إعداد تعليق خلية غير عضلة القلب لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من قلب الفأر البالغ بعد احتشاء عضلة القلب

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لعزل كمية كافية من الخلايا العضلية غير القلبية المفردة ذات الصلاحية العالية من قلب الفأر بعد احتشاء عضلة القلب (MI). يمكن استخدام هذا لتسلسل الخلية الواحدة اللاحق ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، وزراعة الخلايا الأولية.

Abstract

احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، مع زيادة معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم. تمثل الخلايا غير القلبية أكثر من نصف إجمالي عدد خلايا القلب ، وتساهم في التعويضات التكيفية عند إصابة عضلة القلب ، بما في ذلك الاستجابات الالتهابية وإصلاح الأنسجة وتشكيل الندبات. لدراسة البيئة المكروية القلبية بعد MI ، يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) على نطاق واسع لتحديد أنواع خلايا القلب المختلفة والاتصالات بين الخلايا. من بين إجراءات تحضير عينة scRNA-seq ، يعد تحضير تعليق الخلية أحد أهم الخطوات ، لأن صلاحية الخلية يمكن أن تؤثر على جودة نتائج scRNA-seq. لذلك ، قمنا بتصميم بروتوكول تجريبي لإعداد تعليق الخلايا غير القلبية من قلوب الفئران بعد MI مع التركيز الإضافي على تحسين صلاحية الخلية عن طريق اختيار إنزيمات هضمية خفيفة ، والتحكم في وقت الهضم ، وتطبيق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). أخيرا ، قمنا بعزل خلايا CD45 ⁺ من تعليق الخلايا غير القلبية التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول ، ثم أجرينا scRNA-seq.

Introduction

احتشاء عضلة القلب (MI) هو واحد من أكثر أمراض القلب والأوعية الدموية شيوعا ، ويزداد معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم¹. يحدث MI بسبب عدم كفاية إمدادات الدم إلى عضلة القلب المحيطة ، والتي يمكن أن تكون نتيجة لانسداد الشريان التاجي الذي يحدث مع تمزق لوحة تصلب الشرايين. على الرغم من أن التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) قد قلل من معدلات وفيات مرضى MI الحاد ، إلا أن ارتفاع معدل انتشار قصور القلب بعد MI لا يزال يمثل^{مشكلة 2}. الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية الكامنة وراء قصور القلب بعد MI هي استجابة الجسم التعويضية لإصابات القلب ، والتي تنطوي على استبدال عضلة القلب الميتة بندوب ليفية غير مقلصة. تعتمد هذه الاستجابات التكيفية بشكل كبير على الالتهاب الموضعي بوساطة التفاعلات بين أنواع الخلايا المتعددة وخلايا أنسجة القلب ، ويعتبر هذا الالتهاب الآن هدفا علاجيا محتملا لتقليل تكوين الندبة الليفية ، وبالتالي الحماية من قصور القلب بعد MI ^3,4. ومن المثير للاهتمام أن البيئة المكروية في موقع الاحتشاء تشهد انتقالا يعتمد على الوقت في أنواع الخلايا المتسللة ووظائفها في مراحل مختلفة من MI ^1,5. أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا غير القلبية (مثل الخلايا المناعية والخلايا الليفية والخلايا البطانية) تلعب أدوارا مركزية في التهاب ما بعد MI وإصلاح الأنسجة ^5,6. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تسلسل الخلية الواحدة على نطاق واسع كأداة قوية لتوضيح مشاركات ووظائف الخلايا العضلية غير القلبية في البيئة الدقيقة بعد MI ^7,8_. يوفر هذا نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية لإصابة وإصلاح ما بعد MI وتطوير العلاجات المحتملة ضد قصور القلب بعد MI.

تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNA-Seq) هو تقنية تستخدم لدراسة النسخ الكاملة بتفصيل كبير باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) ⁷،^8،9. في الآونة الأخيرة ، أحدث تطوير scRNA-Seq ثورة في مجال البحوث الطبية الحيوية. بالمقارنة مع التسلسل السائب التقليدي ، يحلل scRNA-Seq ملفات تعريف التعبير الجيني وعدم تجانس النسخ على مستوى الخلية^{الواحدة 7,8}. تعزز هذه التقنية بشكل كبير البحث في الفيزيولوجيا المرضية الخلوية ل MI ^9,10 من خلال تحديد أنواع الخلايا المتداولة المختلفة في البيئة المكروية بعد MI والكشف عن التفاعل بين خلايا عضلة القلب والخلايا العضلية غير القلبية. تساهم هذه النتائج أيضا في الكشف عن أهداف علاجية جديدة لفشل القلب بعد MI. بشكل عام ، تتضمن تجربة ما بعد MI القائمة على scRNA-seq ثلاثة أقسام رئيسية: (1) إنشاء نموذج حيواني بعد MI. (2) إعداد تعليق الخلية ؛ و (3) تسلسل العينات وتحليل البيانات. من الملاحظ أن تحضير تعليق الخلية هو الخطوة الأكثر أهمية في إعداد تجربة scRNA-Seq لأن جودة تعليق الخلية تحدد دقة النتائج.

تم تصميم هذا البروتوكول لاستخراج تعليق الخلايا غير القلبية من الأنسجة القلبية بعد MI. بشكل ملحوظ ، يتم تضمين التفاصيل المحددة للحفاظ على صلاحية الخلية وحلها. وفي الوقت نفسه ، يمكن العثور على المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول ، مثل المجموعات الجراحية للفئران وأجهزة تهوية القوارض وأجهزة الطرد المركزي ، في معظم مراكز التجارب على الحيوانات والمختبرات الطبية الحيوية ، وبالتالي ، فإن تكلفة تجربة هذا البروتوكول منخفضة نسبيا. علاوة على ذلك ، إذا تم النظر في النقاط الزمنية ومواقع الاحتشاء كمتغيرات ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمحاكاة مجموعة واسعة من السيناريوهات السريرية ، خاصة بالنسبة لمضاعفات ما بعد MI.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر في جامعة تشجيانغ وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الاستشارية للحيوانات في جامعة تشجيانغ.

1. جراحة ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر (ربط LAD)

ملاحظة: تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع كنماذج. تم حصاد القلوب بعد 2 أسابيع من MI. تم إجراء جراحة ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر كما هو موضح سابقا وأظهر¹¹.

1. تطهير الأدوات الجراحية مع 70 ٪ من الإيثانول قبل الجراحة.
2. وزن الفأر ، ثم تخدير الفأر بالحقن داخل الصفاق من 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ / كغ). راقب منعكس قرصة إصبع القدم ، وقم بقياس معدل التنفس لتقييم عمق التخدير أثناء العملية.
3. ضع الماوس على طاولة العمليات مع وسادة تسخين 37 درجة مئوية. استخدم مرهم العيون لمنع جفاف العين.
4. قم بإزالة الشعر من صدره ورقبته اليسرى باستخدام كريم مزيل الشعر ، واستخدم مسحات قطنية لإزالة الشعر. تطهير الجلد مع iodophor ، تليها 70 ٪ الكحول لتنظيف المنطقة ثلاث مرات.
5. إجراء شق عنق الرحم في خط الوسط (0.8-1.0 سم) تحت المجهر. افصل الجلد والعضلات والأنسجة المحيطة بالقصبة الهوائية ، ثم أدخل قنية 20 جم في القصبة الهوائية.
   ملاحظة: راقب أثناء إدخال القنية في القصبة الهوائية تحت المنظر المجهري للتأكد من عدم إدخال الأنبوب في المريء.
6. قم بتوصيل الماوس بجهاز تهوية القوارض الذي تم ضبطه على حجم المد والجزر 0.2 مل مع 150 ضربة في الدقيقة.
7. شق صدر الفأر بشكل غير مباشر على طول خط منتصف الترقوة بمقص معقم. تشريح الأنسجة تحت الجلد لفضح الأضلاع.
8. استخدم مقص معقم لقطع الجلد بشكل غير مباشر على طول خط منتصف الترقوة الأيسر (0.8-1.0 سم). إجراء بضع الصدر الأيسر لفصل الضلوع الثالثة والرابعة لفضح القلب. استخدم ضامد الضلع للحصول على رؤية واضحة.
9. افتح التامور بالملقط المنحني ، ثم اربط الشريان النازل الأمامي الأيسر (أسفل ملحق الأذين الأيسر) باستخدام خياطة حريرية 7-0. يشير الجدار الأمامي الشاحب للبطين الأيسر إلى أن نضح عضلة القلب قد توقف بنجاح.
10. حرر ضامد الضلع ، وقم بخياطة الشق الصدري في طبقات بخياطة حريرية 5-0 أثناء طرد الهواء من الصدر. غرزة شق الرقبة مع خياطة الحرير 5-0 خياطة.
11. قم بإزالة أنبوب القصبة الهوائية من الماوس بمجرد استعادة التنفس التلقائي. حقن داخل الصفاق 0.5 مل من محلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا. حقن البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) كل 12 ساعة تحت الجلد لتقليل الألم.
12. أخيرا ، ضع الماوس على وسادة التدفئة لانتظار الإنعاش. راقب الماوس للتأكد من أنه لا يعاني من ضيق التنفس المفرط أو النزيف عبر الملاحظة البصرية.
13. أعد الماوس إلى قفصه بعد استيقاظه. في الأسبوع الأول ، راقب الماوس يوميا للتحقق من أن حركته وعاداته وعاداته الغذائية كافية. وفقا لاحتياجات التجربة ، احصد القلب في نقاط زمنية مختلفة بعد MI.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم إعداد تعليق الخلية الواحدة مع القلب بعد 2 أسابيع من MI.

2. إعداد تعليق خلية واحدة القلب

1. إعداد الحلول والإعلام
   1. المخزن المؤقت لتفكك أنسجة القلب: امزج 10 مجم من كولاجيناز IV (600 وحدة / مل) ، و 5 مجم من ديسباز II (0.5 وحدة / مل) ، و 50 ميكرولتر من DNase I (100 ميكروغرام / مل) في 5 مل من RPMI 1640. قم بتسخين هذه الوسيلة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام.
   2. المخزن المؤقت للغسيل الخلوي: قم بإعداد 1٪ BSA أو 10٪ FBS في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، PH 7.4) ، واحتفظ به عند 4 درجات مئوية أو على الثلج.
   3. محلول التروية: برنامج تلفزيوني بارد مسبقا (PH 7.4) كمحلول تروية.
   4. المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC): استخدم المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء كما هو مذكور من قبل الشركة المصنعة.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للاطلاع على قائمة الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة.
2. القتل الرحيم للفأر عن طريق حقن الصوديوم الخماسي داخل الصفاق (150 مجم / كجم).
3. تشريح القلب
   1. ضع الماوس في وضع ضعيف عن طريق تثبيت أطرافه الخلفية في مكانها بشريط لاصق.
   2. رش الجسم بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قطعه عموديا من خلال جلد البطن والعضلات مع تجنب ثقب الكبد. افتح الصدر بعناية مع تجنب ثقب القلب.
   3. استخدم برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا (PH 7.4) لتغذية البطين الأيسر حتى يتم ملاحظة سائل التروية عديم اللون (هناك حاجة إلى حوالي 15 مل من PBS [pH 7.4]).
   4. ارفع القلب برفق من الصدر بالملقط ، واقطع الأنسجة الزائدة المرتبطة بالجزء الخارجي من القلب بمقص العيون. ضع القلب في 1 مل من PBS المبرد مسبقا (PH 7.4) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
4. التفكك الأنزيمي لأنسجة القلب
   1. نقل قلب الفأر إلى بئر واحد من لوحة 24 بئر مع 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفكك أنسجة القلب وضعت على الجليد ، وتقطيعه إلى قطع صغيرة (~ 1 مم) بمقص.
   2. انقل أنسجة القلب المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع 5 مل من محلول تفكك الأنسجة.
      ملاحظة: حجم المخزن المؤقت لتفكك أنسجة القلب الموصى به هو 5 مل / قلب.
   3. ضع أنبوب الطرد المركزي في شاكر ترددي ثرموستاتي كهربائيا عند 125 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ماصة تعليق الأنسجة صعودا وهبوطا 10 مرات كل 20 دقيقة.
   4. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الأنسجة والكتل غير المهضومة. أضف 25 مل من المخزن المؤقت لغسل الخلايا لشطف الأنبوب الأصلي ، ثم انقله لشطف مصفاة الخلية. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة كتل الخلايا بشكل أكبر.
   5. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية المفلترة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق عينة الخلية في 1x RBC lysis buffer لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   6. أضف حجما أكبر بأربع مرات من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   7. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   8. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت لغسيل الخلايا.
   9. امزج 18 ميكرولتر من معلق الخلية مع 2 ميكرولتر من محلول تلطيخ برتقال أكريدين (AO) / بروبيديوم يوديد (PI) (9: 1) ، وأضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى شريحة غرفة العد. قم بتقييم أرقام الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد الخلايا التلقائي.

النتائج

تم الحصول على تعليق أحادي الخلية ذو حيوية عالية من خلال تنفيذ القسم 2 من هذا البروتوكول. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن ملاحظة شظايا الخلايا (الشكل 1 أ) ؛ ومن ثم ، تم إجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لزيادة تحسين الجودة¹⁶. بعد FACS ، ينخفض متوسط حجم الخلية من 9.6 ميكر...

Discussion

تهدف هذه المقالة إلى وصف بروتوكول لعزل الخلايا العضلية غير القلبية المفردة من قلوب الفئران بعد MI. يمكن تطبيق البروتوكول لعزل أنواع مختلفة من الخلايا في البيئة المكروية بعد MI بجودة عالية ، بما في ذلك الخلايا المناعية والخلايا البطانية والخلايا الليفية. هناك ثلاثة عوامل أساسية حاسمة للحصو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos biosystems	F23001
Automated Cell Counter	Logos biosystems	L20001
Bovine Serum Albumin	Servicebio	G5001	Cytoprotective effect
Cell Counting Slides	Logos biosystems	L12001
Collagenase Type IV	Gibco	17104019	Digestive enzymes
Dispase II	Sigma	D4693	Digestive enzymes
Dnase I	Roche	11284932001	Prevent cell clumping
Falcon 40μm Cell Strainer	Falcon	352340	Remove cell clumps
Falcon 70μm Cell Strainer	Falcon	352350	Remove undigested tissue and clumps
Flow Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Iodophor	OU QING SI	10054963976859
Needle Holder	FST	12061-01
Ophthalmic Forceps	RWD	F14012-10
Ophthalmic Scissors	RWD	S11036-08
Phosphate Buffered Saline	Servicebio	G4202-500ML
RBC Lysis Buffer	Beyotime	C3702-120ml	Remove red blood cells
Rib Retractor	FST	17005-04
Rodent Ventilator	Harvard	730043
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	Solvent solution of enzyme
Sterile Scissor	RWD	S14014-10