Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra

Riepilogo

Riportiamo una tecnica che consente l'imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L'accoppiamento dell'iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l'invasione del cancro in situ .

Abstract

Con un triste tempo di sopravvivenza mediano nelle popolazioni reali - tra 6 e 15 mesi - il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale maligno più devastante. Il fallimento del trattamento è dovuto principalmente all'invasività delle cellule GBM, che parla della necessità di una migliore comprensione delle proprietà mobili GBM. Per studiare il meccanismo molecolare che supporta l'invasione del GBM, sono necessari nuovi modelli fisiologici che consentano una caratterizzazione approfondita della dinamica delle proteine durante l'invasione. Queste osservazioni aprirebbero la strada alla scoperta di nuovi bersagli per bloccare l'infiltrazione tumorale e migliorare i risultati dei pazienti. Questo articolo riporta come uno xenotrapianto ortotopico di cellule GBM nel cervello del pesce zebra consenta l'imaging dal vivo intravitale subcellulare. Concentrandoci sui microtubuli (MT), descriviamo una procedura per l'etichettatura MT nelle cellule GBM, la microiniezione di cellule GBM nel cervello trasparente delle larve di zebrafish 3 giorni dopo la fecondazione (DPF), l'imaging intravitale delle MT negli xenotrapianti disseminanti, l'alterazione della dinamica della MT per valutare il loro ruolo durante l'invasione GBM e l'analisi dei dati acquisiti.

Introduzione

La motilità cellulare è un processo stereotipato che richiede la creazione dell'asse di polarità e riarrangiamenti citoscheletrici generatori di forza. La polimerizzazione dell'actina e la sua associazione con la miosina sono riconosciute come i principali contributori alle forze protrusive e contrattili richieste per il movimento cellulare¹. I microtubuli sono considerati i principali attori della polarizzazione cellulare e della persistenza direzionale durante la migrazione². Negli ultimi anni, le MT hanno anche dimostrato di creare e stabilizzare protrusioni per supportare le forze di meccanocompressione durante l'inv....

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida dell'Unione europea per la manipolazione di animali da laboratorio. Tutti i protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Institut Pasteur - CEEA 89 e dal Ministero della Ricerca e dell'Istruzione francese (permesso #01265.03). Durante le iniezioni o le sessioni di imaging dal vivo, gli animali sono stati anestetizzati con Tricaine.At la fine delle procedure sperimentali, sono stati eutanizzati da overdose di anestetico. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi ai materiali, alle attrezzature e al software utilizzati in ques....

Risultati

Per analizzare il ruolo svolto dalle MT durante l'invasione GBM in vivo, descriviamo qui i principali passi per eseguire la marcatura MT stabile nelle cellule GBM mediante infezione lentivirale, xenotrapianti ortotopici di cellule GBM in larve di zebrafish 3 dpf, imaging intravitale ad alta risoluzione della dinamica MT, trattamento MTA e suoi effetti sull'invasione GBM e analisi delle immagini della dinamica MT e invasione in vivo (Figura 1). La dinamica .......

Discussione

È probabile che l'imaging di xenotrapianti tumorali a risoluzione singola cellulare diventi uno strumento indispensabile per migliorare la nostra comprensione della biologia GBM. L'imaging dal vivo nei modelli PDX murini ha portato a preziose scoperte su come GBM invade collettivamente il tessuto cerebrale¹⁸. Tuttavia, ad oggi, la risoluzione spaziotemporale non è abbastanza alta da rivelare la dinamica delle proteine che controllano l'invasione GBM. Abbiamo ragionato che accoppiando l'attecchim.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum	Eurobio	CVFSVF00-01	Reagent
MEM NEAA	Gibco	11140-050	Reagent
Modified Eagle's medium	Eurobio	CM1MEM18-01	Reagent
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Reagent
U-87 MG	ECACC	89081402-1VL	Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III	BD bioscience		Instrument
BD FACSDiva software v8.0	BD bioscience		Software
HEK-293T	Merck	12022001	Cells
pMD2.G	Addgene	Plasmid #12259	Reagent
psPAX2	Addgene	Plasmid #12260	Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80	Beckman Coulter		Instrument
Cell passaging and staining
dPBS	Gibco	14190-094	Chemical
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054	Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC	LEICA	https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/	Instrument
Methylene Blue hydrate	Sigma-Aldrich	M4159	Chemical
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-25G	Chemical
Transfer Pipettes fine tips	Samco Scientific	232	Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL	Samco Scientific	225	Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	Cat#: A5040	Chemical
Volvic Source Water	DUTSCHER DOMINIQUE SAS	999556	Reagent
Xenotransplantation
24-well plate	TPP	92024	Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)	Harvard Apparatus	(#30-0017 GC100-15	Equipment
CellTram oil vario microinjector	Eppendorf	5176000.025	Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL	Eppendorf	5242956003	Equipment
Micromanipulator	NARISHIGE	https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html	Equipment
Mineral Oil	Sigma	M8410-100ml	Equipment
Stereomicroscope	Olympus	KL 2500 LCD	Instrument
Universal capillary holder	Eppendorf	5176190002	Equipment
Vertical Pipette puller	KOPF (Roucaire)	Model 720	Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish	MatTek Life Sciences, MA, USA	P35G-1,5-14-C	Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21	Nikon		Software
Heat-Block	Techne	DRI-BLOCK DB-2D	Equipment
Microscope head Nikon Ti2E	Nikon		Instrument
sCMOS camera Prime 95B	Photometrics		Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4	Hammatsu		Instrument
Ultrapure Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit	Hammatsu		Instrument
Drug Treatment
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Chemical
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404-2MG	Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software	Oxford Instruments		Software
ImarisFileConverter 9.5.1	Oxford Instruments		Software