Preparación de una suspensión de células no cardiomiocitos para la secuenciación de ARN unicelular de un corazón de ratón adulto postinfarto de miocardio

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para aislar una cantidad suficiente de miomiocitos únicos no cardiomiocitos con alta viabilidad de un corazón de ratón post-infarto de miocardio (IM). Esto se puede utilizar para la secuenciación posterior de una sola célula, el análisis de citometría de flujo y el cultivo celular primario.

Resumen

El infarto de miocardio (IM) es una de las enfermedades cardiovasculares más comunes, con un aumento de la mortalidad en todo el mundo. Los no cardiomiocitos representan más de la mitad de la población total de células cardíacas y contribuyen a las compensaciones adaptativas en caso de lesión miocárdica, incluidas las respuestas inflamatorias, la reparación de tejidos y la formación de cicatrices. Para estudiar el microambiente cardíaco post-IM, la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) se usa ampliamente para identificar diferentes tipos de células cardíacas y comunicaciones intercelulares. Entre los procedimientos de preparación de muestras de scRNA-seq, la preparación de la suspensión celular es uno de los pasos más críticos, porque la viabilidad celular puede afectar la calidad de los resultados de scRNA-seq. Por lo tanto, diseñamos un protocolo experimental para preparar una suspensión de células no cardiomiocitos de corazones de ratón post-IM con un enfoque adicional en mejorar la viabilidad celular mediante la elección de enzimas digestivas suaves, el control del tiempo de digestión y la aplicación de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Finalmente, aislamos células CD45⁺ de la suspensión celular no cardiomiocitaria obtenida a través de este protocolo, y luego realizamos scRNA-seq.

Introducción

El infarto de miocardio (IM) es una de las enfermedades cardiovasculares más comunes, y su mortalidad aumenta en todo el mundo¹. El IM es causado por un suministro insuficiente de sangre al miocardio circundante, que puede ser el resultado de un bloqueo de la arteria coronaria que ocurre con la ruptura de la placa aterosclerótica. A pesar de que la intervención coronaria percutánea (ICP) ha reducido las tasas de mortalidad de los pacientes con IM agudo, la alta prevalencia de insuficiencia cardíaca después del IM sigue siendo un problema². La fisiopatología clave que subyace a la insuficiencia cardíaca post-IM es la resp....

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio en la Universidad de Zhejiang y fueron aprobados por el Comité Asesor de Animales de la Universidad de Zhejiang.

1. Cirugía de ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (ligadura LAD)

NOTA: Se utilizaron ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad como modelos. Los corazones fueron cosechados 2 semanas después del IM. La cirugía de ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda se llevó a cabo como se describió y demostró

Resultados

Se obtuvo una suspensión unicelular con alta vitalidad mediante la implementación de la sección 2 de este protocolo. Sin embargo, todavía se podían observar fragmentos celulares (Figura 1A); por lo tanto, se realizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para mejorar aún más la calidad¹⁶. Después del FACS, el tamaño celular promedio se reduce de 9,6 μm a 9,1 μm ( Tabla 1), lo que sugiere que la proporción de fragmento.......

Discusión

Este artículo tuvo como objetivo describir un protocolo para aislar no cardiomiocitos individuales de corazones de ratón después del IM. El protocolo se puede aplicar para aislar diferentes tipos de células en el microambiente post-MI con alta calidad, incluidas las células inmunes, las células endoteliales y los fibroblastos. Tres factores esenciales son cruciales para obtener una suspensión celular de alta calidad para la secuenciación de una sola célula. El primero es el ajuste de la digestión enzimática. E.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos biosystems	F23001
Automated Cell Counter	Logos biosystems	L20001
Bovine Serum Albumin	Servicebio	G5001	Cytoprotective effect
Cell Counting Slides	Logos biosystems	L12001
Collagenase Type IV	Gibco	17104019	Digestive enzymes
Dispase II	Sigma	D4693	Digestive enzymes
Dnase I	Roche	11284932001	Prevent cell clumping
Falcon 40μm Cell Strainer	Falcon	352340	Remove cell clumps
Falcon 70μm Cell Strainer	Falcon	352350	Remove undigested tissue and clumps
Flow Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Iodophor	OU QING SI	10054963976859
Needle Holder	FST	12061-01
Ophthalmic Forceps	RWD	F14012-10
Ophthalmic Scissors	RWD	S11036-08
Phosphate Buffered Saline	Servicebio	G4202-500ML
RBC Lysis Buffer	Beyotime	C3702-120ml	Remove red blood cells
Rib Retractor	FST	17005-04
Rodent Ventilator	Harvard	730043
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	Solvent solution of enzyme
Sterile Scissor	RWD	S14014-10