camera Prime 95B	Photometrics		Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4	Hammatsu		Instrument
Ultrapure Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit	Hammatsu		Instrument
Drug Treatment
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Chemical
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404-2MG	Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software	Oxford Instruments		Software
ImarisFileConverter 9.5.1	Oxford Instruments		Software