通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型

摘要

焦磷酸测序测定能够对异质细胞或组织中的线粒体 DNA 单核苷酸多态性进行稳健、快速的基因分型。

摘要

线粒体基因组（mtDNA）的突变与母系遗传疾病有关。然而，近年来，由于最近开发的通过mtDNA诱变产生模型的能力以及对线粒体遗传畸变与常见的年龄相关疾病（如癌症，糖尿病和痴呆）之间关联的新认识，对mtDNA多态性的兴趣有所增加。焦磷酸测序是一种合成测序技术，广泛用于线粒体领域的常规基因分型实验。与大规模并行测序方法相比，其相对经济实惠且易于实施，使其成为线粒体遗传学领域的宝贵技术，能够以更高的灵活性快速定量异质性。尽管这种方法很实用，但它作为mtDNA基因分型手段的实施需要遵守某些准则，特别是为了避免生物学或技术来源的某些偏差。该协议概述了设计和实施用于异质测量的焦磷酸测序测定的必要步骤和预防措施。

引言

线粒体基因组以小（16.5 kb）环状分子（mtDNA）的形式存在，存在于线粒体最内侧的隔室中，称为基质，编码线粒体呼吸链的13个亚基，以及线粒体核^糖体1原位翻译所需的tRNA和rRNA。该基因组约占线粒体功能所需的所有蛋白质的1%，其余部分由核DNA（nDNA）编码。人们通常认为线粒体来源于α-变形杆菌祖先和祖先真核细胞之间的内共生融合事件。一旦这种假设的共生发生，线粒体的遗传信息就会在亿万年内逐渐转移到细胞核上，这解释了与现代^蓝藻2的基因组相比，mtDNA的致密性。这种基因转移最有力地证明存在长段nDNA，这些nDNA与mtDNA中发现的序列高度同源。这些核线粒体序列（NUMTs）是基因分型过程中误解的常见来源，在对mtDNA³进行基因分型时，必须采取某些预防措施以避免核偏差（图1A）。

mtDNA的另一个显着特征是其拷贝数因细胞类型而异，^{每个细胞4}的拷贝数从数十到数千个不等。由于这种多拷贝性质，mtDNA可以在单个细胞内携带广泛的基因型，与考虑染色体的合合性时与核基因相关的离散等位基因相比，这可以导致等位基因的更连续分布。线粒体等位基因的这种异质性被称为线粒体异质性，其通常以给定突变的患病率百分比表示为给定细胞中总mtDNA的比例。异质性可以与同质性形成对比，同质性是指存在于细胞中的独特mtDNA物种。

在量化携带致病变异的mtDNA分子的比例时，测量线粒体异质性特别重要。这些变体以单核苷酸多态性（SNP）、小插入缺失或大规模缺失的形式出现⁵。大多数人对致病变异是异质的;然而，它们不表现出任何临床表型，通常只表现在致病性mtDNA的较高异质水平上，这种现象称为阈值效应⁶。虽然与致病性相关的值高度依赖于致病突变的性质及其发生的组织，但它们通常高于 60% 异质性⁷。

有几个研究领域线粒体基因分型很常见。在医学领域，检测或量化mtDNA突变可以作为线粒体疾病的诊断标准，其中许多疾病以mtDNA畸变为^起源5。除了对人类致病突变的研究外，鉴于最近出现了线粒体靶向DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBEs）8和用于腺嘌呤碱基编辑的基于TAL的脱氨酶（TALEDs^）实现的线粒体碱^基编辑，mtDNA中携带致病性SNP的动物模型的患病率可能会增加9.这种方法将有助于理解异常线粒体基因型与由此产生的功能障碍之间的相互作用。还正在进行一项科学研究，通过一种称为异质转移的方法重塑线粒体基因组，最终用作人类线粒体疾病的治疗策略。该研究领域主要涉及将突变特异性核酸酶引导至线粒体基质;这导致致病性mtDNA的优先降解，导致表型^10，11，^12，13的拯救。任何涉及线粒体基因型重塑的实验都需要一种稳健的定量方法来评估异质位移。

用于对mtDNA进行基因分型的方法多种多样，这些方法根据突变的性质而有所不同。下一代测序（NGS）方法在量化mtDNA中的SNP时更加精确;然而，这些方法对于线粒体异质性的常规定量仍然非常昂贵，尤其是在样品数量较少的情况下。桑格测序还可以检测SNP;然而，这种方法不是定量的，并且通常无法检测到低水平的异质性，或者在估计高异质性时可能不准确。焦磷酸测序作为一种涉及最少制备并能够快速定量任何mtDNA样品异质性的测定方法，被认为是这两个极端之间的适当折衷方案。该方法已被许多研究人员常规用于量化线粒体SNPs，包括法医分析14，^15，临床诊断16或来自单细胞的mtDNA的基因分型¹⁷。

该测定涉及mtDNA中SNP侧翼区域的第一个PCR预扩增步骤，然后使用先前生成的扩增子的一链进行逐个合成测定。预扩增步骤中使用的两种引物之一必须在5'端进行生物素化，这将使焦磷酸测序装置能够分离单链DNA以用作测序反应的模板。然后将第三个测序引物退火到保留的生物素化链上，这允许新生的DNA合成，因为脱氧核苷酸以预定义的顺序分配到反应室中。热测序仪根据发光读数记录每个碱基的掺入量，允许在DNA合成时相对定量突变型和野生型线粒体等位基因（图1B）。发光是由荧光素酶产生的，该酶在ATP存在下发光，ATP硫酸化酶在每个掺入事件中从每个核苷酸释放的焦磷酸盐中 从头 合成。这两种反应可以概括如下:

1. PP_i （来自核苷酸掺入）+ APS → ATP + 硫酸盐（ATP 硫酸化酶）

2. ATP + 荧光素 + O 2 → AMP + PP_i + 氧化荧光素 + CO₂ + 光（荧光素酶）

在第二次反应中，通过热测序仪检测腺嘌呤碱基而不与荧光素酶发生ATP交叉反应是一项挑战。然而，这可以通过使用腺嘌呤类似物进行DNA合成来解决，即dATPαS。尽管不是荧光素酶的完美底物，但与其他三种核苷酸相比，它产生更强的发光，由焦距仪进行数字调整并设置为0.9因子。由于这种固有的可变性，建议避免在SNP位置对腺嘌呤进行测序（有关更多详细信息，请参阅讨论）。

以下协议详细介绍了通过焦磷酸测序评估mtDNA异质性的方法，并概述了设计扩增引物时的必要预防措施，以避免在mtDNA中对SNP进行基因分型时出现生物学或技术偏差。后者涉及数字调查和选择引物组，优化预扩增PCR，最后，测序和改进测定。展示了两种应用的示例测定:首先，优化最常见的人类致病变异m.3243A>G 18，其次，使用剑桥Minczuk实验室开发的技术对经历异质转移的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞进行基因分型¹⁰，¹¹，12，¹⁹，20，^21，22。

研究方案

为使用本研究中使用的人类3243A>Gcybrid细胞和永生化的m.5024C>T MEFs提供了知情同意。在这种情况下，不需要伦理批准，因为剑桥大学没有收集患者细胞。然而，使用人成纤维细胞可能需要伦理批准。强烈建议在制备焦磷酸测序样品DNA时遵循PCR设置的最佳实践。如果不观察到PCR前和PCR后区域之间的严格分离，使用相同的引物进行频繁扩增会导致扩增子污染，并给随后的基因分型带来偏差。此处介绍的管道使用来自唯一制造商的特定设备;详细信息可以在 材料表中找到。如果需要，可以手动进行PCR的引物设计;但是，建议为此目的使用现有软件（请参阅 材料表）。

1. 焦磷酸测序引物设计与检测选择

1. 使用软件获取候选引物
   1. 获取被基因分型物种的mtDNA序列文件，并确定SNP的位置。确保所使用的参考序列对所研究的突变采用适当的碱基编号，以便可以轻松识别SNP的位置。
   2. 复制SNP位点上游和下游的1，000个碱基对，并将截短的序列粘贴到用于焦磷酸测序引物设计的软件中（参见 材料表）。
   3. 通过突出显示多态性碱基并右键单击然后选择设置 目标区域，将分析的SNP碱基设置为软件中焦磷酸测序测定的靶标。
   4. 按界面右上角的 播放 图标启动引物选择。
   5. 等待软件现在自动生成引物三重奏:两个引物用于模板DNA的预扩增，第三个引物用于在焦磷酸测序机中通过合成进行测序。通过右键单击并选择复制所有引物组来保留 所有引物组。
2. 从生成的列表中选择最佳引物组
   1. 根据软件输出保留质量得分最高的引物集，软件输出根据质量分数按降序提供引物组。如果可能，省略分数低于 80 的引物组。
   2. 对于保留的引物组，鉴定并复制扩增引物 产生的扩增子 。
   3. 通过使用 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 的在线提交门户，使用NCBI Blast将产生的扩增子与要进行基因分型的生物体的整个基因组进行比对。从提交期间的下拉菜单中，选择以下内容:
      1. 选择 数据库 |基因组+转录本数据库。
      2. 在下拉菜单中选择 人类 或 鼠标 ，具体取决于分析的 SNP。
      3. 选择 "优化 |有点相似的序列（爆破）。
   4. （可选）如果对小鼠或人类以外的生物进行基因分型，请在提交过程中选择以下内容:
      1. 选择 数据库 |标准数据库。
      2. 在下拉菜单中选择 RefSeq 代表性基因组
      3. 选择 "优化 |有点相似的序列（爆破）
   5. 如果可能，省略任何与mtDNA扩增子具有完全同源性的扩增子，特别是如果引物结合区域是完全同源的（参见讨论）。
      注意:BLAST比对工具将返回与预扩增扩增子具有相当同源性的任何序列。这允许检测引言中描述的NUMT，如果不考虑，它们可能会在与线粒体DNA共扩增时引起偏差。
   6. 订购通过此管道 获得 的寡核苷酸。确保在合成顺序期间将5'生物素修饰添加到正确的扩增引物中，以便测序引物与生物素化链互补。
      注意:测序引物的选择比扩增引物更灵活，建议至少有一个碱基将测序引物的3'端和可变位置分开。

2. 预扩增PCR优化

1. 通过使用适当的方法提取总基因组DNA来制备DNA样品。
   注意:这在很大程度上取决于被基因分型的细胞数量及其来源。如果使用含有蛋白酶K的裂解缓冲液从单细胞中分离DNA，则必须将样品在95°C下变性10分钟，以免在随后的PCR过程中破坏聚合酶。
2. PCR 设置和热模块设置
   1. 使用所选的高保真聚合酶设置 PCR。准备用于四种反应的预混液。由于焦磷酸测序运行仅需 10 μL PCR 反应，因此请制备 25 μL PCR 反应（以便在必要时进行技术重复）。使用 40 个循环的 PCR，以大约 10 ng 的基因组 DNA 为起始材料，正向和反向引物均为 1 μM。
   2. 根据制造商对所用聚合酶的规格设置延长时间，同时考虑所选预扩增引物的长度。
   3. 使用具有可变退火温度设置的热循环仪。由于退火温度可能因引物序列、聚合酶缓冲液的盐含量和其他因素而异，因此将四种不同的退火温度编程到热循环程序中。
      注意:代表性结果中的工作示例使用以下温度:55°C，60°C，65°C和70°C。
   4. 将预混液拆分到四个 200 μL PCR 管中，并将它们设置为在热循环仪中的四个选定退火温度中的每一个运行 40 个循环。
3. 前置扩增波段可视化
   1. 在PCR运行过程中，在1x TBE中制备2%（w / v）琼脂糖凝胶，使用SYBR Safe或溴化乙锭作为可视化剂。
      注意:建议使用更高百分比的凝胶进行可视化，因为扩增的片段通常很短，通常范围为100至500个碱基对。
   2. 步骤2.2中的PCR完成后，将10μL反应物与适量的DNA上样缓冲液混合，并在2%琼脂糖凝胶上以7V / cm运行约45分钟。
   3. 在紫外透射仪上可视化所得的DNA片段。
      注意:为预扩增步骤选择的热循环条件应产生预期尺寸的单个干净条带。较低的退火温度偶尔会导致脱靶扩增，从而给随后的焦磷酸测序带来偏差。
   4. 选择最低退火温度，为后续扩增产生正确尺寸的干净条带。
   5. （可选）切除预期大小的条带，使用所选的凝胶提取试剂盒纯化，并通过Sanger测序进行分析以确认样品作为参考的近似异质性。

3. 仪器设置和运行

注意:优化上一节中的PCR步骤后，下一步涉及使用正确的核苷酸序列对焦距测序仪进行编程，以分析特定的SNP。这涉及在测序引物的3'末端下游直接进入10个碱基。下一节对此进行了详细介绍。

1. 检测配置
   1. 打开热测序仪随附的运行软件，在界面左上角选择 新检测 。
   2. 选择 等位基因定量 分析模板。
   3. 通过键入要直接掺入测序引物下游的核苷酸，将 要分析的序列 输入到相应的框中，该核苷酸应位于感兴趣的SNP的上游。对于可变位置，表示用斜杠分隔的两个可能的底（例如，A/T）。
   4. 按 生成分配顺序，让软件自动确定合成反应中要分配的核苷酸的合适顺序。
   5. 保存并提供测定的名称。
2. 试剂制备和储存
   1. 将订购的测序引物稀释至4μM，放入热解测序仪试剂盒中提供的退火缓冲液中。
      注意:测序引物可以首先在水中稀释至100μM作为储备溶液，然后根据需要在退火缓冲液中进一步稀释至4μM。
   2. 酶和底物的制备和处理
      1. 首次拆箱时，按照制造商的建议重新溶解冻干酶和底物。不使用时储存在-20°C。
      2. 随后使用时，从-20°C解冻酶和底物小瓶。
         注意:提供的试剂盒中的所有其他试剂都可以在4°C下冷藏。 稀释的测序引物也可以保持在4°C。
   3. 将所需量的每种试剂放在冰上。
   4. 将所需的其余组分（即链霉亲和素包被的磁珠、吸收条和焦磷酸测序盘）保持在 4 °C。
3. 运行执行
   注意:首次设计检测时，必须使用已知异质性的PCR产物进行校准，以确保检测能够准确区分异质。研究人员可以使用已知异质的PCR产物混合物作为标准品。样品也可以通过介绍和讨论中提到的其他方法进行验证，特别是NGS。
   1. 将要分析的DNA稀释至5 ng/μL。 特别是在第一次运行中，确保包括已知异质性的样品作为参考和/或野生型样品。
   2. 使用第 1 节和第 2 节中确定的扩增引物和参数，在 25 μL 反应中对 5 μL 稀释的 DNA 进行测序前 PCR。对每个样品进行技术PCR重复。
      注意:在进行测序之前，预扩增PCR可以在4°C下短期储存或在-20°C下长期储存。
   3. 运行文件设置
      1. 选择热音序列器软件左上角的 "新建运行 "。
      2. 焦磷酸测序仪可以同时对48个单独的预扩增反应进行测序，空方块代表焦磷酸测序盘上的单个测序孔。通过右键单击正方形并选择 上样检测来加载第 3.1 节中配置的检测。如果需要，使用不同的测序引物对多达四种单独的测定进行测序。
      3. 将引物分配模式设置为自动，以 自动 为用于运行的每个测序引物分配一个进样室。
      4. 将" 运行模式 "设置为 "标准 "，除非在一个测序磁盘上运行四种不同类型的检测。
      5. 确保运行模板文件中的检测数量与扩增的PCR反应数量相匹配。
         注意:如果运行超过 48 个示例，则需要设置其他运行文件。
      6. 将运行文件保存到 USB 驱动器。
   4. 启动热音序列器
      1. 按下设备主触摸屏上的 清洁 按钮，然后按照屏幕上的说明用高纯水清洁所有注射器。将吸收条插入机器时，请确保两端在"9点钟"位置（中心正左）相遇。
      2. 使用步骤 3.3.3 中设置的运行插入 U 盘，然后加载步骤 3.3.3 中定义的运行文件。
         注意:运行文件必须保存在USB上的任何目录或文件夹之外，否则机器无法读取它们。
      3. 按照设备上的说明，根据需要将试剂加载并灌注到机器上的相应进样器中。
   5. 样品盘制备和检测启动
      1. 让链霉亲和素包被的磁珠平衡至室温。
         注意:这些磁珠将使设备能够从预扩增PCR步骤中捕获生物素化链。它们需要与套件分开购买。
      2. 将 3 μL 磁珠加载到步骤 3.3.3 的运行文件中定义的孔中。
      3. 将要测序的每个PCR反应加载10 μL到相应的样品中，并上下移液以使样品与磁珠混合。尽可能避免气泡。
      4. 在启动的热解序列器中寻找可以将磁盘加载到机器中的指示。拧下板固定螺母，然后将装载的样品板与磁盘室中的金属销对齐。
      5. 将板牢固拧入板隔间后，按触摸屏界面上的 开始 按钮启动排序运行。

4. 结果获取

1. 运行完成后，从机器上取下 USB 驱动器，然后将其重新插入运行热音序列器软件的计算机。在继续执行以下步骤时，如果这是当天的最后一次运行，请按照提示继续清洁热音序列器。
2. 等待新生成的运行文件出现在 USB 驱动器上，然后双击运行结果文件。这会自动分析核苷酸掺入后每个孔的荧光素酶输出，并量化在第 3.1 节的测定配置期间定义的感兴趣的线粒体等位基因。
3. 根据读取质量查找软件显示的以下颜色分数。蓝色表示最佳运行，黄色表示运行并发出警告，红色表示运行失败。要保存结果，请在顶部窗口中选择 "报告 " |"生成 包含热解图和运行中每个井结果的.pdf文件的完整报告。或者，在 "报告 "选项卡下以其他格式下载结果。

结果

本节介绍了人类致病性mtDNA突变的焦磷酸测序测定的示例优化，以及用线粒体锌指核酸酶（mtZFN）处理的异质（m.5024C>T）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的基因分型数据的测序数据。优化人类细胞的测定并比较两种不同的测定方法演示了如何选择最准确的分析方法，而第二个示例中的基因分型转基因MEF细胞可作为检测基因治疗干预后异质位移的应用示例。

人类m.3243A>G突变

讨论

该方案成功的一个关键方面是避免污染，特别是在使用少量起始材料时。建议在制备样品时尽可能使用UV罩和过滤移液器吸头，并保持前扩增和后扩增区域分开。应始终包括空白测量和已知异质性（例如野生型DNA）的样品，以用作检查技术或生物学偏差的基准。

该测定固有的一个值得注意的技术偏差是腺嘌呤类似物掺入产生的发光信号增加。当腺嘌呤在可变位置使用时，它?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325