Получение некардиомиоцитарной клеточной суспензии для секвенирования одноклеточной РНК из сердца взрослой мыши после инфаркта миокарда

Резюме

Здесь мы описываем протокол для выделения достаточного количества единичных некардиомиоцитов с высокой жизнеспособностью из сердца мыши после инфаркта миокарда (ИМ). Это может быть использовано для последующего секвенирования отдельных клеток, анализа проточной цитометрии и первичной клеточной культуры.

Аннотация

Инфаркт миокарда (ИМ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний с ростом смертности во всем мире. Некардиомиоциты составляют более половины всей популяции сердечных клеток, и они способствуют адаптивной компенсации при повреждении миокарда, включая воспалительные реакции, восстановление тканей и образование рубцов. Для изучения микроокружения сердца после инфаркта миокарда широко используется секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) для идентификации различных типов сердечных клеток и межклеточных коммуникаций. Среди процедур подготовки образца scRNA-seq приготовление клеточной суспензии является одним из наиболее важных этапов, поскольку жизнеспособность клеток может повлиять на качество результатов scRNA-seq. Поэтому мы разработали экспериментальный протокол для получения суспензии некардиомиоцитарных клеток из сердец мышей после инфаркта миокарда с дополнительным акцентом на улучшение жизнеспособности клеток путем выбора мягких пищеварительных ферментов, контроля времени пищеварения и применения флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Наконец, мы выделили CD45⁺ клетки из суспензии некардиомиоцитарных клеток, полученной по этому протоколу, а затем провели секвенирование скРНК.

Введение

Инфаркт миокарда (ИМ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний, и смертность от него растет во всем^мире1. Инфаркт миокарда вызван недостаточным кровоснабжением окружающего миокарда, что может быть результатом закупорки коронарной артерии, возникающей при разрыве атеросклеротической бляшки. Хотя чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) снизило показатели смертности пациентов с острым инфарктом миокарда, высокая распространенность сердечной недостаточности после инфаркта миокарда остается проблемой². Ключевой патофизиологией, лежащей в основе сердечной недостаточности после инфаркта миокарда, является компенсаторная реакция организма на сердечные повреждения, которая включает замену мертвой сердечной мышцы несократительными фиброзными рубцами. Эти адаптивные реакции в значительной степени зависят от местного воспаления, опосредованного взаимодействиями между несколькими типами клеток и клетками сердечной ткани, и это воспаление в настоящее время рассматривается как потенциальная терапевтическая мишень для уменьшения образования фиброзных рубцов и, таким образом, защиты от сердечной недостаточности после инфаркта^{миокарда 3,4}. Интересно, что микроокружение в месте инфаркта испытывает зависящий от времени переход в инфильтрационных типах клеток и функционирует на разных стадиях ИМ ^1,5. Многие исследования показали, что некардиомиоциты (например, иммунные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки) играют центральную роль в воспалении после инфаркта миокарда и восстановлении тканей ^5,6. В последние годы секвенирование отдельных клеток широко используется в качестве мощного инструмента для выяснения вовлеченности и функций некардиомиоцитов в микросреде после инфаркта^{миокарда 7,8}_. Это дает представление о патофизиологии травмы и восстановления после инфаркта миокарда, а также о разработке потенциальных методов лечения сердечной недостаточности после инфаркта миокарда.

Высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-Seq) — это метод, используемый для подробного изучения целых транскриптомов с использованием секвенирования следующего поколения (NGS)^7,8,9. В последнее время разработка scRNA-Seq произвела революцию в области биомедицинских исследований. По сравнению с обычным массовым секвенированием, scRNA-Seq анализирует профили экспрессии генов и гетерогенность транскрипции на уровне отдельных клеток ^7,8. Этот метод значительно способствует исследованию клеточной патофизиологии ИМ ^9,10 путем идентификации различных типов циркулирующих клеток в микроокружении после ИМ и выявления взаимодействия между кардиомиоцитами и некардиомиоцитами. Эти результаты также способствуют выявлению новых терапевтических целей для сердечной недостаточности после инфаркта миокарда. В целом, эксперимент после инфаркта миокарда на основе scRNA-seq включает три основных раздела: (1) создание модели животных после инфаркта миокарда; (2) приготовление клеточной суспензии; и (3) секвенирование образцов и анализ данных. Примечательно, что приготовление клеточной суспензии является наиболее важным этапом подготовки эксперимента scRNA-Seq, поскольку качество клеточной суспензии определяет точность результатов.

Этот протокол предназначен для извлечения суспензии некардиомиоцитарных клеток из сердечной ткани после инфаркта миокарда; Важно отметить, что включены конкретные детали для поддержания жизнеспособности и разрешения клеток. Между тем, оборудование, используемое в этом протоколе, такое как хирургические наборы для мышей, аппараты искусственной вентиляции легких грызунов и центрифуги, можно найти в большинстве экспериментальных центров на животных и биомедицинских лабораторий, и, таким образом, стоимость эксперимента по этому протоколу относительно низкая. Кроме того, если рассматривать временные моменты и места инфаркта в качестве переменных, этот протокол может быть применен для моделирования широкого спектра клинических сценариев, особенно для осложнений после ИМ.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных в Чжэцзянском университете и были одобрены Консультативным комитетом по животным Чжэцзянского университета.

1. Операция по перевязке левой передней нисходящей коронарной артерии (перевязка LAD)

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве моделей использовались восьминедельные самцы мышей C57BL/6J. Сердца были собраны через 2 недели после инфаркта миокарда. Операция по перевязке левой передней нисходящей коронарной артерии была выполнена, как описано ранее и продемонстрировано¹¹.

1. Перед операцией продезинфицируйте хирургические инструменты 70% этанолом.
2. Взвесьте мышь, а затем обезболите мышь внутрибрюшинными инъекциями 1% пентобарбитала натрия (50 мг / кг). Наблюдайте за рефлексом защемления пальцев ног и измеряйте частоту дыхания, чтобы оценить глубину анестезии во время процедуры.
3. Поместите мышь на операционный стол с грелкой 37 °C. Используйте офтальмологическую мазь для предотвращения обезвоживания глаз.
4. Проведите депиляцию левой прекардиальной груди и шеи кремом для депиляции и используйте ватные палочки для удаления волосков. Продезинфицируйте кожу йодофором, а затем 70% спиртом очистите область три раза.
5. Выполните срединный разрез шейки матки (0,8-1,0 см) под микроскопом. Отделите кожу, мышцы и ткани, окружающие трахею, а затем вставьте канюлю 20G в трахею.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте при введении канюли в трахею под микроскопическим видом, чтобы убедиться, что трубка не вставлена в пищевод.
6. Подключите мышь к аппарату искусственной вентиляции легких грызунов, установленному на дыхательный объем 0,2 мл со скоростью 150 ударов в минуту.
7. Надрежьте грудную клетку мыши наискось по среднеключичной линии стерильными ножницами. Рассеките подкожную клетчатку, чтобы обнажить ребра.
8. Стерильными ножницами разрежьте кожу наискось вдоль левой среднеключичной линии (0,8-1,0 см). Выполните левую торакотомию, чтобы разделить третье и четвертое ребра, чтобы обнажить сердце. Используйте реберное втягивающее устройство для четкого обзора.
9. Вскрывают перикард изогнутыми щипцами, а затем перевязывают левую переднюю нисходящую артерию (ниже придатка левого предсердия) с помощью шелкового шва 7-0. Бледная передняя стенка левого желудочка свидетельствует о том, что перфузия миокарда успешно прервана.
10. Отпустите ретрактор ребра и сшивайте грудной разрез слоями шелковым швом 5-0, выталкивая воздух из грудной клетки. Зашить разрез шеи шовным шелковым швом 5-0.
11. Удалите трахеальную трубку из мыши, как только ее спонтанное дыхание восстановится. Внутрибрюшинно вводят 0,5 мл предварительно подогретого стерильного физиологического раствора. Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг) каждые 12 ч подкожно, чтобы свести к минимуму боль.
12. Наконец, поместите мышь на грелку, чтобы дождаться реанимации. Следите за мышью, чтобы убедиться, что она не страдает от чрезмерной одышки или кровотечения с помощью визуального наблюдения.
13. Верните мышь в клетку после того, как она проснется. В течение первой недели ежедневно наблюдайте за мышью, чтобы убедиться, что ее подвижность, уход и пищевые привычки адекватны. В соответствии с потребностями эксперимента, собирайте сердце в разные моменты времени после инфаркта миокарда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе одноклеточная суспензия была приготовлена с сердцем через 2 недели после ИМ.

2. Приготовление сердечной одноклеточной суспензии

1. Приготовление растворов и сред
   1. Буфер диссоциации сердечной ткани: смешайте 10 мг коллагеназы IV (600 ЕД / мл), 5 мг диспазы II (0,5 ЕД / мл) и 50 мкл ДНКазы I (100 мкг / мл) в 5 мл RPMI 1640. Перед употреблением предварительно подогрейте это средство до 37 °C на водяной бане.
   2. Буфер для промывки клеток: приготовьте 1% BSA или 10% FBS в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS, PH 7,4) и храните при температуре 4 ° C или на льду.
   3. Перфузионный раствор: предварительно охладить PBS (рН 7,4) в качестве перфузионного раствора.
   4. Буфер лизиса эритроцитов (эритроцитов): Используйте буфер лизиса эритроцитов, как указано производителем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Список реагентов и оборудования, использованных в этом исследовании, см. в Таблице материалов .
2. Усыпьте мышь внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (150 мг / кг).
3. Рассечение сердца
   1. Поместите мышь в положение лежа на спине, зафиксировав ее задние конечности на месте с помощью клейкой ленты.
   2. Сбрызните тело 70% этанолом, а затем разрежьте вертикально через кожу живота и мышцы, избегая прокалывания печени. Осторожно откройте грудную клетку, избегая прокола сердца.
   3. Используйте предварительно охлажденный PBS (рН 7,4) для перфузии левого желудочка до тех пор, пока не будет обнаружена бесцветная перфузионная жидкость (требуется примерно 15 мл PBS [pH 7,4]).
   4. Аккуратно поднимите сердце из грудной клетки щипцами и отрежьте лишнюю ткань, прикрепленную к внешней стороне сердца, с помощью офтальмологических ножниц. Поместите сердце в 1 мл предварительно охлажденного PBS (рН 7,4) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
4. Ферментативная диссоциация сердечной ткани
   1. Перенесите сердце мыши в одну лунку 24-луночной пластины со 150 мкл буфера диссоциации сердечной ткани, помещенного на лед, и разрежьте его на мелкие кусочки (~1 мм) ножницами.
   2. Переведите измельченную сердечную ткань в центрифужную пробирку объемом 15 мл с 5 мл буфера диссоциации тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый объем буфера диссоциации сердечной ткани составляет 5 мл / сердце.
   3. Поместите центрифужную пробирку в электрически термостатический возвратно-поступательный шейкер при 125 об/мин на 1 ч при 37 °C. Пипетка тканевой суспензии вверх и вниз 10 раз каждые 20 мин.
   4. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 70 мкм, чтобы удалить непереваренную ткань и комки. Добавьте 25 мл буфера для промывки клеток, чтобы промыть исходную пробирку, а затем перенесите ее для промывки клеточного фильтра. Затем отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 40 мкм для дальнейшего удаления клеточных комков.
   5. Центрифугу суспензию отфильтрованных клеток при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем ресуспендируйте образец клетки в буфере лизиса 1x эритроцитов в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
   6. Добавьте в четыре раза больший объем буфера для промывки клеток и центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при 4 ° C.
   7. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 10 мл буфера для промывки клеток. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
   8. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера для промывки клеток.
   9. Смешайте 18 мкл клеточной суспензии с 2 мкл раствора для окрашивания акридина оранжевого (AO)/йодида пропидия (PI) (9:1) и добавьте 10 мкл смеси в предметное стекло счетной камеры. Оцените количество клеток и жизнеспособность с помощью автоматического счетчика ячеек.

Результаты

Одноклеточная суспензия с высокой жизнеспособностью была получена путем реализации раздела 2 этого протокола. Тем не менее, фрагменты клеток все еще можно наблюдать (рис. 1А); следовательно, для дальнейшего улучшения качества была выполнена сортировка клеток, активиров?...

Обсуждение

Эта статья была направлена на описание протокола выделения единичных некардиомиоцитов из сердца мыши после ИМ. Протокол может быть применен для выделения различных типов клеток в микроокружении после инфаркта миокарда с высоким качеством, включая иммунные клетки, эндотелиальные кле?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos biosystems	F23001
Automated Cell Counter	Logos biosystems	L20001
Bovine Serum Albumin	Servicebio	G5001	Cytoprotective effect
Cell Counting Slides	Logos biosystems	L12001
Collagenase Type IV	Gibco	17104019	Digestive enzymes
Dispase II	Sigma	D4693	Digestive enzymes
Dnase I	Roche	11284932001	Prevent cell clumping
Falcon 40μm Cell Strainer	Falcon	352340	Remove cell clumps
Falcon 70μm Cell Strainer	Falcon	352350	Remove undigested tissue and clumps
Flow Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Iodophor	OU QING SI	10054963976859
Needle Holder	FST	12061-01
Ophthalmic Forceps	RWD	F14012-10
Ophthalmic Scissors	RWD	S11036-08
Phosphate Buffered Saline	Servicebio	G4202-500ML
RBC Lysis Buffer	Beyotime	C3702-120ml	Remove red blood cells
Rib Retractor	FST	17005-04
Rodent Ventilator	Harvard	730043
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	Solvent solution of enzyme
Sterile Scissor	RWD	S14014-10