JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تمكن مقايسات Pyrosequencing من التنميط الجيني القوي والسريع لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة للحمض النووي للميتوكوندريا في الخلايا أو الأنسجة غير المتجانسة.

Abstract

ارتبطت الطفرات في جينوم الميتوكوندريا (mtDNA) بالأمراض الوراثية الموروثة من الأم. ومع ذلك ، فقد زاد الاهتمام بتعدد أشكال mtDNA في السنوات الأخيرة بسبب القدرة التي تم تطويرها مؤخرا على إنتاج نماذج عن طريق طفرات mtDNA وتقدير جديد للارتباط بين الانحرافات الجينية للميتوكوندريا والأمراض الشائعة المرتبطة بالعمر مثل السرطان والسكري والخرف. Pyrosequencing هي تقنية التسلسل عن طريق التوليف التي تستخدم على نطاق واسع عبر مجال الميتوكوندريا لتجارب التنميط الجيني الروتينية. إن قدرتها على تحمل التكاليف النسبية عند مقارنتها بطرق التسلسل المتوازي الضخمة وسهولة التنفيذ تجعلها تقنية لا تقدر بثمن في مجال علم الوراثة الميتوكوندريا ، مما يسمح بالقياس الكمي السريع للبلازما غير المتجانسة مع زيادة المرونة. على الرغم من التطبيق العملي لهذه الطريقة ، فإن تنفيذها كوسيلة للتنميط الجيني mtDNA يتطلب ملاحظة بعض الإرشادات ، على وجه التحديد لتجنب بعض التحيزات ذات الأصل البيولوجي أو التقني. يحدد هذا البروتوكول الخطوات والاحتياطات اللازمة في تصميم وتنفيذ مقايسات البيروسكونيكز لاستخدامها في سياق قياس التغاير الجنسي.

Introduction

يوجد جينوم الميتوكوندريا في شكل جزيئات دائرية صغيرة (16.5 كيلو بايت) (mtDNA) موجودة في الجزء الأعمق من الميتوكوندريا المسماة المصفوفة وتشفر 13 وحدة فرعية من السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ، بالإضافة إلى tRNAs و rRNAs اللازمة لترجمتها في الموقع بواسطة ريبوسوم الميتوكوندريا1. يمثل هذا الجينوم حوالي 1٪ من جميع البروتينات اللازمة لوظيفة الميتوكوندريا ، والباقي مشفر بواسطة الحمض النووي النووي (nDNA). من المفترض عموما أن الميتوكوندريا مشتقة من حدث اندماج تكافلي داخلي بين سلف ألفا بروتيني وخلية حقيقية النواة سلف. بمجرد حدوث هذا التعايش الافتراضي ، تم نقل المعلومات الوراثية للميتوكوندريا تدريجيا إلى النواة على مدار الدهور ، وهو ما يفسر الاكتناز المذكور أعلاه ل mtDNA عند مقارنته بجينومات البكتيريا الزرقاءالحديثة 2. يتضح هذا النقل للجينات بقوة من خلال وجود امتدادات طويلة من الحمض النووي النووي (nDNA) متماثلة للغاية مع التسلسلات الموجودة في mtDNA. تعد تسلسلات الميتوكوندريا النووية (NUMTs) مصدرا شائعا لسوء التفسير أثناء التنميط الجيني ، ويجب اتخاذ بعض الاحتياطات لتجنب التحيزات النووية عند التنميط الجيني mtDNA3 (الشكل 1 أ).

ميزة أخرى مميزة ل mtDNA هي أن رقم نسخته يختلف باختلاف نوع الخلية ، حيث يتراوح من عشرات إلى آلاف النسخ لكل خلية4. نظرا لهذه الطبيعة متعددة النسخ ، يمكن أن يؤوي mtDNA مجموعة واسعة من الأنماط الجينية داخل خلية واحدة ، مما قد يؤدي إلى توزيع أكثر استمرارية للأليلات على عكس الأليلات المنفصلة المرتبطة بالجينات النووية عند النظر في زيجوت الكروموسومات. يشار إلى عدم تجانس أليلات الميتوكوندريا باسم رأب الميتوكوندريا ، والذي يتم التعبير عنه عادة في النسبة المئوية لانتشار طفرة معينة كنسبة من إجمالي mtDNA في خلية معينة. يمكن أن يتناقض التغاير مع التماثل ، والذي يشير إلى نوع فريد من mtDNA موجود عبر الخلية.

يعد قياس رأب الميتوكوندريا غير المتجانس ذا أهمية خاصة عند تحديد نسبة جزيئات mtDNA التي تؤوي المتغيرات المسببة للأمراض. تأتي هذه المتغيرات في شكل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) ، أو indels الصغيرة ، أو عمليات الحذف واسعة النطاق5. معظم البشر غير متجانسين للمتغيرات المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإنها لا تظهر أي أنماط ظاهرية سريرية ، والتي غالبا ما تظهر فقط عند مستويات أعلى من التغاير من mtDNA الممرض في ظاهرة يشار إليها باسم تأثير العتبة6. في حين أن القيم المرتبطة بالإمراضية تعتمد بشكل كبير على طبيعة الطفرة المسببة للأمراض والأنسجة التي تحدث فيها ، فإنها عادة ما تكون أعلى من 60٪ من البلازما غير المتجانسة7.

هناك العديد من مجالات البحث التي يكون فيها التنميط الجيني للميتوكوندريا شائعا. في المجال الطبي ، يمكن أن يكون اختبار طفرات mtDNA أو قياسها كميا بمثابة معيار تشخيصي لأمراض الميتوكوندريا ، والتي يحتوي الكثير منها على انحرافات mtDNA كأصللها 5. بالإضافة إلى دراسة الطفرات المسببة للأمراض البشرية ، من المرجح أن يزداد انتشار النماذج الحيوانية التي تؤوي SNPs المسببة للأمراض في mtDNA ، نظرا للظهور الأخير لتحرير قاعدة الميتوكوندريا الذي تم تمكينه بواسطة محرري قاعدة السيتوزين المشتقة من DddA (DdCBEs) المستهدفة بالميتوكوندريا 8 و deaminases المستندة إلى TALE (TALEDs) لتحرير قاعدة الأدينين9. سيكون هذا النهج مفيدا في فهم التفاعل بين الأنماط الجينية الشاذة للميتوكوندريا والاختلالات الناتجة عنها. هناك أيضا بحث علمي مستمر في إعادة تشكيل جينوم الميتوكوندريا للاستخدام النهائي كاستراتيجية علاجية في أمراض الميتوكوندريا البشرية من خلال نهج يعرف باسم تحول المغايرة. يتضمن هذا المجال من البحث في المقام الأول توجيه النيوكليازات الخاصة بالطفرة إلى مصفوفة الميتوكوندريا. ينتج عن هذا تدهور تفضيلي ل mtDNA الممرض ، مما يؤدي إلى عمليات إنقاذ في النمط الظاهري10،11،12،13. تتطلب أي تجارب تنطوي على إعادة تشكيل النمط الجيني للميتوكوندريا طريقة كمية قوية لتقييم تحولات التغاير الجنسي.

يتم استخدام مجموعة متنوعة من الطرق للنمط الجيني mtDNA ، وهذه تختلف وفقا لطبيعة الطفرة. تعد طرق تسلسل الجيل التالي (NGS) أكثر دقة عندما يتعلق الأمر بقياس SNPs في mtDNA ؛ ومع ذلك ، تظل هذه الطرق باهظة التكلفة بالنسبة للقياس الكمي الروتيني لرأب الميتوكوندريا ، خاصة إذا كان عدد العينات صغيرا. يمكن أن يسمح تسلسل سانجر أيضا باكتشاف SNPs ؛ ومع ذلك ، فإن هذا النهج ليس كميا وغالبا ما يفشل في اكتشاف مستويات منخفضة من التغاير أو يمكن أن يكون غير دقيق عند تقدير البلازما الغيرية العالية. يقترح Pyrosequencing ، كاختبار يتضمن الحد الأدنى من التحضير ويتيح القياس الكمي السريع للبلازما غير المتجانسة لأي عينة mtDNA ، كحل وسط مناسب بين هذين النقيضين. تم استخدام هذه الطريقة بشكل روتيني لتحديد كمية SNPs الميتوكوندريا من قبل العديد من الباحثين في سياقات مختلفة ، بما في ذلك تحليل الطب الشرعي 14،15 ، والتشخيص السريري 16 ، أو التنميط الجيني ل mtDNA من الخلايا المفردة17.

يتضمن هذا الفحص أول خطوة تضخيم مسبق لتفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة تحيط ب SNP في mtDNA ، والتي يتبعها مقايسة التسلسل عن طريق التوليف باستخدام خيط واحد من amplicon الذي تم إنشاؤه مسبقا. يجب أن يكون أحد البادئين المستخدمين في خطوة التضخيم المسبق هو البيوتينيل في الطرف 5 '، مما سيمكن جهاز pyrosequencing من عزل الشريط المفرد من الحمض النووي لاستخدامه كقالب لتفاعل التسلسل. ثم يتم تلدين التمهيدي التسلسل الثالث على الشريط البيوتينيل المحتفظ به ، والذي يسمح بتخليق الحمض النووي الناشئ كنيوكليوتيدات منقوص الأكسجين ليتم صرفها بترتيب محدد مسبقا في غرفة التفاعل. يسجل جهاز التسلسل الحراري كمية كل قاعدة مدمجة بناء على قراءات مضيئة ، مما يسمح بالتحديد الكمي النسبي لأليلات الميتوكوندريا الطافرة والبرية عند تخليق الحمض النووي (الشكل 1 ب). يتم إنشاء التلألؤ بواسطة إنزيم لوسيفيراز ، الذي ينبعث منه الضوء في وجود ATP الذي يصنعه ATP sulfurylase de novo في كل حدث دمج من البيروفوسفات المنبعث من كل نيوكليوتيد. يمكن تلخيص هذين التفاعلين على النحو التالي:

1. PPi (من دمج النوكليوتيدات) + APS → ATP + كبريتات (ATP sulfurylase)

2. ATP + لوسيفيرين + O 2 → أمبير + PPi + أوكسي لوسيفيرين + CO2 + ضوء (لوسيفيراز)

يمثل اكتشاف قواعد الأدينين بواسطة التسلسل الحراري دون تفاعل ATP المتقاطع مع اللوسيفيراز في التفاعل الثاني تحديا. ومع ذلك ، يتم حل هذا باستخدام نظير الأدينين لتخليق الحمض النووي ، وهو dATPαS. على الرغم من عدم كونه ركيزة مثالية للوسيفيراز ، إلا أنه ينتج تلألؤا أقوى مقارنة بالنيوكليوتيدات الثلاثة الأخرى ، والتي يتم ضبطها رقميا بواسطة جهاز التسلسل الحراري وضبطها على عامل 0.9. بسبب هذا التباين المتأصل ، يقترح تجنب تسلسل الأدينين في موضع SNP (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).

يفصل البروتوكول التالي طريقة تقييم mtDNA heteroplasmy عن طريق pyrosequencing ويحدد الاحتياطات اللازمة في تصميم بادئات التضخيم لتجنب التحيز البيولوجي أو التقني عند التنميط الجيني SNPs في mtDNA. يتضمن الأخير المسح الرقمي واختيار مجموعات التمهيدي ، وتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل المسبق ، وأخيرا تسلسل الفحص وتحسينه. تم عرض مثالين تطبيقيين على المقايسات: أولا ، تحسين المتغير الممرض البشري الأكثر شيوعا m.3243A >G 18 ، والثاني ، التنميط الجيني لخلايا الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) التي خضعت لتحويل التغاير باستخدام التقنيات المطورة في مختبر Minczuk في كامبريدج 10،11،12،19،20،21،22.

Protocol

تم تقديم الموافقة المستنيرة لاستخدام خلايا cybrid البشرية 3243A>G و m.5024C>T MEFs الخالدة المستخدمة في هذه الدراسة. لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة في هذه الحالة حيث لم يتم جمع خلايا المريض في جامعة كامبريدج. ومع ذلك ، قد يتطلب استخدام الخلايا الليفية البشرية موافقة أخلاقية. يوصى بشدة باتباع أفضل الممارسات لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل عند تحضير عينة الحمض النووي ل pyrosequencing. يمكن أن يؤدي التضخيم المتكرر باستخدام مواد أولية متطابقة إلى تلوث الأمبليكون وإدخال التحيز إلى التنميط الجيني اللاحق إذا لم يتم ملاحظة الفصل الصارم بين مناطق ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يستخدم خط الأنابيب المعروض هنا معدات محددة من مصنع وحيد ؛ يمكن العثور على التفاصيل في جدول المواد. يمكن إجراء التصميم التمهيدي ل PCR يدويا إذا رغبت في ذلك ؛ ومع ذلك ، يوصى باستخدام البرامج الموجودة لهذا الغرض (انظر جدول المواد).

1. تصميم التمهيدي Pyrosequencing واختيار الفحص

  1. الحصول على المرشحين التمهيدي مع البرمجيات
    1. الحصول على ملف تسلسل mtDNA للأنواع التي يتم تصنيفها وراثيا ، وتحديد موضع SNP. تأكد من أن التسلسل المرجعي المستخدم يستخدم الترقيم الأساسي المناسب للطفرة المدروسة بحيث يمكن تحديد موضع SNP بسهولة.
    2. انسخ 1000 زوج أساسي في المنبع والمصب لموقع SNP ، والصق التسلسل المقطوع في البرنامج المخصص لتصميم التمهيدي pyrosequencing (انظر جدول المواد).
    3. قم بتعيين قاعدة SNP التي تم تحليلها كهدف لمقايسة pyrosequencing في البرنامج من خلال تمييز القاعدة متعددة الأشكال والنقر بزر الماوس الأيمن ثم تحديد المنطقة المستهدفة المحددة.
    4. اضغط على أيقونة التشغيل في الزاوية العلوية اليمنى من الواجهة لبدء اختيار التمهيدي.
    5. انتظر حتى يقوم البرنامج الآن بإنشاء ثلاثيات أولية تلقائيا: بادئان للتضخيم المسبق للقالب DNA وبرايمر ثالث للتسلسل عن طريق التوليف في آلة pyrosequencing. احتفظ بجميع مجموعات التمهيدي بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق واختيار نسخ جميع مجموعات التمهيدي.
  2. اختيار مجموعات التمهيدي الأمثل من القائمة التي تم إنشاؤها
    1. احتفظ بمجموعات التمهيدي بأعلى درجة جودة بناء على مخرجات البرنامج ، والتي توفر مجموعات أولية بترتيب تنازلي بناء على درجة الجودة. إذا أمكن ، احذف مجموعات التمهيدي بدرجة أقل من 80.
    2. بالنسبة لمجموعات التمهيدي المحتفظ بها ، حدد وانسخ amplicon الناتج عن بادئات التضخيم.
    3. قم بمحاذاة الأمبليكونات المنتجة مع الجينوم الكامل للكائن الحي المراد التنميط الجيني باستخدام NCBI Blast باستخدام بوابة التقديم عبر الإنترنت في https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. من القوائم المنسدلة أثناء الإرسال، حدد ما يلي:
      1. حدد قاعدة البيانات | قواعد البيانات الجينومية + النصوص.
      2. حدد الإنسان أو الماوس في القائمة المنسدلة ، اعتمادا على SNP الذي تم تحليله.
      3. حدد تحسين ل | تسلسلات متشابهة إلى حد ما (Blastn).
    4. (اختياري) في حالة التنميط الجيني لكائن حي آخر غير الفأر أو الإنسان ، حدد ما يلي أثناء التقديم:
      1. حدد قاعدة البيانات | قاعدة بيانات قياسية.
      2. حدد جينومات ممثل RefSeq في القائمة المنسدلة
      3. حدد تحسين ل | تسلسلات متشابهة إلى حد ما (Blastn)
    5. عندما يكون ذلك ممكنا ، احذف أي مضخمات لها تماثل مثالي مع amplicon mtDNA ، خاصة إذا كانت مناطق ربط التمهيدي متماثلة تماما (انظر المناقشة).
      ملاحظة: ستعيد أداة محاذاة BLAST أي تسلسل مع تماثل كبير إلى مضخمات التضخيم المسبق. يسمح هذا بالكشف عن NUMTs الموصوفة في المقدمة ، والتي إذا لم يتم حسابها ، يمكن أن تؤدي إلى التحيز حيث يتم تضخيمها بشكل مشترك مع الحمض النووي للميتوكوندريا.
    6. اطلب oligos التي تم الحصول عليها عبر خط الأنابيب هذا. تأكد من إضافة تعديل البيوتين 5 بوصات إلى التمهيدي الصحيح للتضخيم أثناء ترتيب التوليف ، بحيث يكون التمهيدي التسلسلي مكملا لشريط البيوتينيل.
      ملاحظة: يعد اختيار التمهيدي للتسلسل أكثر مرونة من بادئات التضخيم ، ويوصى بوجود قاعدة واحدة على الأقل تفصل بين نهاية 3 'من التمهيدي للتسلسل والموضع المتغير.

2. التضخيم المسبق PCR الأمثل

  1. تحضير عينات الحمض النووي عن طريق استخراج الحمض النووي الجينومي الكلي باستخدام طريقة مناسبة.
    ملاحظة: سيعتمد هذا إلى حد كبير على عدد الخلايا التي يتم تصنيفها وراثيا وأصلها. في حالة عزل الحمض النووي من خلايا مفردة باستخدام مخزن مؤقت للتحلل يحتوي على البروتيناز K ، يجب تغيير طبيعة العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق حتى لا تعطل البلمرة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق.
  2. إعداد PCR وإعدادات الكتلة الحرارية
    1. قم بإعداد PCR باستخدام بوليميراز عالي الدقة من اختيارك. قم بإعداد مزيج رئيسي لأربعة تفاعلات. نظرا لأن 10 ميكرولتر فقط من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مطلوبة لتشغيل التسلسل البوابي ، فقم بإعداد 25 ميكرولتر من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (للسماح بالتكرار الفني إذا لزم الأمر). استخدم 40 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل مع ما يقرب من 10 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي كمادة أولية مع 1 ميكرومتر من كل من البادئات الأمامية والخلفية.
    2. اضبط وقت التمديد وفقا لمواصفات الشركة المصنعة للبوليميراز المستخدم ، مع الأخذ في الاعتبار طول بادئات التضخيم المسبق المختارة.
    3. استخدم جهاز تدوير حراري مع إعدادات متغيرة لدرجة حرارة التلدين. نظرا لأن درجة حرارة التلدين يمكن أن تختلف اعتمادا على تسلسل التمهيدي ، ومحتوى الملح في محلول البلمرة ، وعوامل أخرى ، قم ببرمجة أربع درجات حرارة تلدين مختلفة في برنامج الدورة الحرارية.
      ملاحظة: استخدم المثال العملي في النتائج التمثيلية درجات الحرارة التالية: 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 65 درجة مئوية و 70 درجة مئوية.
    4. قسم Master Mix إلى أربعة أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر ، واضبطها على التشغيل في كل من درجات حرارة التلدين الأربعة المختارة في جهاز التدوير الحراري لمدة 40 دورة.
  3. تصور نطاق التضخيم المسبق
    1. أثناء تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد هلام أغاروز 2٪ (وزن / حجم) في 1x TBE مع SYBR Safe أو بروميد الإيثيديوم كعامل تصور.
      ملاحظة: يوصى باستخدام نسبة أعلى من الجل للتصور لأن الأجزاء المضخمة عادة ما تكون قصيرة ، وتتراوح عادة من 100 إلى 500 زوج من القواعد.
    2. بعد اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل في الخطوة 2.2 ، امزج 10 ميكرولتر من التفاعل مع كمية مناسبة من المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي ، وقم بتشغيله على هلام الأغاروز 2٪ عند 7 فولت / سم لمدة 45 دقيقة تقريبا.
    3. تصور شظايا الحمض النووي الناتجة على جهاز تحويل الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: يجب أن تنتج ظروف الدورة الحرارية المحددة لخطوة التضخيم المسبق شريطا نظيفا واحدا بالحجم المتوقع. يمكن أن تؤدي درجات حرارة التلدين المنخفضة أحيانا إلى تضخيم خارج الهدف ، مما قد يؤدي إلى تحيزات في تسلسل البواير اللاحق.
    4. حدد أدنى درجة حرارة تلدين تنتج شريطا نظيفا بالحجم الصحيح للتضخيمات اللاحقة.
    5. (اختياري) قم باستئصال شريط من الحجم المتوقع ، وقم بتنقيته باستخدام مجموعة استخراج هلام من اختيارك ، وقم بتحليلها بواسطة تسلسل سانجر لتأكيد التغاير التقريبي للعينة كمرجع.

3. إعداد الصك وتشغيله

ملاحظة: بمجرد تحسين خطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل في القسم السابق ، تتضمن الخطوة التالية برمجة جهاز التسلسل الحراري بتسلسل النوكليوتيدات الصحيح لتحليل SNP المحدد. يتضمن ذلك إدخال 10 قواعد مباشرة في اتجاه مجرى النهر من نهاية 3 'من التمهيدي التسلسل. هذا مفصل في القسم التالي.

  1. تكوين الفحص
    1. افتح برنامج التشغيل المرفق مع جهاز التسلسل الحراري ، وحدد فحص جديد في الزاوية العلوية اليسرى من الواجهة.
    2. حدد قالب مقايسة القياس الكمي للأليل .
    3. أدخل التسلسل المراد تحليله في المربع المقابل عن طريق كتابة النيوكليوتيدات المراد دمجها مباشرة في اتجاه مجرى التسلسل التمهيدي ، والذي يجب أن يكون في أعلى SNP محل الاهتمام . بالنسبة للموضع المتغير ، أشر إلى القاعدتين المحتملتين مفصولتين بشرطة مائلة (على سبيل المثال ، A / T).
    4. اضغط على إنشاء أمر الاستغناء ، ودع البرنامج يحدد تلقائيا ترتيبا مناسبا لتوزيع النيوكليوتيدات في تفاعل التسلسل عن طريق التوليف.
    5. احفظ وقدم اسما للفحص.
  2. إعداد الكاشف وتخزينه
    1. قم بتخفيف التمهيدي للتسلسل المطلوب إلى 4 ميكرومتر في مخزن التلدين المخزن المؤقت المقدم في مجموعة كاشف التسلسل الحراري.
      ملاحظة: يمكن أولا تخفيف التمهيدي للتسلسل في الماء إلى 100 ميكرومتر كمحلول مخزون ثم تخفيفه لاحقا في مخزن التلدين إلى 4 ميكرومتر حسب الحاجة.
    2. تحضير الإنزيم والركيزة والتعامل معها
      1. عند فتح العبوة لأول مرة ، أعد إذابة الإنزيم والركيزة المجففة بالتجميد وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية عندما لا يكون قيد الاستعمال.
      2. عند الاستخدام اللاحق ، قم بإذابة قوارير الإنزيم والركيزة من -20 درجة مئوية.
        ملاحظة: يمكن حفظ جميع الكواشف الأخرى في المجموعة المرفقة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية. يمكن أيضا الاحتفاظ ببادئات التسلسل المخففة عند 4 درجات مئوية.
    3. ضع الكمية المطلوبة من كل كاشف على الجليد.
    4. احتفظ بالمكونات المتبقية المطلوبة ، وهي الخرزات المغناطيسية المطلية بالستربتافيدين ، وشرائط الامتصاص ، وأقراص pyroquencing ، عند 4 درجات مئوية.
  3. تشغيل التنفيذ
    ملاحظة: عندما يتم تصميم الفحص لأول مرة ، يجب معايرته باستخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من البلازما غير المتجانسة المعروفة ، مما يضمن أن الفحص يمكنه التمييز بدقة بين البلازما غير المتجانسة. يمكن للباحثين استخدام مخاليط من منتجات PCR من التغاير المعروف كمعايير. يمكن أيضا التحقق من العينات بطرق أخرى مذكورة في المقدمة والمناقشة ، ولا سيما NGS.
    1. تمييع الحمض النووي المراد تحليله إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر. خاصة في الجولة الأولى ، تأكد من تضمين عينات من التغاير المعروف كمرجع و / أو عينات من النوع البري.
    2. قم بإجراء تسلسل PCR ل 5 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف في تفاعلات 25 ميكرولتر باستخدام بادئات التضخيم والمعلمات المحددة في القسم 1 والقسم 2. إجراء نسخ PCR الفنية لكل عينة.
      ملاحظة: يمكن تخزين تفاعل البوليميراز المتسلسل للتضخيم على المدى القصير عند 4 درجات مئوية أو على المدى الطويل عند -20 درجة مئوية قبل الشروع في التسلسل.
    3. تشغيل إعداد الملف
      1. حدد تشغيل جديد في الزاوية العلوية اليسرى من برنامج التسلسل الحراري.
      2. يمكن للتسلسل الحراري تسلسل 48 تفاعلا مسبقا منفصلا في وقت واحد ، مع مربع فارغ يمثل بئر تسلسل واحد على قرص pyrosequencing. قم بتحميل المقايسات التي تم تكوينها في القسم 3.1 بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع وتحديد تحميل الفحص. إذا لزم الأمر ، قم بتسلسل ما يصل إلى أربعة مقايسات منفصلة مع بادئات تسلسل مختلفة.
      3. اضبط وضع توزيع التمهيدي على تلقائي لتعيين غرفة حقن تلقائيا لكل برايمر تسلسل يستخدم للتشغيل.
      4. اضبط وضع التشغيل على قياسي ما لم يتم تشغيل أربعة أنواع مختلفة من المقايسات على قرص تسلسل واحد.
      5. تأكد من أن عدد المقايسات في ملف قالب التشغيل يطابق عدد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يتم تضخيمها.
        ملاحظة: في حالة تشغيل أكثر من 48 عينة، ستحتاج إلى إعداد ملفات تشغيل إضافية.
      6. احفظ ملفات التشغيل على محرك أقراص USB.
    4. فتيلة البيروسيفر
      1. اضغط على زر التنظيف على شاشة اللمس الرئيسية للجهاز ، وقم بتنظيف جميع الحاقنات بماء عالي النقاء باتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة. عند إدخال شريط الامتصاص في الجهاز ، تأكد من أن الأطراف تلتقي في وضع "الساعة 9" (يسار المركز مباشرة).
      2. قم بتوصيل عصا USB بعمليات التشغيل التي تم إعدادها في الخطوة 3.3.3 ، وقم بتحميل ملفات التشغيل المحددة في الخطوة 3.3.3.
        ملاحظة: يجب حفظ ملفات التشغيل خارج أي دليل أو مجلد على USB وإلا فلن يتمكن الجهاز من قراءتها.
      3. اتبع التعليمات الموجودة على الجهاز لتحميل الكواشف وتجهيزها كما هو مطلوب في الحاقنات المقابلة على الجهاز.
    5. إعداد عينة القرص وإطلاق الفحص
      1. اسمح للخرزات المغناطيسية المطلية بالستربتافيدين بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: ستمكن هذه الخرزات الجهاز من التقاط حبلا البيوتينيل من خطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل للتضخيم المسبق. يجب شراؤها بشكل منفصل عن المجموعة.
      2. قم بتحميل 3 ميكرولتر من الخرز في الآبار المحددة في ملف التشغيل من الخطوة 3.3.3.
      3. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR ليتم تسلسله في العينة المقابلة ، والماصة لأعلى ولأسفل لخلط العينة مع الخرزات المغناطيسية. تجنب الفقاعات إن أمكن.
      4. ابحث عن الإشارة الموجودة في جهاز التسلسل الحراري المعد إلى أنه يمكن تحميل القرص في الجهاز. قم بفك صامولة تثبيت اللوحة قبل محاذاة لوحة العينة المحملة مع الدبوس المعدني في حجرة القرص.
      5. بمجرد تثبيت اللوحة بإحكام في حجرة اللوحة ، قم بتشغيل تشغيل التسلسل بالضغط على زر البدء في واجهة الشاشة التي تعمل باللمس.

4. اكتساب النتيجة

  1. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة محرك أقراص USB من الجهاز ، وقم بتوصيله مرة أخرى بالكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل برنامج pyrosequencer. أثناء متابعة الخطوات التالية ، تابع تنظيف جهاز التسلسل الحراري باتباع المطالبات إذا كان هذا هو التشغيل الأخير لليوم.
  2. انتظر حتى يظهر ملف التشغيل الذي تم إنشاؤه حديثا على محرك أقراص USB ، وانقر نقرا مزدوجا فوق ملف نتيجة التشغيل. يحلل هذا تلقائيا ناتج لوسيفيراز لكل بئر عند دمج النوكليوتيدات ويحدد أليل الميتوكوندريا ذي الأهمية المحدد أثناء تكوين الفحص في القسم 3.1.
  3. ابحث عن درجات الألوان التالية التي يعرضها البرنامج بناء على جودة القراءات. يشير اللون الأزرق إلى التشغيل الأمثل ، والأصفر إلى التشغيل مع تحذير ، والأحمر إلى التشغيل الفاشل. لحفظ النتائج، اختر التقارير في النافذة العلوية | تقرير كامل لإنشاء ملف .pdf يحتوي على البيروجرامات والنتائج من كل بئر من التشغيل. بدلا من ذلك، يمكنك تنزيل النتائج بتنسيقات أخرى ضمن علامة التبويب التقارير .

النتائج

يقدم هذا القسم مثالا على تحسين مقايسة pyrosequencing لطفرة mtDNA المسببة للأمراض البشرية ، بالإضافة إلى بيانات التسلسل من التنميط الجيني للخلايا الليفية الجنينية للفأر غير المتجانسة (m.5024C >T) (MEFs) المعالجة بنوكلياز إصبع الزنك الميتوكوندريا (mtZFNs). يوضح تحسين الفحص للخلايا البشرية ومقارنة مقايستين مخ...

Discussion

ويتمثل أحد الجوانب الحاسمة لنجاح البروتوكول في تجنب التلوث، لا سيما عند استخدام كميات منخفضة من المواد الأولية. يوصى باستخدام غطاء للأشعة فوق البنفسجية وأطراف ماصة مفلترة عند تحضير العينات حيثما أمكن ذلك ، وكذلك للحفاظ على مناطق التضخيم المسبق وما بعد التضخيم منفصلة. يجب دائما تضمين الق?...

Disclosures

M.M. هو مؤسس مشارك ومساهم وعضو في المجلس الاستشاري العلمي لشركة Pretzel Therapeutics، Inc. P.S.-P. و P.A.N. تقديم خدمات استشارية لشركة Pretzel Therapeutics، Inc.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن تقديرنا لسيلفيا مارشيه وكونستانزا لامبرتي (معهد علم الأعصاب "كارلو بيستا" ، مؤسسة IRCCS ، ميلانو) لإعداد وتوفير خلايا cybrid m.3243A>G المستخدمة كأمثلة توضيحية لهذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لأعضاء مجموعة علم الوراثة الميتوكوندريا (MRC-MBU ، جامعة كامبريدج) للمناقشة المفيدة خلال هذا البحث. تم دعم هذا العمل بتمويل أساسي من مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MC_UU_00015/4 و MC_UU_00028/3). P.A.N. و P.S.-P. بالإضافة إلى ذلك ، يتم دعمها من قبل مؤسسة Lily ومؤسسة Champ ، على التوالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD Hot Start DNA PolymeraseSigma-Aldrich71086
PyroMark Assay Design 2.0QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips QIAGEN974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)QIAGEN974022
Pyromark Q48 Autoprep QIAGEN9002470
PyroMark Q48 Cartridge SetQIAGEN9024321
Pyromark Q48 DisksQIAGEN974901
Pyromark Q48 Magnetic beads QIAGEN974203
PyroMark Q48 Software License (1)QIAGEN9024325

References

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
  3. Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
  4. Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
  5. Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
  6. Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
  7. Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
  8. Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
  9. Cho, S. -. I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
  10. Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
  11. Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
  12. Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
  13. Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
  14. Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
  15. Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
  16. Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
  17. Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
  18. El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
  19. Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
  20. Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
  21. Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
  22. Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
  23. Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
  24. Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
  25. Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
  26. Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved