Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yetişkin Fare Kalbinden Tek Hücreli RNA Dizilimi için Kardiyomiyosit Olmayan Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

Özet

Burada, miyokard enfarktüsü sonrası (MI) fare kalbinden yüksek canlılığa sahip yeterli miktarda tek kardiyomiyosit olmayan izole etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu, sonraki tek hücreli dizileme, akış sitometri analizi ve birincil hücre kültürü için kullanılabilir.

Özet

Miyokard enfarktüsü (MI), tüm dünyada mortalitesi giderek artan en yaygın kardiyovasküler hastalıklardan biridir. Non-kardiyomiyositler toplam kardiyak hücre popülasyonunun yarısından fazlasını oluşturur ve enflamatuar yanıtlar, doku onarımı ve skar oluşumu dahil olmak üzere miyokard hasarı üzerine adaptif kompanzasyonlara katkıda bulunurlar. MI sonrası kardiyak mikroçevreyi incelemek için, tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), farklı kardiyak hücre tiplerini ve hücreler arası iletişimi tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. ScRNA-seq numune hazırlama prosedürleri arasında, hücre süspansiyonunun hazırlanması en kritik adımlardan biridir, çünkü hücre canlılığı scRNA-seq sonuçlarının kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, hafif sindirim enzimlerini seçerek, sindirim süresini kontrol ederek ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) uygulayarak hücre canlılığını iyileştirmeye odaklanarak, MI sonrası fare kalplerinden kardiyomiyosit olmayan bir hücre süspansiyonu hazırlamak için deneysel bir protokol tasarladık. Son olarak, CD45⁺ hücrelerini bu protokol ile elde edilen kardiyomiyosit olmayan hücre süspansiyonundan izole ettik ve daha sonra scRNA-seq uyguladık.

Giriş

Miyokard enfarktüsü (MI) en sık görülen kardiyovasküler hastalıklardan biridir ve mortalitesi tüm dünyada artmaktadır¹. MI, aterosklerotik plak rüptürü ile ortaya çıkan koroner arter tıkanıklığının bir sonucu olabilen çevredeki miyokarda yetersiz kan akışından kaynaklanır. Perkütan koroner girişim (PKG) akut MI hastalarının mortalite oranlarını azaltmış olsa da, MI sonrası kalp yetmezliği prevalansının yüksek olması bir sorun olmaya devam etmektedir². MI sonrası kalp yetmezliğinin altında yatan anahtar patofizyoloji, ölü kalp kasının kontraktil olmayan fibrotik yara izleriyle değiştirilmesini içeren vücudun kalp yaralanmalarına telafi edici tepkisidir. Bu adaptif yanıtlar önemli ölçüde çoklu hücre tipleri ve kalp dokusu hücreleri arasındaki etkileşimlerin aracılık ettiği lokal inflamasyona dayanır ve bu inflamasyon şimdi fibrotik skar oluşumunu azaltmak ve böylece MI sonrası kalp yetmezliğine karşı korunmak için potansiyel bir terapötik hedef olarak kabul edilmektedir ^3,4. İlginçtir ki, enfarktüs bölgesindeki mikro çevre, MI ^1,5'in farklı aşamalarında sızan hücre tiplerinde ve işlevlerinde zamana bağlı bir geçiş yaşar. Birçok çalışma, kardiyomiyosit olmayanların (örneğin, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri) MI sonrası inflamasyon ve doku onarımında merkezi rol oynadığını göstermiştir ^5,6. Son yıllarda, tek hücreli dizileme, MI sonrası mikroençevre ^7,8'de kardiyomiyosit olmayanların tutulumlarını ve fonksiyonlarını aydınlatmak için güçlü bir araç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır_. Bu, post-MI yaralanma ve onarımının patofizyolojisi ve post-MI kalp yetmezliğine karşı potansiyel tedavilerin geliştirilmesi hakkında fikir verir.

Yüksek verimli RNA dizilimi (RNA-Seq), yeni nesil dizileme (NGS)^7,8,9 kullanarak tüm transkriptomları ayrıntılı olarak incelemek için kullanılan bir tekniktir. Son zamanlarda, scRNA-Seq'in geliştirilmesi biyomedikal araştırma alanında devrim yarattı. Geleneksel yığın dizilemesi ile karşılaştırıldığında, scRNA-Seq, gen ekspresyon profillerini ve transkripsiyonel heterojeniteyi tek hücreli seviye ^7,8'de analiz eder. Bu teknik, MI sonrası mikro ortamda farklı dolaşımdaki hücre tiplerini tanımlayarak ve kardiyomiyositler ile kardiyomiyosit olmayanlar arasındaki etkileşimi ortaya çıkararak MI ^9,10'un hücresel patofizyolojisinin araştırılmasını önemli ölçüde desteklemektedir. Bu bulgular ayrıca MI sonrası kalp yetmezliği için yeni terapötik hedeflerin ortaya çıkarılmasına katkıda bulunmaktadır. Genel olarak, scRNA-seq tabanlı post-MI deneyi üç ana bölümden oluşur: (1) post-MI hayvan modelinin kurulması; (2) hücre süspansiyonunun hazırlanması; ve (3) örnek sıralama ve veri analizi. Dikkat çekici bir şekilde, hücre süspansiyonunun hazırlanması, scRNA-Seq deneyinin hazırlanmasında en kritik adımdır, çünkü hücre süspansiyonunun kalitesi, sonuçların doğruluğunu belirler.

Bu protokol, MI sonrası kalp dokusundan kardiyomiyosit olmayan bir hücre süspansiyonu çıkarmak için tasarlanmıştır; Önemli ölçüde, hücre canlılığını ve çözünürlüğünü korumak için spesifik detaylar dahil edilmiştir. Bu arada, fareler için cerrahi kitler, kemirgen vantilatörleri ve santrifüjler gibi bu protokolde kullanılan ekipmanlar çoğu hayvan deney merkezinde ve biyomedikal laboratuvarda bulunabilir ve bu nedenle bu protokolün deney maliyeti nispeten düşüktür. Ayrıca, zaman noktaları ve enfarktüs bölgelerini değişkenler olarak düşünürsek, bu protokol, özellikle MI sonrası komplikasyonlar için çok çeşitli klinik senaryoları simüle etmek için uygulanabilir.

Protokol

Tüm deneyler, Zhejiang Üniversitesi'ndeki laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için yönergelere uygun olarak yürütülmüş ve Zhejiang Üniversitesi'ndeki Hayvan Danışma Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Sol ön inen koroner arter ligasyonu (LAD ligasyonu) cerrahisi

NOT: Model olarak sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Sol ön inen koroner arter ligasyon cerrahisi daha önce tarif edildiği ve gösterildiği gibi¹¹ yapıldı.

1. Ameliyattan önce cerrahi aletleri %70 etanol ile dezenfekte edin.
2. Fareyi tartın ve ardından% 1 pentobarbital sodyum (50 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonlarıyla fareyi uyuşturun. Ayak parmağı sıkışma refleksini gözlemleyin ve prosedür sırasında anestezinin derinliğini değerlendirmek için solunum hızını ölçün.
3. Fareyi 37 °C ısıtma yastığı ile ameliyat masasına yerleştirin. Göz dehidrasyonunu önlemek için oftalmik merhem kullanın.
4. Sol prekordiyal göğsünü ve boynunu tüy dökücü kremle deepiye edin ve tüyleri çıkarmak için pamuklu çubuklar kullanın. Cildini iyot ile dezenfekte edin, ardından bölgeyi üç kez temizlemek için% 70 alkol alın.
5. Mikroskop altında orta hat servikal insizyon (0.8-1.0 cm) yapın. Trakeayı çevreleyen cildi, kası ve dokuyu ayırın ve ardından trakeaya 20 G'lik bir kanül yerleştirin.
   NOT: Kanülü trakeaya mikroskobik görünüm altında sokarken, tüpün yemek borusuna sokulmadığından emin olmak için gözlemleyin.
6. Fareyi dakikada 150 vuruşla 0,2 mL gelgit hacminde ayarlanmış bir kemirgen vantilatörüne bağlayın.
7. Fare göğsünü steril bir makasla orta klaviküler çizgi boyunca eğik bir şekilde kesin. Kaburgaları açığa çıkarmak için deri altı dokusunu diseke edin.
8. Cildi sol orta klaviküler çizgi (0.8-1.0 cm) boyunca eğik olarak kesmek için steril makas kullanın. Kalbi açığa çıkarmak için üçüncü ve dördüncü kaburgaları ayırmak için sol torakotomi yapın. Net bir görüş için bir kaburga ekartörü kullanın.
9. Perikadı kavisli forsepslerle açın ve ardından 7-0 ipek sütür kullanarak sol ön inen arteri (sol atriyum uzantısının altında) bağlayın. Sol ventrikülün soluk bir ön duvarı, miyokard perfüzyonunun başarıyla kesildiğini gösterir.
10. Kaburga retraktörünü serbest bırakın ve göğüsten havayı dışarı atarken torasik insizyonu 5-0 ipek sütür ile katmanlar halinde dikin. Boyun kesisini 5-0 dikişli ipek dikiş ile dikin.
11. Spontan solunumu geri yüklendikten sonra trakea tüpünü fareden çıkarın. İntraperitoneal olarak 0.5 mL önceden ısıtılmış steril salin enjekte edin. Ağrıyı en aza indirmek için deri altından her 12 saatte bir buprenorfin (0.1 mg / kg) enjekte edin.
12. Son olarak, resüsitasyonu beklemek için fareyi ısıtma yastığına yerleştirin. Görsel gözlem yoluyla aşırı nefes darlığı veya kanamadan muzdarip olmadığından emin olmak için fareyi izleyin.
13. Uyandıktan sonra fareyi kafesine geri döndürün. İlk hafta boyunca, hareketliliğinin, tımar ve yeme alışkanlıklarının yeterli olduğunu doğrulamak için fareyi günlük olarak izleyin. Deneyin ihtiyaçlarına göre, MI'den sonra kalbi farklı zaman noktalarında toplayın.
    NOT: Bu protokolde, tek hücreli süspansiyon MI'den 2 hafta sonra kalp ile birlikte hazırlandı.

2. Kardiyak tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

1. Çözümlerin ve ortamın hazırlanması
   1. Kardiyak doku ayrışma tamponu: 5 mL RPMI 1640'ta 10 mg kollajenaz IV (600 U / mL), 5 mg dispaz II (0.5 U / mL) ve 50 μL DNaz I (100 μg / mL) karıştırın. Kullanmadan önce bu ortamı bir su banyosunda 37 ° C'ye ısıtın.
   2. Hücre yıkama tamponu: Fosfat tamponlu salin (PBS, PH 7.4) içinde% 1 BSA veya% 10 FBS hazırlayın ve 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.
   3. Perfüzyon çözeltisi: Perfüzyon çözeltisi olarak PBS'yi (PH 7.4) önceden soğutun.
   4. Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu: RBC lizis tamponunu üretici tarafından belirtildiği gibi kullanın.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların listesi için Malzeme Tablosuna bakınız.
2. Fareyi intraperitoneal pentobarbital sodyum (150 mg / kg) enjeksiyonu ile ötenazi yapın.
3. Kalp diseksiyonu
   1. Arka bacaklarını yapışkan bantla yerine sabitleyerek fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
   2. Vücudunuza% 70 etanol püskürtün ve daha sonra karaciğeri delmekten kaçınırken karın derisi ve kasları dikey olarak kesin. Kalbi delmekten kaçınırken göğüs kafesini dikkatlice açın.
   3. Renksiz perfüzyon sıvısı gözlenene kadar sol ventrikülü perfüze etmek için önceden soğutulmuş PBS'yi (PH 7.4) kullanın (yaklaşık 15 mL PBS [pH 7.4] gereklidir).
   4. Kalbi forseps ile göğüs kafesinden yavaşça kaldırın ve kalbin dışına tutturulmuş fazla dokuyu oftalmik makasla kesin. Kalbi, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL önceden soğutulmuş PBS'ye (PH 7.4) yerleştirin.
4. Kalp dokusunun enzimatik ayrışması
   1. Fare kalbini, buz üzerine yerleştirilmiş 150 μL kalp dokusu ayrışma tamponu ile 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve bir makasla küçük parçalara (~ 1 mm) kesin.
   2. Kıyılmış kalp dokusunu, 5 mL doku ayrışma tamponu ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Önerilen kardiyak doku dissosiyasyon tampon hacmi 5 mL/kalptir.
   3. Santrifüj tüpünü elektriksel olarak termostatik pistonlu çalkalayıcıya 125 rpm'de 37 ° C'de 1 saat boyunca yerleştirin. Doku süspansiyonunu her 20 dakikada bir 10 kez yukarı ve aşağı borulayın.
   4. Sindirilmemiş doku ve kümeleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Orijinal tüpü durulamak için hücre yıkama tamponunun 25 mL'sini ekleyin ve ardından hücre süzgecini durulamak için aktarın. Ardından, hücre kümelerini daha da çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
   5. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve ardından hücre örneğini oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 1x RBC lizis tamponunda tekrar askıya alın.
   6. Hücre yıkama tamponunun dört katı daha fazla hacim ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
   7. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri hücre yıkama tamponunun 10 mL'sinde yeniden askıya alın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
   8. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri hücre yıkama tamponunun 1 mL'sinde yeniden askıya alın.
   9. Hücre süspansiyonunun 18 μL'sini 2 μL akridin portakalı (AO) / propidyum iyodür (PI) boyama çözeltisi (9: 1) ile karıştırın ve karışımın 10 μL'sini bir sayım odası slaytına ekleyin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayılarını ve canlılığını değerlendirin.

Sonuçlar

Bu protokolün 2. bölümü uygulanarak yüksek canlılığa sahip tek hücreli bir süspansiyon elde edildi. Bununla birlikte, hücre parçaları hala gözlenebilir (Şekil 1A); Bu nedenle, kaliteyi daha da artırmak için floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) yapılmıştır¹⁶. FACS'den sonra, ortalama hücre boyutu 9.6 μm'den 9.1 μm'ye düşer ( Tablo 1), bu da hücre parçalarının oranının FACS tarafından hücre süspansiyonu...

Tartışmalar

Bu makalede, MI sonrası tek kardiyomiyosit olmayan kardiyomiyositleri fare kalplerinden izole etmek için bir protokolün tanımlanması amaçlanmıştır. Protokol, MI sonrası mikro ortamdaki farklı hücre tiplerini, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri ve fibroblastlar dahil olmak üzere yüksek kalitede izole etmek için uygulanabilir. Tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli bir hücre süspansiyonu elde etmek için üç temel faktör çok önemlidir. Birincisi, enzimatik sindirimin ayarlanmasıdır....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos biosystems	F23001
Automated Cell Counter	Logos biosystems	L20001
Bovine Serum Albumin	Servicebio	G5001	Cytoprotective effect
Cell Counting Slides	Logos biosystems	L12001
Collagenase Type IV	Gibco	17104019	Digestive enzymes
Dispase II	Sigma	D4693	Digestive enzymes
Dnase I	Roche	11284932001	Prevent cell clumping
Falcon 40μm Cell Strainer	Falcon	352340	Remove cell clumps
Falcon 70μm Cell Strainer	Falcon	352350	Remove undigested tissue and clumps
Flow Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Iodophor	OU QING SI	10054963976859
Needle Holder	FST	12061-01
Ophthalmic Forceps	RWD	F14012-10
Ophthalmic Scissors	RWD	S11036-08
Phosphate Buffered Saline	Servicebio	G4202-500ML
RBC Lysis Buffer	Beyotime	C3702-120ml	Remove red blood cells
Rib Retractor	FST	17005-04
Rodent Ventilator	Harvard	730043
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	Solvent solution of enzyme
Sterile Scissor	RWD	S14014-10