Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra

Riepilogo

Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .

Abstract

Con un triste tempo di sopravvivenza mediano nelle popolazioni reali - tra 6 e 15 mesi - il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale maligno più devastante. Il fallimento del trattamento è dovuto principalmente all'invasività delle cellule GBM, che parla della necessità di una migliore comprensione delle proprietà mobili GBM. Per studiare il meccanismo molecolare che supporta l'invasione del GBM, sono necessari nuovi modelli fisiologici che consentano una caratterizzazione approfondita della dinamica delle proteine durante l'invasione. Queste osservazioni aprirebbero la strada alla scoperta di nuovi bersagli per bloccare l'infiltrazione tumorale e migliorare i risultati dei pazienti. Questo articolo riporta come uno xenotrapianto ortotopico di cellule GBM nel cervello del pesce zebra consenta l'imaging dal vivo intravitale subcellulare. Concentrandoci sui microtubuli (MT), descriviamo una procedura per l'etichettatura MT nelle cellule GBM, la microiniezione di cellule GBM nel cervello trasparente delle larve di zebrafish 3 giorni dopo la fecondazione (DPF), l'imaging intravitale delle MT negli xenotrapianti disseminanti, l'alterazione della dinamica della MT per valutare il loro ruolo durante l'invasione GBM e l'analisi dei dati acquisiti.

Introduzione

La motilità cellulare è un processo stereotipato che richiede la creazione dell'asse di polarità e riarrangiamenti citoscheletrici generatori di forza. La polimerizzazione dell'actina e la sua associazione con la miosina sono riconosciute come i principali contributori alle forze protrusive e contrattili richieste per il movimento cellulare¹. I microtubuli sono considerati i principali attori della polarizzazione cellulare e della persistenza direzionale durante la migrazione². Negli ultimi anni, le MT hanno anche dimostrato di creare e stabilizzare protrusioni per supportare le forze di meccanocompressione durante l'invasione cellulare in 3D³. Più recentemente, le MT sono state direttamente coinvolte nella meccanotrasduzione alle aderenze focali e nella migrazione meccanosensibile⁴. L'instabilità dinamica che caratterizza la dinamica finale MT-plus è costituita da ripetute fasi di polimerizzazione (crescita) e depolimerizzazione (restringimento), che sono controllate da una pletora di proteine leganti i microtubuli e cascate di segnalazione intracellulare, come quelle governate dalle RHO-GTPasi ^5,6,7. Il ruolo della rete MT nella migrazione e nell'invasione cellulare ha reso lo studio delle dinamiche MT un elemento chiave per comprendere meglio i meccanismi di homing delle cellule immunitarie, guarigione delle ferite e invasione del cancro.

La capacità delle cellule tumorali di sfuggire al nucleo tumorale primario, diffondersi nei tessuti e generare tumori secondari è un passo fondamentale per prevenire il successo globale nella guerra contro il cancro dichiarata 50 anni fa ^8,9. Uno dei maggiori ostacoli è stato capire come le cellule tumorali invadono attivamente il tessuto. I meccanismi chiave di invasione si basano sugli stessi principi di quelli che governano la migrazione cellulare non tumorale¹⁰. Tuttavia, le specificità di migrazione delle cellule tumorali sono emerse¹¹, innescando la necessità di una migliore caratterizzazione di questo tipo di migrazione. In particolare, poiché il microambiente tumorale appare come un attore chiave nella progressione del cancro¹², osservare e analizzare l'invasione delle cellule tumorali in un contesto fisiologico rilevante è essenziale per svelare i meccanismi di disseminazione delle cellule tumorali.

Le MT sono fondamentali per la progressione del cancro, per sostenere sia la proliferazione che l'invasione. Un'analisi precisa della dinamica della MT in situ può aiutare a identificare gli agenti che alterano la MT (MTA) in entrambi i processi. Le dinamiche MT variano drasticamente in base a un cambiamento di ambiente. In vitro, il trattamento con agenti destabilizzanti MT come il nocodazolo previene la formazione di protrusione cellulare quando le cellule sono incorporate in gel in 3D, mentre ha scarso effetto sulla migrazione cellulare 2D^13,14. Sebbene tecnicamente impegnativi, i progressi nell'imaging intravitale consentono l'analisi in vivo della dinamica MT durante l'invasione delle cellule tumorali. Ad esempio, l'osservazione di MT in cellule di fibrosarcoma xenotrapiantate per via sottocutanea nei topi ha rivelato che i macrofagi associati al tumore influenzano la dinamica della MT nelle cellule tumorali¹⁵. Tuttavia, questi modelli murini comportano ampie procedure chirurgiche e rimangono insoddisfacenti per i tumori meno accessibili, come il tumore cerebrale altamente invasivo, GBM.

Nonostante un triste tempo medio di sopravvivenza di 15 mesi¹⁶, poco si sa sulla modalità di diffusione del GBM all'interno del parenchima cerebrale o sugli elementi molecolari chiave che sostengono l'invasione delle cellule GBM nel tessuto cerebrale. Il miglioramento del modello di xenotrapianto ortotopico murino (PDX) e la creazione di finestre craniche hanno offerto nuove prospettive per gli studi sull'invasione delle cellule GBM^17,18. Tuttavia, a causa della qualità di imaging non ottimale, questo modello ha permesso principalmente l'imaging longitudinale di xenotrapianti superficiali e finora non è stato utilizzato con successo per studiare l'imaging subcellulare delle proteine del citoscheletro. Inoltre, sulla scia dell'ingiunzione "3R" di ridurre l'uso di roditori e sostituirli con vertebrati inferiori, sono stati stabiliti modelli alternativi.

Sfruttando l'immunità primitiva osservata nelle larve di zebrafish (Danio rerio), l'iniezione ortotopica di cellule GBM nel cervello del pesce è stata sviluppata 19,20,21. L'iniezione in prossimità dei ventricoli nel mesencefalo in via di sviluppo ricapitola la maggior parte della fisiopatologia umana del GBM²¹, e lo stesso modello preferito di invasione GBM come nella cooptazione uomo-vaso - è osservato²². Grazie alla trasparenza delle larve di pesce, questo modello consente la visualizzazione delle cellule GBM che invadono il cervello dalle aree peri-ventricolari dove si pensa che la maggior parte dei GBM si verifichino²³.

Poiché le MT sono essenziali per l'invasione delle cellule GBM in vitro^24,25, è necessaria una migliore caratterizzazione della dinamica della MT e l'identificazione dei regolatori chiave durante l'invasione cellulare. Tuttavia, ad oggi, i dati generati con il modello ortotopico zebrafish non hanno incluso l'analisi subcellulare delle dinamiche MT durante il processo di invasione. Questo articolo fornisce un protocollo per studiare le dinamiche della MT in vivo e determinare il suo ruolo durante l'invasione del cancro al cervello. A seguito di una marcatura stabile dei microtubuli, le cellule GBM vengono microiniettate a 3 dpf nel cervello delle larve di zebrafish e visualizzate in tempo reale ad alta risoluzione spazio-temporale durante la loro progressione nel tessuto cerebrale. L'imaging live di MT fluorescenti consente l'analisi qualitativa e quantitativa delle dinamiche plus-end di MT. Inoltre, questo modello consente di valutare in tempo reale l'effetto degli MTA sulla dinamica della MT e sulle proprietà invasive delle cellule GBM. Questo protocollo relativamente non invasivo combinato con un gran numero di larve gestite alla volta e la facilità di applicazione del farmaco (nell'acqua del pesce) rende il modello una risorsa per i test preclinici.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida dell'Unione europea per la manipolazione di animali da laboratorio. Tutti i protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Institut Pasteur - CEEA 89 e dal Ministero della Ricerca e dell'Istruzione francese (permesso #01265.03). Durante le iniezioni o le sessioni di imaging dal vivo, gli animali sono stati anestetizzati con Tricaine.At la fine delle procedure sperimentali, sono stati eutanizzati da overdose di anestetico. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi ai materiali, alle attrezzature e al software utilizzati in questo protocollo. Il flusso di lavoro generale del protocollo è descritto nella Figura 1.

1. Generazione di cellule di glioblastoma che esprimono stabilmente α-tubulina-mKate2

NOTA: i seguenti passaggi vengono eseguiti in un armadio di biosicurezza BSL2+.

1. Produrre particelle lentivirali che esprimono mKate2-tubulina utilizzando il metodo del fosfato di calcio per la trasfezione di 7 × 10⁶ cellule HEK-293T.
   1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 10 μg di plasmide psPAX2 di^seconda generazione, 5 μg di plasmide dell'involucro virale pMD2.G e 10 μg del plasmide di interesse, pGK-mKate2-tubulina umana α1a con 50 μL di CaCl 2 (_2,5 M di stock). Regolare a 500 μL con H₂O sterile privo di DNAsi.
      NOTA: È importante aggiungere CaCl₂ per ultimo.
   2. Mescolare capovolgendo il tubo un paio di volte e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
   3. Durante l'incubazione, preparare un'altra provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 500 μL di soluzione salina tamponata HEPES (HBS), pH 7,0 (2x).
   4. Dopo 20 minuti, aggiungere la miscela CaCl₂/DNA goccia a goccia nella soluzione HBS (2x). Mescolare capovolgendo il tubo un paio di volte. Incubare per 12 minuti a RT.
   5. Dopo 12 minuti, aggiungere delicatamente il CaCl₂/DNA miscelato con HBS direttamente su un piatto confluente al 70% di 10 cm di cellule HEK-293T, goccia a goccia.
   6. Lasciare le celle nell'incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂ per 36-48 h.
   7. Raccogliere il surnatante e girarlo a 3.000 × g per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
   8. Per concentrare le particelle virali, caricare il surnatante in una provetta ultracentrifuga e farlo ruotare a 47.508 × g per 90 minuti a 4 °C.
   9. Scartare il surnatante e posizionare il tubo capovolto su carta per asciugare l'interno del tubo.
   10. Aggiungere 30 μL di PBS sul pellet virale. Non risospendere il pellet. Lasciare agire a 4 °C per 2 ore.
   11. Risospendere delicatamente le particelle virali mediante pipettaggio su e giù. Evita di fare bolle. Conservare a -80 °C.
       NOTA: Quantità maggiori di particelle virali possono essere prodotte trasfettando più piastre di cellule HEK-2-93T.
2. Infettare le cellule di glioblastoma con particelle lentivirali.
   NOTA: Questo protocollo è scritto per linee cellulari commerciali di glioblastoma come U-87 MG, U-373 MG o T98. Per utilizzare cellule di glioblastoma derivate dal paziente primario, utilizzare un rivestimento specifico delle piastre e un mezzo non a base di siero²⁶.
   1. Preparare un piatto confluente al 70% di cellule di glioblastoma U-87 MG coltivate nel terreno essenziale minimo (MEM) di Eagle integrato con siero fetale di vitello al 10%, penicillina-streptomicina (100 unità / mL di concentrazione finale per la penicillina e 100 μg / ml per la streptomicina) e aminoacidi non essenziali (1x).
   2. Aggiungere le particelle virali ad una diluizione di 1 su 5.000 direttamente sulle cellule. Mescolare con un leggero vortice. Consentire ai virus di infettare le cellule per non più di 20 ore.
   3. Rimuovere il terreno contenente virus e sostituirlo con terreno di coltura fresco. Consentire l'espressione della tubulina marcata per 48-72 ore.
      NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in un armadio di biosicurezza BSL2.
   4. FACS-ordina le celle per selezionare il 15% più luminoso delle celle mKate2⁺ . Dopo aver rimosso detriti e doppiette utilizzando il gating forward e side scatter (FCS vs SSC), applicare un altro gating sulle celle mKate2⁺ al 30% più luminose per mantenere il 15% superiore.
   5. Amplificare le celle marcate con MT.
      NOTA: In alternativa, la selezione clonale basata su alti livelli di tubulina-mKate2 può essere eseguita al microscopio a epifluorescenza.

2. Preparare le larve di zebrafish per la microiniezione

1. Genera uova di zebrafish.
   1. Mettere tre maschi e quattro femmine del ceppo zebrafish desiderato in una vasca di accoppiamento integrata con biglie 4 giorni prima dello xenotrapianto, nel tardo pomeriggio.
      NOTA: Le linee Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) o Tg(Huc:gfp) vengono utilizzate rispettivamente per marcare vasi endogeni, cellule staminali neurali/astrociti e neuroni.
   2. Raccogli le uova prodotte dalla deposizione delle uova indotta dal marmo la mattina dopo.
   3. Pulire le uova trasferendole in una provetta da centrifuga da 50 ml riempita con acqua minerale^{di origine 27} integrata con candeggina (0,004% finale). Capovolgere delicatamente il tubo per 5 minuti. Lavare due volte solo con acqua minerale.
   4. Trasferire le uova in una capsula di Petri contenente l'acqua minerale integrata con 0,28 mg/ml di blu di metilene.
   5. Rimuovere le uova non fecondate e in arresto dello sviluppo. Incubare gli embrioni a 28 °C.
2. Crea larve trasparenti.
   1. Introdurre N-feniltiourea (PTU) (0,003% finale) sul mezzo 8 ore dopo, per prevenire la pigmentazione della melanina e garantire la trasparenza ottica. Mantenere PTU nel mezzo per il resto del protocollo.
      NOTA: Poiché il trattamento con PTU può causare difetti dello sviluppo, selezionare solo le larve normalmente sviluppate per lo xenotrapianto. In alternativa al trattamento chimico, si può usare il ceppo mutante di zebrafish casper (madreperla e roy orbison doppio mutante), in cui la pigmentazione è assente²⁸.
   2. Portare la temperatura di incubazione a 29 °C.
   3. Aumentare la temperatura ogni giorno di 1 °C in modo che le larve di 3 dpf raggiungano i 32 °C il giorno dell'iniezione.
3. Preparare la piastra di microiniezione.
   1. Preparare 20 ml di agarosio all'1% + 0,28 mg/ml di blu di metilene con acqua minerale.
   2. Versare l'agarosio in una capsula di Petri di 10 cm e applicare rapidamente lo stampo di plastica a microiniezione capovolto per creare trincee a forma di V larghe 2,5 mm (Figura 2B).
      NOTA: Lo stampo in plastica è disponibile in commercio o può essere costruito internamente seguendo il design descritto nel Zebrafish Book²⁹.
   3. Rimuovere con attenzione lo stampo di plastica quando l'agarosio si è solidificato.
      NOTA: Le piastre colate a microiniezione possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
4. Preparare le larve per lo xenotrapianto.
   1. Il giorno dell'iniezione, eseguire lo screening per l'espressione del transgene fluorescente selezionato nelle larve dei 3 dpf. Rimuovere gli animali non fluorescenti e dall'aspetto anormale.
   2. Dechorionate le larve manualmente con una pinza da orologiaio a punta fine. A 3 dpf, colpire delicatamente o strappare i corioni con due paia di pinze a punta fine per liberare le larve dal corion.
      NOTA: In alternativa, il trattamento enzimatico con pronasi A può essere utilizzato per decorionare le larve, di solito a 24 hpf.
   3. Mantenere le larve decorionate in acqua minerale con blu di metilene (0,28 mg/ml) e PTU (0,003% finale).

3. Procedura di xenotrapianto

1. Preparare aghi per microiniezione.
   1. Prendi un capillare di vetro borosilicato senza filamento centrale e posizionalo in un estrattore di aghi verticale.
   2. Utilizzando le seguenti impostazioni, aumento 8,5 e riscaldatore 3, allungare il capillare per trasformarlo in un ago per microiniezione.
2. Impostare il microiniettore.
   1. Caricare l'olio minerale in un microiniettore manuale. Rimuovere le bolle d'aria.
   2. Collegare un supporto capillare universale al microiniettore e fissarlo saldamente a un micromanipolatore meccanico (Figura 2A).
3. Raccogliere le cellule di glioblastoma.
   NOTA: i seguenti passaggi sono condotti in un armadio di biosicurezza BSL2.
   1. Preparare una piastra di 10 cm di cellule di glioblastoma in modo che raggiungano l'80% di confluenza il giorno del trapianto.
   2. (Facoltativo) Etichettare transitoriamente i nuclei cellulari aggiungendo Hoechst 35480 (200 ng/mL) alle cellule. Incubare per 20 minuti a 37 °C nell'incubatore a celle umidificate e lavare 2 volte con PBS.
   3. Estrarre la piastra di cellule dall'incubatore e lavare una volta con PBS. Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubando per 5-10 minuti a 37 °C nell'incubatore cellulare fino a quando tutte le cellule sono completamente staccate.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale in quanto una scarsa tripsinizzazione farà sì che gli aggregati cellulari rimangano bloccati nell'ago.
   4. Risospendere le cellule in 5 ml di terreno cellulare completo per glioblastoma in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 45 ml di PBS ghiacciato e centrifugare a 134 × g per 5 minuti.
   5. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con 1 mL di PBS ghiacciato mediante pipettaggio su e giù accuratamente.
      NOTA: Questa fase di dissociazione meccanica aiuta notevolmente a prevenire il rischio di intasamento nel capillare durante la microiniezione.
   6. Aggiungere 49 ml di PBS ghiacciato e centrifugare a 134 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 200 μL di PBS ghiacciato. Conservare su ghiaccio per tutta la durata della procedura di trapianto.
4. Microiniettare le cellule di glioblastoma nel mesencefalo delle larve di zebrafish.
   1. Riempire una piastra colata di microiniezione con 6 ml di E3-medium³⁰ integrata con 160 mg/L di tricaina.
   2. Trasferire una dozzina di larve dechorionated nella piastra di microiniezione. Una volta che non rispondono al tocco, allinearli nelle trincee su un fianco, a testa in su, e il sacco vitellino spinto contro il muro della trincea, con un pennello di taglia 00 (Figura 2B, C).
   3. Risospendere le cellule del glioblastoma. Caricare 5 μL di cellule nel microcapillare utilizzando punte di microcaricamento e inserire il capillare nel supporto capillare universale.
   4. Posizionare la piastra di microiniezione contenente le larve che non rispondono sotto lo stereomicroscopio. Posizionare la punta del microcapillare sul bordo della piastra di microiniezione utilizzando le manopole del micromanipolatore. Rompilo con un bisturi per creare un punto di ingresso affilato, all'incirca delle dimensioni del diametro di una cella.
   5. Verificare che le cellule stiano fuoriuscendo dal capillare facendo scorrere delicatamente l'olio nel microiniettore e immergendo la punta dell'ago nel mezzo. Concentrare le cellule sulla punta del capillare per massimizzare il numero di cellule iniettate per volume espulso ed evitare di riempire il tessuto cerebrale con PBS (Figura 2C).
   6. Esaminare attentamente le cellule che escono dal microcapillare mentre l'olio viene introdotto manualmente nell'iniettore. Definisci empiricamente quanti giri sono necessari sulla manopola manuale per fornire da 20 a 50 celle. In genere, se le cellule sono abbastanza concentrate, è sufficiente un giro delicato per espellere ~ 10 cellule.
      NOTA: Se il liquido non fuoriesce correttamente dal microcapillare, provare ad allentare l'attacco del microcapillare nel supporto capillare. In questo modo, l'olio potrebbe fuoriuscire e gocciolare lungo il capillare.
   7. Avvicina la punta del capillare contro il Tectum Ottico sinistro (OT), appena sopra la Vena Cerebrale Media (MCeV, Figura 2F).
   8. Premere delicatamente il capillare contro le larve fino a quando la membrana cutanea si rompe (Figura 2D,E).
      NOTA: Non spingere troppo forte in quanto ciò comporterebbe l'iniezione delle cellule troppo in profondità nel cervello dove la minore chiarezza ottica impedirà di osservare MT in dettaglio. La tecnica di imaging è possibile per una profondità che raggiunge i 250-300 μm. Tuttavia, si raccomanda di non iniettare più in profondità di 100 μm dalla superficie del pesce.
   9. Una volta raggiunta una posizione adatta nell'OT, espellere le celle. Osservare attentamente la punta del capillare per visualizzare il flusso di cellule che entrano all'interno dell'animale, garantendo così un'iniezione di successo.
      NOTA: Fare attenzione a non iniettare nei ventricoli (Figura 2E). Una volta nei ventricoli, le cellule tendono ad accumularsi e rimanere bloccate invece di infiltrarsi nel tessuto (Figura 2I). L'iniezione ventricolare è caratterizzata da intenso gonfiore del cervello e diffusione osservabile delle cellule iniettate al proencefalo e al cervello posteriore (Figura 2J).
   10. Ripetere la procedura dai passaggi 3.4.9-3.4.11 per tutti gli animali necessari. Procedere rapidamente per prevenire l'aggregazione delle cellule nel capillare.
       NOTA: A seconda della velocità con cui lo sperimentatore è in fase di iniezione, potrebbe essere necessario un cambio di ago ogni 10-20 larve.
   11. Una volta completato lo xenotrapianto, rimuovere le larve dalla piastra di microiniezione e individuarle in una piastra a 24 pozzetti riempita con acqua minerale di origine + PTU + mezzo blu di metilene.
   12. Convalidare l'iniezione riuscita osservando le larve sotto uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 2G). Selezionare solo xenotrapianti contenenti una singola massa tumorale formata da 20-50 cellule situate nei primi 200 μm (in z) dell'OT (Figura 2H vs iniezione non riuscita in Figura 2I-K).
       NOTA: La resa degli xenotrapianti localizzati con successo varia dal 10% all'inizio a quasi il 100% con la pratica.
   13. Lasciare che le larve si riprendano per almeno 4 ore a 32 °C prima dell'imaging.
       NOTA: L'aggiunta di antibiotici nel mezzo non aumenta il tasso di sopravvivenza delle larve. In questa fase, se la microiniezione è stata eseguita correttamente, quasi il 100% dei pesci sopravvive.

4. Imaging intravitale degli xenotrapianti di glioblastoma

1. Montare le larve per l'imaging dal vivo.
   NOTA: Le larve possono essere visualizzate da 4 ore dopo l'iniezione (hpi). L'imaging dal vivo della MT viene solitamente eseguito da 20 hpi, quando le cellule GBM invasive hanno iniziato a estendere le sporgenze e migrare lontano dalla massa tumorale.
   1. Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione all'1%. Trasferire 500 μL di soluzione bollita di agarosio all'1% in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e lasciarla raffreddare a 37 °C su un blocco termico. Aggiungere la tricaina (112 μg/ml) all'agarosio e mescolare bene.
   2. Trasferire da una a quattro larve xenotrapiantate in una capsula di Petri di 3,5 cm riempita con acqua minerale + PTU + terreno di metilene integrato con tricaina (112 μg/mL). Una volta che le larve non rispondono al tatto, trasferirle con cura nel tubo contenente l'agarosio e la tricaina usando una pipetta di trasferimento a punta fine.
      NOTA: Mantenere il volume del mezzo al minimo per limitare la diluizione dell'agarosio.
   3. Mescolare delicatamente le larve con l'agarosio. Utilizzando una normale pipetta di trasferimento (lampadina grande), posizionare le larve mescolate nell'agarosio al centro di una capsula di video-imaging da 3,5 cm con fondo di vetro. Sotto uno stereomicroscopio, posiziona rapidamente le larve sulla schiena usando una punta di microcaricamento per manipolare il pesce.
      NOTA: Poiché un microscopio confocale a disco rotante invertito viene utilizzato per l'imaging cerebrale intravitale in questo protocollo, le larve sono montate dorsalmente. Regolare il posizionamento delle larve di conseguenza se si utilizza un microscopio confocale verticale.
   4. Rimuovere l'agarosio in eccesso per mantenere lo strato di agarosio più sottile possibile. Una volta che l'agarosio si è solidificato, aggiungere 2,5 ml di acqua minerale di origine + PTU + 0,2x tricaina (mezzo di imaging) e procedere al passaggio successivo.
2. Imaging live in vivo in vivo della dinamica della MT nelle cellule di glioblastoma invasori
   NOTA: La qualità ottica delle immagini dipende molto dalle prestazioni del microscopio utilizzato. Il protocollo è scritto per un microscopio confocale a disco rotante invertito dotato di una fotocamera sCMOS (dimensione pixel 6,5 μm, 2048 x 2044 pixel), obiettivo a lunga distanza di lavoro e camera ambientale a temperatura controllata.
   1. Posizionare la parabola di video-imaging contenente le larve xenotrapiantate incorporate nell'agarosio nella camera ambientale di un microscopio confocale invertito, con la temperatura impostata a 32 °C. Trova le larve nella parabola di video-imaging con un obiettivo 10x, utilizzando uno stadio XY motorizzato.
   2. Premere ESC per abbassare la torretta degli obiettivi, aggiungere olio minerale su un obiettivo 60x (1,4 NA, distanza di lavoro: 0,13 mm) e premere ESC per tornare alla posizione focale iniziale.
   3. Osservare le cellule di glioblastoma invasori nel canale rosso (sorgente laser 561 nm, potenza laser 20%, tempo di esposizione: 200 ms) e selezionare una cellula con una rete MT diffusa e filamenti MT facilmente distinguibili (Figura 3B).
   4. Impostare le impostazioni della serie z. Utilizzando uno stadio piezoelettrico da 200 μm, selezionare le posizioni superiore e inferiore della rete MT: uno z-stack profondo 10-30 μm è sufficiente per visualizzare la rete di microtubuli nella sporgenza della cella migrante, con un passo z-slice di 0,3 μm.
   5. Imposta le impostazioni di acquisizione time-lapse per consentire un equilibrio ottimale tra velocità di acquisizione, profondità z-stack e segnale fluorescente per evitare un rapido photobleaching. Acquisisci immagini di MT ogni 5-10 s per diversi minuti. Acquisire e salvare l'hyperstack 5D (x,y,z,t,c).
      NOTA: Per evitare derive in z durante l'acquisizione, utilizzare un microscopio dotato di un sistema di messa a fuoco perfetto come stabilizzazione della messa a fuoco hardware.
3. (Facoltativo) Determinare gli effetti degli agenti che alterano i microtubuli (MTA) sulle MT.
   NOTA: I seguenti passaggi consentono di testare gli effetti degli MTA su una rete MT nella migrazione delle cellule di glioblastoma in tempo reale.
   1. Rimuovere delicatamente il supporto di imaging dal piatto di video-imaging. Non toccare il fondo del piatto, poiché la posizione xyz andrà persa.
   2. Preparare un nuovo mezzo di imaging contenente l'MTA a diverse concentrazioni. Aggiungere delicatamente il mezzo contenente MTA nel piatto di imaging video goccia a goccia.
   3. Acquisire filmati a lungo termine (2-16 ore, un'immagine ogni 10-20 minuti) per osservare gli effetti di ogni concentrazione dell'MTA sulla rete MT e sulla migrazione cellulare (Figura 4A).
   4. (Facoltativo) Lavare l'MTA rimuovendo delicatamente il terreno e aggiungendo 2,5 ml di terreno di imaging fresco senza MTA. Ripetere la procedura di washout 3x per eliminare qualsiasi traccia di MTA nel mezzo.
   5. (Facoltativo) Acquisire un filmato a lungo termine simile a quello illustrato nella versione 4.3.3 (Figura 4B).
      NOTA: I passaggi precedenti determinano la concentrazione minima alterando la rete MT senza influire sulla sopravvivenza delle larve. Le fasi di washout definiscono se l'effetto del farmaco è reversibile.
4. Valutare l'impatto dell'MTA sull'invasione del glioblastoma mediante imaging sequenziale.
   1. Seguire i passaggi da 4.1 a 4.2.1 4 ore dopo la microiniezione.
      NOTA: Questa parte del protocollo può essere ottenuta anche con altre linee cellulari di glioblastoma marcate con fluorescenza. Idealmente, co-etichettare il GBM con un tag citosolico e un tag del nucleo per garantire il rilevamento della morfologia globale della cellula.
   2. Passare a un obiettivo d'acqua 40x a lunga distanza di lavoro (NA:1.15, WD: 0.6 mm).
   3. Impostare l'intervallo della serie z per acquisire la regione OT. Acquisire lo z-stack utilizzando una fotocamera sCMOS ad alta sensibilità (dimensione pixel 11 μm, 1.200 x 1.200 pixel, efficienza quantica 95%).
      NOTA: Lo z-stack di solito inizia nella parte più dorsale dell'OT (vicino alla superficie) e termina abbastanza in profondità nel cervello da includere l'intera massa cellulare tumorale.
   4. Rimuovere la parabola di video-imaging dal microscopio. Liberare le larve dall'agarosio utilizzando una punta di microcaricamento e colpendo delicatamente l'agarosio intorno all'animale.
      NOTA: Poiché 3 larve dpf sono ancora molto fragili, fare attenzione quando le si rimuove dall'agarosio.
   5. Una volta liberato l'animale dall'agarosio, trasferirlo delicatamente in un unico pozzetto di una piastra da 24 pozzetti riempita con acqua minerale di origine + blu di metilene + mezzo PTU. Contrassegnare il pozzo per identificare le larve per l'imaging successivo.
   6. Aggiungere l'MTA di interesse per il substrato alla concentrazione determinata in precedenza (fase 4.3.3). Rinfrescare il mezzo integrato con il farmaco ogni giorno. Ripetere la procedura di imaging dai passaggi da 4.4.1 a 4.4.5 ogni giorno per 3-4 giorni.

5. Analisi delle immagini

1. Analizza le dinamiche MT con plugin FIJI disponibili gratuitamente.
   NOTA: Molte revisioni e protocolli descrivono i metodi di analisi della dinamica MT nelle celle^31,32,33,34 e possono essere applicati in questa fase. Questo protocollo farà brevemente riferimento a due metodi per misurare le proprietà dinamiche di base della MT.
   1. Aprire l'hyperstack 5D e generare uno stack 4D in cui le z-slice sono state proiettate su un singolo piano per creare una proiezione di intensità massima (MIP) in z (Image | Pile | Progetto Z | Intensità massima) (Figura 3B).
   2. Apri lo stack MIP 4D e traccia manualmente la fine di una MT basata su protrusione utilizzando la funzione di tracciamento manuale nelle FIJI (Plugins | Monitoraggio | Tracciamento manuale). (Figura 3D). Estrarre i parametri della dinamica MT come velocità di crescita, velocità di restringimento, frequenza di soccorso e frequenza di catastrofe.
   3. In alternativa, disegna una linea segmentata di 10 pixel di larghezza lungo la MT da analizzare (Figura 3B). Utilizzare la funzione Multi Kymograph (Analizza | Multi Kymograph) (Figura 3C) nelle FIGI. Osservare e misurare le fasi di crescita della MT (G), la durata delle pause (P) e la frequenza delle catastrofi MT.
2. Analisi dell'invasione del glioblastoma a lungo termine
   NOTA: questa analisi richiede l'uso della visualizzazione e dell'analisi 4D con software di bioimaging.
   1. Convertire lo z-stack 4D grezzo dal passaggio 4.4.3 (4 hpi) nel formato software appropriato, utilizzando il software File Converter.
   2. Aprire il software e importare il file z-stack convertito nella vista Supera (Figura 5A).
   3. Per segmentare le cellule tumorali e scartare l'autofluorescenza irrilevante nel canale rosso, fare clic su Aggiungi nuove superfici e seguire il processo in 5 fasi.
      1. Convalida le impostazioni predefinite facendo clic sulla freccia successiva una volta visualizzata la finestra. Procedere al passaggio 2/5.
         NOTA: Se il segnale fluorescente viene acquisito nel canale 561, l'autofluorescenza dalla pigmentazione residua nell'occhio può essere forte e alterare il processo di segmentazione automatica. Questo è problematico se lo xenotrapianto si trova vicino all'occhio. In tal caso, la segmentazione deve essere completata manualmente tagliando ed eliminando i segnali delle cellule non glioblastoma.
      2. Passare al canale sorgente | al canale 561. Uniformate l'immagine (filtro gaussiano) aggiungendo 1,50 μm in Dettagli superfici e 2,5 μm per il diametro delle sfere in Sottrai sfondo. Fare clic sulla freccia successiva e procedere al passaggio 3/5.
      3. A seconda dell'intensità del segnale, regolare manualmente la soglia (sottrazione dello sfondo) per includere ogni processo cellulare. Procedere al passaggio 4/5.
      4. Filtrare il segnale segmentato rimuovendo gli eventi che non rappresentano parte di una cellula (ad esempio, detriti, autofluorescenza). Fare clic su Tipo di filtro | volume e regolare manualmente la soglia per escludere tutti gli eventi al di sotto del volume più piccolo che rappresenta parte di una cella. Procedere al passaggio 5/5.
         NOTA: Se i segnali di autofluorescenza sono più grandi di volume rispetto alla parte più piccola della cella, procedere comunque e rimuovere manualmente i segnali indesiderati facendo clic con il pulsante sinistro del mouse ed eliminandoli .
      5. Eliminare il passaggio di classificazione e completare la procedura guidata di segmentazione facendo clic sulla doppia freccia verde per completare la creazione di una vista Surface delle cellule tumorali (Figura 5B).
   4. Se le cellule segmentate non si toccano e non formano un oggetto unico, uniscile artificialmente per creare un oggetto di massa cellulare tumorale. In breve, fai clic su Statistiche | dettagliato | valori specifici | volume. Seleziona tutti gli eventi facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su quello in alto e quindi tenendo premuto Maiusc e facendo clic con il pulsante sinistro dell'ultimo passo. Passare per modificare | selezione | unificare.
   5. Definire il centroide della massa cellulare tumorale. Clicca su Aggiungi nuovi Spot | Salta la creazione automatica | Aggiungi (il cursore si interseca con) | Centro dell'oggetto. Tenere premuto Maiusc e fare clic con il pulsante sinistro per creare il punto, che è il centroide della massa cellulare tumorale segmentata.
   6. Misurare la distanza 3D tra ogni cellula GBM e il centroide della massa tumorale. A tale scopo, create una distanza dal canale centroide rimanendo nella vista Spot e selezionando l'icona dello strumento | Trasformazione della distanza. Attendere la creazione di una nuova distanza dal canale centroide, accanto al canale 488 e al canale 561 (in blu, Figura 5C).
      NOTA: L'intensità di ogni voxel in questo canale corrisponde alla distanza 3D tra il voxel e il centroide della massa cellulare tumorale.
   7. Misura la distanza 3D dal centroide di ogni cella segmentata facendo clic su Aggiungi nuovi punti | Salta la creazione automatica | Aggiungi (il cursore si interseca con) | Canale specifico 561. Tenere premuto Maiusc e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull'area del nucleo della cella. Eseguire questa operazione per ogni cella (Figura 5D).
      NOTA: rimuovere la vista Superficie per apprezzare meglio il segnale di fluorescenza delle celle. In alternativa, se presente, utilizzare il segnale del nucleo (segnale 405 nm o 647 nm) per una migliore precisione.
   8. Clicca su Statistiche | Dettagli | Valori specifici | intensità media Ch=distanza dal centroide.
      NOTA: Il valore dell'intensità è la distanza 3D in μm tra l'area del nucleo cellulare e il centroide.
   9. Media di queste intensità per calcolare il raggio della massa tumorale a 4 hpi. Ripetere la procedura per ogni punto temporale dell'analisi (24 hpi, 48 hpi e 72 hpi).
      NOTA: misurare solo le 10 o 20 cellule più disseminate per evitare di sottovalutare l'invasione cellulare. Infatti, la compattazione forzata delle cellule durante l'iniezione può impedire alle cellule al centro della massa tumorale di migrare.
   10. Calcolare l'indice di invasione (II) come rapporto tra le distanze medie 3D a t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi delle cellule più disseminate sul raggio medio della massa tumorale a t = 4 hpi (Figura 5E).

Risultati

Per analizzare il ruolo svolto dalle MT durante l'invasione GBM in vivo, descriviamo qui i principali passi per eseguire la marcatura MT stabile nelle cellule GBM mediante infezione lentivirale, xenotrapianti ortotopici di cellule GBM in larve di zebrafish 3 dpf, imaging intravitale ad alta risoluzione della dinamica MT, trattamento MTA e suoi effetti sull'invasione GBM e analisi delle immagini della dinamica MT e invasione in vivo (Figura 1). La dinamica ...

Discussione

È probabile che l'imaging di xenotrapianti tumorali a risoluzione singola cellulare diventi uno strumento indispensabile per migliorare la nostra comprensione della biologia GBM. L'imaging dal vivo nei modelli PDX murini ha portato a preziose scoperte su come GBM invade collettivamente il tessuto cerebrale¹⁸. Tuttavia, ad oggi, la risoluzione spaziotemporale non è abbastanza alta da rivelare la dinamica delle proteine che controllano l'invasione GBM. Abbiamo ragionato che accoppiando l'attecchim...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum	Eurobio	CVFSVF00-01	Reagent
MEM NEAA	Gibco	11140-050	Reagent
Modified Eagle's medium	Eurobio	CM1MEM18-01	Reagent
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Reagent
U-87 MG	ECACC	89081402-1VL	Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III	BD bioscience		Instrument
BD FACSDiva software v8.0	BD bioscience		Software
HEK-293T	Merck	12022001	Cells
pMD2.G	Addgene	Plasmid #12259	Reagent
psPAX2	Addgene	Plasmid #12260	Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80	Beckman Coulter		Instrument
Cell passaging and staining
dPBS	Gibco	14190-094	Chemical
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054	Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC	LEICA	https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/	Instrument
Methylene Blue hydrate	Sigma-Aldrich	M4159	Chemical
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-25G	Chemical
Transfer Pipettes fine tips	Samco Scientific	232	Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL	Samco Scientific	225	Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	Cat#: A5040	Chemical
Volvic Source Water	DUTSCHER DOMINIQUE SAS	999556	Reagent
Xenotransplantation
24-well plate	TPP	92024	Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)	Harvard Apparatus	(#30-0017 GC100-15	Equipment
CellTram oil vario microinjector	Eppendorf	5176000.025	Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL	Eppendorf	5242956003	Equipment
Micromanipulator	NARISHIGE	https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html	Equipment
Mineral Oil	Sigma	M8410-100ml	Equipment
Stereomicroscope	Olympus	KL 2500 LCD	Instrument
Universal capillary holder	Eppendorf	5176190002	Equipment
Vertical Pipette puller	KOPF (Roucaire)	Model 720	Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish	MatTek Life Sciences, MA, USA	P35G-1,5-14-C	Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21	Nikon		Software
Heat-Block	Techne	DRI-BLOCK DB-2D	Equipment
Microscope head Nikon Ti2E	Nikon		Instrument
sCMOS camera Prime 95B	Photometrics		Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4	Hammatsu		Instrument
Ultrapure Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit	Hammatsu		Instrument
Drug Treatment
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Chemical
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404-2MG	Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software	Oxford Instruments		Software
ImarisFileConverter 9.5.1	Oxford Instruments		Software