Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra

Resumo

Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .

Resumo

Com um tempo de sobrevida mediano sombrio em populações reais - entre 6 a 15 meses - o glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais devastador. A falha do tratamento deve-se principalmente à invasividade das células GBM, o que fala da necessidade de uma melhor compreensão das propriedades móveis do GBM. Para investigar o mecanismo molecular que suporta a invasão de GBM, são necessários novos modelos fisiológicos que permitam uma caracterização aprofundada da dinâmica das proteínas durante a invasão. Essas observações abririam o caminho para a descoberta de novos alvos para bloquear a infiltração tumoral e melhorar os resultados dos pacientes. Este artigo relata como um xenoenxerto ortotópico de células GBM no cérebro do peixe-zebra permite imagens intravitais subcelulares vivas. Com foco em microtúbulos (MTs), descrevemos um procedimento para marcação de MT em células GBM, microinjeção de células GBM no cérebro transparente de larvas de peixe-zebra 3 dias após a fertilização (dpf), imagem intravital de MTs nos xenoenxertos disseminadores, alteração da dinâmica de MT para avaliar seu papel durante a invasão de GBM e análise dos dados adquiridos.

Introdução

A motilidade celular é um processo estereotipado que requer o estabelecimento do eixo polaridade e rearranjos citoesqueléticos geradores de força. A polimerização da actina e sua associação com a miosina são reconhecidas como os principais contribuintes para as forças protrusivas e contráteis necessárias para o movimento celular¹. Os microtúbulos são considerados os principais atores na polarização celular e na persistência direcional durante a migração². Nos últimos anos, os MTs também demonstraram criar e estabilizar saliências para suportar forças mecanocompressivas durante a invasão celular em 3D³. Mais recentemente, os MTs têm estado diretamente envolvidos na mecanotransdução em aderências focais e migração mecanossensível⁴. A instabilidade dinâmica que caracteriza a dinâmica final MT-plus é composta por repetidas fases de polimerização (crescimento) e despolimerização (encolhimento), que são controladas por uma infinidade de proteínas ligadoras de microtúbulos e cascatas de sinalização intracelular, como as regidas por RHO-GTPases ^5,6,7. O papel da rede de MT na migração e invasão celular tornou a investigação da dinâmica da MT um elemento-chave para entender melhor os mecanismos de homing de células imunes, cicatrização de feridas e invasão de câncer.

A capacidade das células cancerígenas de escapar do núcleo primário do tumor, se espalhar nos tecidos e gerar tumores secundários é um passo crítico na prevenção do sucesso global na guerra contra o câncer declarada há 50 anos ^8,9. Um dos maiores obstáculos tem sido entender como as células cancerosas invadem ativamente o tecido. Os principais mecanismos de invasão baseiam-se nos mesmos princípios que regem a migração de células não tumorais¹⁰. No entanto, surgiram especificidades da migração de células cancerígenas¹¹, desencadeando a necessidade de melhor caracterização desse tipo de migração. Especificamente, como o microambiente tumoral aparece como peça-chave na progressão do câncer¹², observar e analisar a invasão de células cancerígenas em um contexto fisiológico relevante é essencial para desvendar os mecanismos de disseminação de células cancerígenas.

As MTs são fundamentais para a progressão do câncer, para sustentar tanto a proliferação quanto a invasão. A análise precisa da dinâmica da MT in situ pode ajudar a identificar os agentes de alteração da MT (MTA) em ambos os processos. A dinâmica da MT varia drasticamente após uma mudança no ambiente. In vitro, o tratamento com agentes desestabilizadores de MT, como o nocodazol, previne a formação de protrusão celular quando as células são incorporadas em géis em 3D, ao passo que tem pouco efeito sobre a migração celular 2D^13,14. Embora tecnicamente desafiadores, os avanços na imagem intravital permitem a análise in vivo da dinâmica da MT durante a invasão de células cancerígenas. Por exemplo, a observação de MTs em células de fibrossarcoma xenoenxertado por via subcutânea em camundongos revelou que macrófagos associados a tumores afetam a dinâmica da MT em células tumorais¹⁵. No entanto, esses modelos de camundongos envolvem extensos procedimentos cirúrgicos e permanecem insatisfatórios para cânceres menos acessíveis, como o tumor cerebral altamente invasivo, GBM.

Apesar de um tempo médio de sobrevivência sombrio de^{15 meses 16}, pouco se sabe sobre o modo de disseminação do GBM dentro do parênquima cerebral ou os principais elementos moleculares que sustentam a invasão celular do GBM no tecido cerebral. A melhora no modelo de xenoenxerto ortotópico (PDX) de camundongos e o estabelecimento de janelas cranianas ofereceram novas perspectivas para estudos de invasão celular de GBM^17,18. No entanto, devido à qualidade de imagem abaixo do ideal, este modelo tem permitido principalmente imagens longitudinais de xenoenxertos superficiais e não tem sido usado com sucesso para estudar imagens subcelulares de proteínas do citoesqueleto até o momento. Além disso, na sequência da injunção "3Rs" para reduzir a utilização de roedores e substituí-los por vertebrados inferiores, foram estabelecidos modelos alternativos.

Aproveitando a imunidade primitiva observada em larvas de peixe-zebra (Danio rerio), desenvolveu-se a injeção ortotópica de células GBM no cérebro do peixe 19,20,21. A injeção nas proximidades dos ventrículos do mesencéfalo em desenvolvimento recapitula a maior parte da fisiopatologia do GBM humano²¹, e o mesmo padrão preferido de invasão do GBM que nos humanos - cooptação de vasos - é observado²². Graças à transparência das larvas de peixes, este modelo permite a visualização de células GBM que invadem o cérebro a partir das áreas peri-ventriculares onde se pensa que a maioria dos GBMs surge²³.

Como as MTs são essenciais para a invasão celular de GBM in vitro^24,25, é necessária uma melhor caracterização da dinâmica da MT e a identificação dos principais reguladores durante a invasão celular. No entanto, até o momento, os dados gerados com o modelo ortotópico do peixe-zebra não incluíram a análise subcelular da dinâmica da MT durante o processo de invasão. Este artigo fornece um protocolo para estudar a dinâmica da MT in vivo e determinar seu papel durante a invasão do câncer cerebral. Após a marcação estável dos microtúbulos, as células GBM são microinjetadas a 3 dpf no cérebro das larvas de peixe-zebra e fotografadas em tempo real em alta resolução espaço-temporal durante sua progressão no tecido cerebral. A imagem ao vivo de MTs fluorescentes permite a análise qualitativa e quantitativa da dinâmica MT plus-end. Além disso, este modelo permite avaliar o efeito dos MTAs na dinâmica da MT e nas propriedades invasivas das células GBM em tempo real. Este protocolo relativamente não invasivo combinado com um grande número de larvas manuseadas de cada vez e a facilidade de aplicação de drogas (na água de peixe) torna o modelo um trunfo para testes pré-clínicos.

Protocolo

As experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações da União Europeia para o manuseamento de animais de laboratório. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Institut Pasteur - CEEA 89 e pelo Ministério da Pesquisa e Educação da França (alvará nº 01265.03). Durante as injeções ou sessões de imagem ao vivo, os animais foram anestesiados com Tricaine.At final dos procedimentos experimentais, foram eutanasiados por overdose anestésica. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos materiais, equipamentos e softwares usados neste protocolo. O fluxo de trabalho geral do protocolo é descrito na Figura 1.

1. Geração de células de glioblastoma expressando de forma estável α-tubulina-mKate2

NOTA: As etapas a seguir são executadas em um gabinete de biossegurança BSL2+.

1. Produzir partículas lentivirais expressando mKate2-tubulina usando o método de fosfato de cálcio para a transfecção de 7 × 10⁶ células HEK-293T.
   1. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicione 10 μg de plasmídeo de embalagem de^2ª geração psPAX2, 5 μg de plasmídeo de envelope viral pMD2.G e 10 μg do plasmídeo de interesse, pGK-mKate2-tubulina humana α1a com 50 μL de CaCl 2 (estoque de_2,5 M). Ajustar para 500 μL com H₂O estéril livre de DNAse.
      NOTA: É importante adicionar CaCl₂ por último.
   2. Misture invertendo o tubo algumas vezes e incube por 20 min à temperatura ambiente (RT).
   3. Durante a incubação, prepare outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 500 μL de solução salina tamponada com HEPES (HBS), pH 7,0 (2x).
   4. Após 20 minutos, adicionar a mistura de CaCl₂/ADN gota a gota à solução HBS (2x). Misture invertendo o tubo algumas vezes. Incubar por 12 min no RT.
   5. Após 12 min, adicione suavemente o CaCl₂/DNA misturado com HBS diretamente em um prato de 10 cm de células HEK-293T 70% confluentes, gota a gota.
   6. Deixar as células na incubadora umidificado a 37 °C com 5% de CO₂ durante 36-48 h.
   7. Colete o sobrenadante e gire-o para baixo a 3.000 × g por 5 minutos para remover os detritos celulares.
   8. Para concentrar as partículas virais, carregar o sobrenadante num tubo de ultracentrífuga e girá-lo para baixo a 47.508 × g durante 90 minutos a 4 °C.
   9. Descarte o sobrenadante e coloque o tubo de cabeça para baixo sobre papel para secar o interior do tubo.
   10. Adicione 30 μL de PBS ao pellet viral. Não ressuspeite o pellet. Deixar a 4 °C durante 2 h.
   11. Ressuspeite suavemente as partículas virais pipetando para cima e para baixo. Evite fazer bolhas. Conservar a -80 °C.
       NOTA: Maiores quantidades de partículas virais podem ser produzidas transfectando múltiplas placas de células HEK-2-93T.
2. Infectar células de glioblastoma com partículas lentivirais.
   NOTA: Este protocolo foi escrito para linhagens celulares comerciais de glioblastoma, como U-87 MG, U-373 MG ou T98. Para utilizar células primárias de glioblastoma derivadas do paciente, utilizar revestimento específico das placas e meio não à base de soro²⁶.
   1. Preparar um prato de 10 cm 70% confluente de células de glioblastoma U-87 MG cultivadas no meio essencial mínimo (MEM) de Eagle suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, penicilina-estreptomicina (concentração final de 100 unidades/mL para penicilina e 100 μg/mL para estreptomicina) e aminoácidos não essenciais (1x).
   2. Adicione as partículas virais a uma diluição de 1 em 5.000 diretamente nas células. Misture com um redemoinho suave. Permita que os vírus infectem as células por não mais de 20 h.
   3. Remova o meio contendo vírus e substitua-o por um meio de cultura fresco. Permita a expressão da tubulina marcada por 48-72 h.
      NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em um gabinete de biossegurança BSL2.
   4. Classifique as células de forma FACS para selecionar os 15% mais brilhantes das células mKate2⁺ . Depois de remover detritos e células duplas usando a cobertura de dispersão frontal e lateral (FCS vs SSC), aplique outra deformação nas células 30% mKate2⁺ mais brilhantes para manter os 15% superiores.
   5. Amplifice as células marcadas com MT.
      NOTA: Alternativamente, a seleção clonal baseada em altos níveis de tubulina-mKate2 pode ser realizada sob um microscópio de epifluorescência.

2. Prepare larvas de peixe-zebra para microinjeção

1. Gerar ovos de peixe-zebra.
   1. Coloque três machos e quatro fêmeas da cepa desejada de peixe-zebra em um tanque de acasalamento suplementado com bolinhas de gude 4 dias antes do xenotransplante, no final da tarde.
      NOTA: As linhas Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) ou Tg(Huc:gfp) são usadas para marcar vasos endógenos, células-tronco/astrócitos neurais e neurônios, respectivamente.
   2. Colete os ovos produzidos pela desova induzida por mármore na manhã seguinte.
   3. Limpe os ovos transferindo-os para um tubo de centrífuga de 50 mL preenchido com água mineral²⁷ suplementada com água sanitária (0,004% final). Inverta suavemente o tubo por 5 min. Lave duas vezes apenas com água mineral.
   4. Transfira os ovos para uma placa de Petri contendo a água mineral suplementada com 0,28 mg/mL de azul de metileno.
   5. Remova os ovos não fertilizados e presos no desenvolvimento. Incubar os embriões a 28 °C.
2. Crie larvas transparentes.
   1. Introduzir N-feniltioureia (PTU) (0,003% final) no meio 8 h mais tarde, para evitar a pigmentação da melanina e garantir a transparência óptica. Mantenha o PTU no meio pelo resto do protocolo.
      NOTA: Como o tratamento com PTU pode causar defeitos de desenvolvimento, selecione apenas as larvas normalmente desenvolvidas para xenotransplante. Como alternativa ao tratamento químico, pode-se utilizar o tamborim mutante da linhagem do peixe-zebra (nácar e roy orbisão duplo mutante), no qual a pigmentação está ausente²⁸.
   2. Aumentar a temperatura de incubação para 29 °C.
   3. Aumente a temperatura todos os dias em 1 °C para que as larvas de 3 dpf atinjam 32 °C no dia da injeção.
3. Prepare a placa de microinjeção.
   1. Preparar 20 ml de agarose a 1% + 0,28 mg/ml de azul de metileno com água mineral.
   2. Despeje a agarose em uma placa de Petri de 10 cm e aplique rapidamente o molde de plástico de microinjeção de cabeça para baixo para criar trincheiras em forma de V de 2,5 mm de largura (Figura 2B).
      NOTA: O molde de plástico está disponível comercialmente ou pode ser construído internamente seguindo o design descrito no Livro Zebrafish²⁹.
   3. Remova cuidadosamente o molde de plástico quando a agarose tiver se solidificado.
      NOTA: As placas fundidas de microinjeção podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 meses.
4. Prepare as larvas para xenotransplante.
   1. No dia da injeção, rastreie a expressão transgênica fluorescente selecionada nas larvas de 3 dpf. Remova os animais não fluorescentes e de aparência anormal.
   2. Dechorionate as larvas manualmente com pinças de relojoeiro de ponta fina. A 3 dpf, cutuque ou rasgue suavemente as coriões com dois pares de pinças de ponta fina para libertar as larvas do córion.
      NOTA: Alternativamente, o tratamento enzimático com pronase A pode ser usado para decorionar larvas, geralmente a 24 hpf.
   3. Manter as larvas decorionadas em meio de água mineral com azul de metileno (0,28 mg/mL) e PTU (0,003% final).

3. Procedimento de xenotransplante

1. Prepare agulhas de microinjeção.
   1. Pegue um capilar de vidro borossilicato sem um filamento central e coloque-o em um puxador de agulha vertical.
   2. Usando as seguintes configurações, aumente 8,5 e o aquecedor 3 estique o capilar para transformá-lo em uma agulha de microinjeção.
2. Configure o microinjetor.
   1. Carregue o óleo mineral em um microinjetor manual. Remova as bolhas de ar.
   2. Conecte um suporte capilar universal ao microinjetor e fixe-o a um micromanipulador mecânico (Figura 2A).
3. Colha as células do glioblastoma.
   NOTA: As etapas a seguir são conduzidas em um gabinete de biossegurança BSL2.
   1. Prepare uma placa de 10 cm de células de glioblastoma para que atinjam 80% de confluência no dia do transplante.
   2. (Opcional) Rotule transitoriamente os núcleos celulares adicionando Hoechst 35480 (200 ng/ml) às células. Incubar durante 20 min a 37 °C na incubadora de células humidificadas e lavar 2x com PBS.
   3. Retire a placa de células da incubadora e lave uma vez com PBS. Desprenda as células adicionando 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% e incubando por 5-10 min a 37 °C na incubadora celular até que todas as células estejam totalmente separadas.
      NOTA: Esta etapa é crítica, pois a tripsinização deficiente resultará em agregados celulares permanecendo presos na agulha.
   4. Ressuspender as células em 5 mL de meio celular de glioblastoma completo em um tubo de centrífuga de 50 mL. Adicionar 45 mL de PBS gelado e centrifugar a 134 × g por 5 min.
   5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com 1 mL de PBS gelado, pipetando para cima e para baixo completamente.
      NOTA: Esta etapa de dissociação mecânica ajuda muito a prevenir o risco de entupimento no capilar durante a microinjeção.
   6. Adicionar 49 mL de PBS gelado e centrifugar a 134 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 μL de PBS gelado. Armazenar no gelo durante o procedimento de transplante.
4. Microinjete as células do glioblastoma no mesencéfalo das larvas do peixe-zebra.
   1. Encha uma placa fundida de microinjeção com 6 mL de E3-meio³⁰ suplementado com 160 mg/L de tricaína.
   2. Transfira uma dúzia de larvas decorionadas para a placa de microinjeção. Uma vez que não respondam ao toque, alinhe-os nas trincheiras de lado, cabeça para cima e o saco vitelino empurrado contra a parede da trincheira, com um pincel de tamanho 00 (Figura 2B,C).
   3. Ressuspeite as células do glioblastoma. Carregar 5 μL de células no microcapilar usando pontas de microcarga e inserir o capilar no suporte capilar universal.
   4. Coloque a placa de microinjeção contendo as larvas que não respondem sob o estereomicroscópio. Coloque a ponta do microcapilar na borda da placa de microinjeção usando os botões do micromanipulador. Quebre-o com um bisturi para criar um ponto de entrada nítido, aproximadamente do tamanho do diâmetro de uma célula.
   5. Verifique se as células estão fluindo para fora do capilar passando suavemente o óleo no microinjetor e mergulhando a ponta da agulha no meio. Concentrar as células na ponta do capilar para maximizar o número de células injetadas por volume ejetado e evitar o preenchimento do tecido cerebral com PBS (Figura 2C).
   6. Examine cuidadosamente as células que saem do microcapilar à medida que o óleo é introduzido manualmente no injetor. Defina empiricamente quanto giro é necessário no botão manual para entregar de 20 a 50 células. Normalmente, se as células estiverem concentradas o suficiente, uma volta suave é suficiente para ejetar ~ 10 células.
      NOTA: Se o líquido não fluir adequadamente para fora do microcapilar, tente soltar a fixação do microcapilar no suporte capilar. Ao fazer isso, o óleo pode vazar e escorrer ao longo do capilar.
   7. Aproxime-se da ponta do capilar contra o Tectum Óptico (OT) esquerdo, logo acima da Veia Cerebral Média (MCeV, Figura 2F).
   8. Pressionar suavemente o capilar contra as larvas até que a membrana da pele se rompa (Figura 2D,E).
      NOTA: Não empurre com muita força, pois isso resultará na injeção de células muito profundas no cérebro, onde a menor clareza óptica impedirá a observação de MTs em detalhes. A técnica de imagem é possível para uma profundidade que atinge 250-300 μm. No entanto, recomenda-se não injetar mais de 100 μm a partir da superfície do peixe.
   9. Uma vez que uma posição adequada no OT é alcançada, ejete as células. Observe cuidadosamente a ponta do capilar para visualizar o fluxo de células que entram no interior do animal, garantindo assim uma injeção bem-sucedida.
      NOTA: Tenha cuidado para não injetar nos ventrículos (Figura 2E). Uma vez nos ventrículos, as células tendem a se acumular e ficar presas em vez de se infiltrarem no tecido (Figura 2I). A injeção ventrícula é caracterizada por intenso inchaço do cérebro e disseminação observável das células injetadas para o prosencéfalo e o rombencéfalo (Figura 2J).
   10. Repita o procedimento das etapas 3.4.9-3.4.11 para quantos animais forem necessários. Prossiga rapidamente para evitar a aglomeração de células no capilar.
       NOTA: Dependendo da rapidez com que o experimentador está na injeção, uma mudança de agulha pode ser necessária a cada 10 a 20 larvas.
   11. Uma vez que o xenotransplante esteja completo, remova as larvas da placa de microinjeção e isole-as em uma placa de 24 poços preenchida com água de fonte mineral + PTU + meio azul de metileno.
   12. Validar a injeção bem-sucedida observando as larvas sob um estereomicroscópio fluorescente (Figura 2G). Selecione apenas xenoenxertos contendo uma única massa tumoral formada por 20-50 células localizadas nos 200 μm superiores (em z) do OT (Figura 2H vs injeção malsucedida na Figura 2I-K).
       NOTA: O rendimento de xenoenxertos localizados com sucesso varia de 10% no início a quase 100% com a prática.
   13. Deixe as larvas recuperarem durante, pelo menos, 4 h a 32 °C antes da obtenção de imaginos.
       NOTA: A adição de antibióticos no meio não aumenta a taxa de sobrevivência das larvas. Nesta fase, se a microinjeção tiver sido realizada corretamente, quase 100% dos peixes sobrevivem.

4. Imagem intravital dos xenoenxertos de glioblastoma

1. Monte as larvas para imagens vivas.
   NOTA: As larvas podem ser fotografadas a partir de 4 h após a injeção (hpi). A imagem ao vivo da MT é geralmente realizada a partir de 20 hpi, quando as células GBM invasivas começaram a estender as saliências e migrar para longe da massa tumoral.
   1. Prepare uma solução de agarose de baixa fusão a 1%. Transfira 500 μL de solução de agarose fervida a 1% de baixo derretimento para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e deixe esfriar a 37 °C em um bloco de calor. Adicione tricadina (112 μg/mL) à agarose e misture bem.
   2. Transferir de uma a quatro larvas xenoenxertadas em uma placa de Petri de 3,5 cm preenchida com água mineral + PTU + meio de metileno complementado com tricapina (112 μg/mL). Uma vez que as larvas não respondem ao toque, transfira-as cuidadosamente para o tubo que contém a agarose e a tricapina usando uma pipeta de transferência de ponta fina.
      NOTA: Mantenha o volume de meio a um mínimo para limitar a diluição da agarose.
   3. Misture suavemente as larvas com a agarose. Usando uma pipeta de transferência normal (bulbo grande), coloque as larvas misturadas na agarose no centro de um prato de imagem de vídeo de 3,5 cm com fundo de vidro. Sob um estereomicroscópio, posicione rapidamente as larvas em suas costas usando uma ponta de microcarga para manipular os peixes.
      NOTA: Como um microscópio confocal de disco giratório invertido é usado para imagens cerebrais intravitais neste protocolo, as larvas são montadas dorsalmente. Ajuste o posicionamento das larvas de acordo se estiver usando um microscópio confocal vertical.
   4. Remova a agarose extra para manter a camada de agarose mais fina possível. Uma vez que a agarose tenha se solidificado, adicione 2,5 mL de água de fonte mineral + PTU + 0,2x tricaína (meio de imagem) e prossiga para a próxima etapa.
2. Imagem in vivo da dinâmica da MT em células invasoras de glioblastoma
   NOTA: A qualidade óptica das imagens depende muito do desempenho do microscópio que está sendo usado. O protocolo é escrito para um microscópio confocal de disco giratório invertido equipado com uma câmera sCMOS (tamanho de pixel 6,5 μm, 2048 x 2044 pixels), objetiva de longa distância de trabalho e câmara ambiental com temperatura controlada.
   1. Colocar a placa de videoimagiologia que contém as larvas xenoenxertadas embutidas em agarose na câmara ambiente de um microscópio confocal invertido, com a temperatura fixada a 32 °C. Encontre as larvas no prato de imagem de vídeo com uma objetiva de 10x, usando um estágio XY motorizado.
   2. Pressione ESC para abaixar a torre de objetivos, adicione óleo mineral em uma objetiva de óleo de 60x (1,4 NA, distância de trabalho: 0,13 mm) e pressione ESC para voltar à posição focal inicial.
   3. Observe as células invasoras de glioblastoma no canal vermelho (fonte de laser de 561 nm, 20% de potência do laser, tempo de exposição: 200 ms) e selecione uma célula com uma rede MT espalhada e filamentos MT facilmente distinguíveis (Figura 3B).
   4. Defina as configurações da série z. Usando um estágio piezo de faixa de 200 μm, selecione as posições superior e inferior da rede MT: uma pilha z de 10-30 μm de profundidade é suficiente para visualizar a rede de microtúbulos na protrusão da célula migratória, com uma etapa z-slice de 0,3 μm.
   5. Defina as configurações de aquisição de lapso de tempo para permitir um equilíbrio ideal entre a velocidade de aquisição, a profundidade da pilha z e o sinal fluorescente para evitar o fotobranqueamento rápido. Adquira imagens de MTs a cada 5-10 s por vários minutos. Adquira e salve a hiperpilha 5D (x,y,z,t,c).
      NOTA: Para evitar desvios em z durante a aquisição, use um microscópio equipado com um sistema de foco perfeito como estabilização de foco de hardware.
3. (Opcional) Determinar os efeitos dos agentes alteradores de microtúbulos (MTAs) nos MTs.
   NOTA: As etapas a seguir permitem testar os efeitos dos MTAs em uma rede MT na migração de células de glioblastoma em tempo real.
   1. Remova cuidadosamente o meio de imagem do prato de imagem de vídeo. Não toque no fundo do prato, pois a posição xyz será perdida.
   2. Prepare um novo meio de imagem contendo o MTA em diferentes concentrações. Adicione suavemente o meio contendo MTA ao prato de imagem de vídeo gota a gota.
   3. Adquirir filmes de longo prazo (2-16 h, uma imagem a cada 10-20 min) para observar os efeitos de cada concentração do MTA na rede MT e migração celular (Figura 4A).
   4. (Opcional) Lave o MTA removendo suavemente o meio e adicionando 2,5 mL de meio de imagem fresco sem o MTA. Repita o procedimento de lavagem 3x para limpar qualquer vestígio de MTA no meio.
   5. (Opcional) Adquira um filme de longo prazo semelhante ao 4.3.3 (Figura 4B).
      NOTA: As etapas acima determinam a concentração mínima que altera a rede MT sem afetar a sobrevivência das larvas. As etapas de lavagem definem se o efeito da droga é reversível.
4. Avaliar o impacto do MTA na invasão do glioblastoma por imagem sequencial.
   1. Siga os passos 4.1 a 4.2.1 4 h após a microinjeção.
      NOTA: Esta parte do protocolo também pode ser alcançada com outras linhagens celulares de glioblastoma marcadas fluorescentemente. Idealmente, co-rotule o GBM com uma tag citosólica e uma tag de núcleo para garantir a detecção da morfologia global da célula.
   2. Mude para uma objetiva de água de longa distância de trabalho de 40x (NA:1.15, WD: 0.6 mm).
   3. Defina o intervalo da série z para adquirir a região OT. Adquira a pilha z usando uma câmera sCMOS de alta sensibilidade (tamanho de pixel 11 μm, 1.200 x 1.200 pixels, eficiência quântica de 95%).
      NOTA: A pilha z geralmente começa na parte mais dorsal do OT (perto da superfície) e termina profunda o suficiente no cérebro para incluir toda a massa de células tumorais.
   4. Remova o prato de imagem de vídeo do microscópio. Liberte as larvas da agarose usando uma ponta de microcarga e cutucando suavemente a agarose ao redor do animal.
      NOTA: Como as larvas de 3 dpf ainda são muito frágeis, tenha cuidado ao removê-las da agarose.
   5. Uma vez que o animal esteja livre da agarose, transfira-o suavemente para um único poço de uma placa de 24 poços preenchida com água de fonte mineral + azul de metileno + meio PTU. Marque o poço para identificar as larvas para imagens subsequentes.
   6. Adicionar o MTA de interesse no meio à concentração determinada anteriormente (passo 4.3.3). Refrescar o meio suplementado com a droga todos os dias. Repita o procedimento de imagem das etapas 4.4.1 a 4.4.5 todos os dias durante 3-4 dias.

5. Análise de imagem

1. Analise a dinâmica do MT com plugins FIJI disponíveis gratuitamente.
   NOTA: Muitas revisões e protocolos descrevem os métodos de análise da dinâmica da MT nas células^31,32,33,34 e podem ser aplicados nesta fase. Este protocolo se referirá brevemente a dois métodos para medir as propriedades dinâmicas básicas da MT.
   1. Abra a hiperpilha 5D e gere uma pilha 4D onde as fatias z foram projetadas em um único plano para criar uma projeção de intensidade máxima (MIP) em z (Imagem | Pilhas | | do projeto Z Intensidade máxima) (Figura 3B).
   2. Abra a pilha MIP 4D e rastreie manualmente o final de um MT baseado em protrusão usando a função de rastreamento manual no FIJI (Plugins | | de rastreamento Rastreamento manual). (Figura 3D). Extraia os parâmetros da dinâmica da MT, como velocidade de crescimento, velocidade de encolhimento, frequência de resgate e frequência de catástrofe.
   3. Como alternativa, desenhe uma linha segmentada de 10 pixels de largura ao longo da MT para analisar (Figura 3B). Use a função Multi Kymograph (Analisar | Multi Kymograph) (Figura 3C) em FIJI. Observe e meça as fases de crescimento da MT (G), a duração das pausas (P) e a frequência das catástrofes da MT.
2. Análise da invasão de glioblastoma a longo prazo
   NOTA: Esta análise requer o uso de visualização e análise 4D com software de bioimagem.
   1. Converta a pilha z-stack 4D bruta da etapa 4.4.3 (4 hpi) para o formato de software apropriado, usando o software File Converter.
   2. Abra o software e importe o arquivo z-stack convertido na visualização Superpass (Figura 5A).
   3. Para segmentar as células tumorais e descartar a autofluorescência irrelevante no canal vermelho, clique em Adicionar novas superfícies e siga o processo de 5 etapas.
      1. Valide as configurações padrão clicando na próxima seta assim que a janela aparecer. Prossiga para a etapa 2/5.
         NOTA: Se o sinal fluorescente for adquirido no canal 561, a autofluorescência da pigmentação residual no olho pode ser forte e alterar o processo de segmentação automática. Isso é problemático se o xenoenxerto estiver localizado perto do olho. Nesse caso, a segmentação deve ser concluída manualmente, cortando e excluindo sinais celulares não glioblastoma.
      2. Navegue até Canal de origem | Canal 561. Alise a imagem (Filtro Gaussiano) adicionando 1,50 μm em Detalhes de Superfícies e adicionando 2,5 μm para o diâmetro das esferas em Fundo Subtrair. Clique na próxima seta e prossiga para o passo 3/5.
      3. Dependendo da intensidade do sinal, ajuste manualmente o Limiar (subtração de fundo) para incluir cada processo de célula. Prossiga para a etapa 4/5.
      4. Filtre o sinal segmentado removendo os eventos que não representam parte de uma célula (por exemplo, detritos, autofluorescência). Clique em Tipo de filtro | volume e ajuste o limite manualmente para excluir todos os eventos abaixo do menor volume que representa parte de uma célula. Prossiga para a etapa 5/5.
         NOTA: Se os sinais de autofluorescência forem maiores em volume do que a menor parte da célula, prossiga de qualquer maneira e remova manualmente os sinais indesejados clicando com o botão esquerdo do mouse e excluindo-os .
      5. Descartar a etapa de classificação e concluir o assistente de segmentação clicando na seta verde dupla para concluir a criação de uma visão de superfície das células tumorais (Figura 5B).
   4. Se as células segmentadas não se tocarem e não formarem um objeto único, funda-as artificialmente para criar um objeto de massa celular tumoral. Em resumo, clique em Estatísticas | detalhado | valores específicos | volume. Selecione todos os eventos clicando com o botão esquerdo do mouse no topo e, em seguida, segurando Shift e clicando com o botão esquerdo do mouse no último. Navegue até editar | seleção | unificar.
   5. Definir o centroide da massa celular tumoral. Clique em Adicionar novos pontos | Ignorar | de criação automática Adicionar (o cursor se cruza com) | Centro do Objeto. Mantenha pressionado o deslocamento e clique com o botão esquerdo para criar o ponto, que é o centroide da massa de células tumorais segmentadas.
   6. Meça a distância 3D entre cada célula GBM e o centroide da massa tumoral. Para fazer isso, crie uma distância para o canal centroide permanecendo na visualização Spot e selecionando o ícone da ferramenta | Transformação de Distância. Aguarde a criação de uma nova distância até o canal centroide, ao lado do canal 488 e do canal 561 (em azul, Figura 5C).
      NOTA: A intensidade de cada voxel neste canal corresponde à distância 3D entre o voxel e o centroide da massa celular tumoral.
   7. Meça a distância 3D até o centroide de cada célula segmentada clicando em Adicionar novos pontos | Ignorar | de criação automática Adicionar (o cursor se cruza com) | canal específico 561. Mantenha pressionada a tecla shift e clique com o botão esquerdo na área do núcleo da célula. Execute essa tarefa para cada célula (Figura 5D).
      NOTA: Remova a vista Superfície para apreciar melhor o sinal de fluorescência das células. Alternativamente, se presente, use o sinal do núcleo (sinal de 405 nm ou 647 nm) para melhor precisão.
   8. Clique em Estatísticas | | detalhados Valores específicos | intensidade média Ch=distância ao centroide.
      NOTA: O valor da intensidade é a distância 3D em μm entre a área do núcleo da célula e o centroide.
   9. Média dessas intensidades para calcular o raio da massa tumoral em 4 hpi. Repita o procedimento para cada ponto de tempo da análise (24 hpi, 48 hpi e 72 hpi).
      NOTA: Meça apenas as 10 ou 20 células mais disseminadas para evitar subestimar a invasão celular. De fato, a compactação forçada das células durante a injeção pode impedir que as células no centro da massa tumoral migrem.
   10. Calcular o índice de invasão (II) como a razão entre as distâncias 3D médias em t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi das células mais disseminadas sobre o raio médio da massa tumoral em t = 4 hpi (Figura 5E).

Resultados

Para analisar o papel desempenhado pelos MTs durante a invasão in vivo do GBM, descrevemos aqui os principais passos para realizar a marcação estável do MT em células GBM por infecção lentiviral, xenotransplante ortotópico de células GBM em larvas de peixe-zebra 3 dpf, imagens intravitais de alta resolução da dinâmica MT, tratamento MTA e seus efeitos na invasão GBM e análise de imagens da dinâmica MT e invasão in vivo (Figura 1). A dinâm...

Discussão

A imagem de xenoenxertos tumorais em resolução unicelular provavelmente se tornará uma ferramenta indispensável para melhorar nossa compreensão da biologia do GBM. Imagens ao vivo em modelos PDX de camundongos levaram a descobertas valiosas sobre como o GBM invade coletivamente o tecido cerebral¹⁸. No entanto, até o momento, a resolução espaço-temporal não é alta o suficiente para revelar a dinâmica das proteínas que controlam a invasão de GBM. Raciocinamos que, ao acoplar o enxerto ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum	Eurobio	CVFSVF00-01	Reagent
MEM NEAA	Gibco	11140-050	Reagent
Modified Eagle's medium	Eurobio	CM1MEM18-01	Reagent
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Reagent
U-87 MG	ECACC	89081402-1VL	Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III	BD bioscience		Instrument
BD FACSDiva software v8.0	BD bioscience		Software
HEK-293T	Merck	12022001	Cells
pMD2.G	Addgene	Plasmid #12259	Reagent
psPAX2	Addgene	Plasmid #12260	Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80	Beckman Coulter		Instrument
Cell passaging and staining
dPBS	Gibco	14190-094	Chemical
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054	Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC	LEICA	https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/	Instrument
Methylene Blue hydrate	Sigma-Aldrich	M4159	Chemical
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-25G	Chemical
Transfer Pipettes fine tips	Samco Scientific	232	Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL	Samco Scientific	225	Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	Cat#: A5040	Chemical
Volvic Source Water	DUTSCHER DOMINIQUE SAS	999556	Reagent
Xenotransplantation
24-well plate	TPP	92024	Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm)	Harvard Apparatus	(#30-0017 GC100-15	Equipment
CellTram oil vario microinjector	Eppendorf	5176000.025	Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL	Eppendorf	5242956003	Equipment
Micromanipulator	NARISHIGE	https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html	Equipment
Mineral Oil	Sigma	M8410-100ml	Equipment
Stereomicroscope	Olympus	KL 2500 LCD	Instrument
Universal capillary holder	Eppendorf	5176190002	Equipment
Vertical Pipette puller	KOPF (Roucaire)	Model 720	Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish	MatTek Life Sciences, MA, USA	P35G-1,5-14-C	Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21	Nikon		Software
Heat-Block	Techne	DRI-BLOCK DB-2D	Equipment
Microscope head Nikon Ti2E	Nikon		Instrument
sCMOS camera Prime 95B	Photometrics		Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4	Hammatsu		Instrument
Ultrapure Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit	Hammatsu		Instrument
Drug Treatment
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Chemical
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404-2MG	Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software	Oxford Instruments		Software
ImarisFileConverter 9.5.1	Oxford Instruments		Software