גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing

Summary

מבחני Pyrosequencing מאפשרים גנוטיפ חזק ומהיר של DNA מיטוכונדריאלי, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתאים או רקמות הטרופלזמיים.

Abstract

מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי (mtDNA) נקשרו למחלות גנטיות תורשתיות אימהיות. עם זאת, העניין בפולימורפיזמים של mtDNA גדל בשנים האחרונות בשל היכולת שפותחה לאחרונה לייצר מודלים על ידי מוטגנזה mtDNA והערכה חדשה של הקשר בין סטיות גנטיות מיטוכונדריאליות ומחלות נפוצות הקשורות לגיל כגון סרטן, סוכרת ודמנציה. Pyrosequencing היא טכניקת ריצוף על ידי סינתזה הנמצאת בשימוש נרחב ברחבי שדה המיטוכונדריה עבור ניסויים גנוטיפיים שגרתיים. מחירה היחסי בהשוואה לשיטות ריצוף מקבילי מאסיביות וקלות היישום הופכים אותה לטכניקה רבת ערך בתחום הגנטיקה של המיטוכונדריה, ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עם גמישות מוגברת. למרות המעשיות של שיטה זו, יישומה כאמצעי לגנוטיפ mtDNA דורש תצפית על הנחיות מסוימות, במיוחד כדי למנוע הטיות מסוימות ממוצא ביולוגי או טכני. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים ואמצעי הזהירות הדרושים בתכנון ויישום מבחני pyrosequencing לשימוש בהקשר של מדידת הטרופלזמה.

Introduction

הגנום המיטוכונדריאלי קיים בצורה של מולקולות מעגליות קטנות (16.5 קילובייט) (mtDNA) הנמצאות בתא הפנימי ביותר של המיטוכונדריה הנקראות מטריצה ומקודדות 13 תת-יחידות של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית, כמו גם את ה-tRNA וה-rRNA הדרושים לתרגומם באתרם על ידי הריבוזום המיטוכונדריאלי¹. גנום זה מייצג כ-1% מכלל החלבונים הדרושים לתפקוד המיטוכונדריה, והשאר מקודדים על ידי הדנ"א הגרעיני (nDNA). מקובל להניח כי מיטוכונדריה נגזרים מאירוע איחוי אנדוסימביוטי בין אב קדמון אלפא-פרוטאובקטריאלי לבין תא איקריוטי קדמון. ברגע שסימביוזה היפותטית זו התרחשה, המידע הגנטי של המיטוכונדריה הועבר בהדרגה לגרעין במשך עידנים, מה שמסביר את הקומפקטיות הנ"ל של mtDNA בהשוואה לגנום של ציאנובקטריה מודרנית². העברה כזו של גנים מתבטאת בצורה החזקה ביותר בקיומם של חלקים ארוכים של nDNA שהם הומולוגיים מאוד לרצפים הנמצאים ב- mtDNA. הרצפים המיטוכונדריאליים הגרעיניים האלה (NUMTs) הם מקור נפוץ לפרשנות שגויה במהלך גנוטיפ, ויש לנקוט אמצעי זהירות מסוימים כדי להימנע מהטיות גרעיניות בעת גנוטיפ mtDNA³ (איור 1A).

תכונה ייחודית נוספת של mtDNA היא שמספר העותקים שלו משתנה בהתאם לסוג התא, ומספור בין עשרות לאלפי עותקים לכל תא⁴. בשל אופי מרובה עותקים זה, mtDNA יכול להכיל מגוון רחב של גנוטיפים בתוך תא יחיד, מה שיכול לגרום לפיזור רציף יותר של אללים בניגוד לאללים בדידים הקשורים לגנים גרעיניים כאשר לוקחים בחשבון את הזיגוסיות של כרומוזומים. הטרוגניות זו של אללים מיטוכונדריאליים מכונה הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, המתבטאת בדרך כלל באחוז השכיחות של מוטציה נתונה כשיעור מסך mtDNA בתא נתון. הטרופלזמה יכולה להיות מנוגדת להומופלזמה, המתייחסת למין ייחודי של mtDNA שנמצא על פני תא.

מדידת הטרופלזמה של המיטוכונדריה מעניינת במיוחד כאשר מכמתים את חלקן של מולקולות mtDNA המכילות וריאנטים פתוגניים. גרסאות כאלה מגיעות בצורה של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs), אינדל קטן, או מחיקות בקנה מידה גדול⁵. רוב בני האדם הם הטרופלזמיים עבור וריאנטים פתוגניים; עם זאת, הם אינם מציגים פנוטיפים קליניים, אשר לעתים קרובות מתבטאים רק ברמות הטרופלזמה גבוהות יותר של mtDNA פתוגני בתופעה המכונה אפקט סף⁶. בעוד הערכים הקשורים פתוגניות תלויים מאוד באופי של מוטציה פתוגנית ואת הרקמה שבה היא מתרחשת, הם בדרך כלל נמצאים מעל 60% הטרופלזמה⁷.

ישנם מספר תחומי מחקר בהם גנוטיפ מיטוכונדריאלי נפוץ. בתחום הרפואי, בדיקה או כימות של מוטציות mtDNA יכולות לשמש כקריטריון אבחוני למחלות מיטוכונדריאליות, שרבות מהן כוללות סטיות mtDNA כמקור^{שלהן 5}. בנוסף לחקר מוטציות פתוגניות בבני אדם, השכיחות של מודלים של בעלי חיים המכילים SNPs פתוגניים ב- mtDNA צפויה לעלות, בהתחשב בהופעה האחרונה של עריכת בסיס מיטוכונדריאלי המתאפשרת על ידי עורכי בסיס ציטוזין ממוקדים במיטוכונדריה (DdCBEs)⁸ ו- DEAMINASES מבוססי TALE(TALEDs) לעריכת בסיס אדנין⁹. גישה זו תסייע בהבנת יחסי הגומלין בין גנוטיפים מיטוכונדריאליים חריגים לבין התפקוד הלקוי הנובע מכך. יש גם מחקר מדעי מתמשך על עיצוב מחדש של הגנום המיטוכונדריאלי לשימוש אולטימטיבי כאסטרטגיה טיפולית במחלות מיטוכונדריאליות אנושיות באמצעות גישה המכונה שינוי הטרופלזמה. תחום מחקר זה כולל בעיקר הכוונת נוקלאזות ספציפיות למוטציות למטריצה המיטוכונדריאלית; התוצאה היא השפלה מועדפת של mtDNA פתוגני, מה שמוביל להצלות בפנוטיפ ^10,11,12,13. כל ניסוי הכרוך בעיצוב מחדש של הגנוטיפ המיטוכונדריאלי דורש שיטה כמותית חזקה כדי להעריך שינויים הטרופלזמה.

מגוון רחב של שיטות משמשות לגנוטיפ mtDNA, ואלה משתנות בהתאם לאופי המוטציה. שיטות ריצוף הדור הבא (NGS) מדויקות יותר כשמדובר בכימות SNPs ב- mtDNA; עם זאת, שיטות אלה נשארות יקרות מאוד לכימות שגרתי של הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, במיוחד אם מספר הדגימות קטן. ריצוף Sanger יכול גם לאפשר זיהוי של SNPs; עם זאת, גישה זו אינה כמותית ולעתים קרובות אינה מצליחה לזהות רמות נמוכות של הטרופלזמה או יכולה להיות לא מדויקת בעת הערכת הטרופלסמיה גבוהה. Pyrosequencing, כבדיקה הכרוכה בהכנה מינימלית ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עבור כל דגימת mtDNA, מוצעת כפשרה הולמת בין שני הקצוות הללו. שיטה זו שימשה באופן שגרתי לכימות SNPs מיטוכונדריאלי על ידי חוקרים רבים בהקשרים שונים, כולל ניתוח פורנזי 14,15, אבחנה קלינית^16, או גנוטיפ של mtDNA מתאים בודדים¹⁷.

בדיקה זו כוללת שלב טרום הגברה ראשון של PCR של אזור הצמוד ל- SNP ב- mtDNA, ואחריו בדיקת רצף על ידי סינתזה באמצעות גדיל אחד של האמפליקון שנוצר בעבר. אחד משני הפריימרים המשמשים בשלב טרום ההגברה חייב להיות ביוטינילציה בקצה 5', מה שיאפשר למנגנון הפירוזקוונס לבודד את גדיל הדנ"א היחיד שישמש כתבנית לתגובת הריצוף. לאחר מכן משליכים פריימר ריצוף שלישי על גדיל הביוטינילציה השמור, מה שמאפשר סינתזת דנ"א מתהווה כדאוקסינוקלאוטידים להיות מופצים בסדר מוגדר מראש לתוך תא התגובה. הפירורצ'ר רושם את הכמות של כל בסיס משולב בהתבסס על קריאה זוהרת, מה שמאפשר כימות יחסי של אללים מיטוכונדריאליים מוטנטיים ופראיים על סינתזת דנ"א (איור 1B). הלומינסנציה נוצרת על ידי אנזים לוציפראז, אשר פולט אור בנוכחות ATP כי ATP sulfurylase מסנתז דה נובו בכל אירוע התאגדות מן pyrophosphates שוחרר על ידי כל נוקלאוטיד. ניתן לסכם את שתי התגובות הללו כך:

1. PP_i (משילוב נוקלאוטידים) + APS → ATP + סולפט (ATP סולפורילאז)

2. ATP + luciferin + O 2 → AMP + PP_i + oxyluciferin + CO₂ + אור (luciferase)

איתור בסיסי אדנין על ידי הפירורצ'ר ללא ATP צולב עם לוציפראז בתגובה השנייה הוא אתגר. עם זאת, זה נפתר באמצעות אנלוגי אדנין עבור סינתזת DNA, כלומר dATPαS. למרות שאינו מצע מושלם עבור לוציפראז, הוא מייצר בהירות חזקה יותר בהשוואה לשלושת הנוקלאוטידים האחרים, אשר מכוונן דיגיטלית על ידי הפירורצ'ר ומוגדר לפקטור של 0.9. בשל שונות אינהרנטית זו, מוצע להימנע מריצוף אדנין בעמדת SNP (ראה דיון לפרטים נוספים).

הפרוטוקול הבא מפרט את השיטה של הערכת הטרופלזמה mtDNA על ידי pyrosequencing ומתאר את אמצעי הזהירות הדרושים בתכנון פריימרים הגברה כדי למנוע הטיה ביולוגית או טכנית בעת גנוטיפ SNPs ב mtDNA. האחרון כולל סקירה דיגיטלית ובחירת ערכות פריימר, אופטימיזציה של PCR טרום הגברה, ולבסוף, ריצוף וליטוש הבדיקה. שתי דוגמאות יישומיות מודגמות: ראשית, אופטימיזציה של הגרסה הפתוגנית האנושית הנפוצה ביותר m.3243A>G¹⁸, ושנית, גנוטיפ של תאי פיברובלסט עובריים של עכברים (MEF) שעברו הסטת הטרופלזמה באמצעות טכנולוגיות שפותחו במעבדת מינצ'וק בקיימברידג' 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

הסכמה מדעת ניתנה לשימוש בתאי הציבריד האנושיים 3243A>G ובתאי M.5024C>T MEFs האימורטליים ששימשו במחקר זה. אישור אתי לא נדרש במקרה זה מכיוון שתאי החולה לא נאספו באוניברסיטת קיימברידג '. עם זאת, השימוש בפיברובלסטים אנושיים עשוי לדרוש אישור אתי. מומלץ מאוד לעקוב אחר שיטות עבודה מומלצות להגדרת PCR בעת הכנת DNA הדגימה עבור pyrosequencing. הגברה תכופה באמצעות פריימרים זהים עלולה להוביל לזיהום אמפליקון ולהציג הטיה לגנוטיפ הבא אם לא נצפתה הפרדה קפדנית בין האזורים שלפני ה-PCR והפוסט-PCR. הצינור המוצג כאן משתמש בציוד ספציפי מיצרן יחיד; את הפרטים ניתן למצוא בטבלת החומרים. עיצוב הפריימר עבור PCR יכול להתבצע באופן ידני אם תרצה בכך; עם זאת, מומלץ להשתמש בתוכנות קיימות למטרה זו (ראה טבלת חומרים).

1. עיצוב פריימר Pyrosequencing ובחירת בדיקה

1. השגת מועמדים ראשוניים באמצעות תוכנה
   1. השג קובץ רצף mtDNA עבור המינים הגנוטיפיים, וזהה את המיקום של SNP. ודא שרצף הייחוס המשמש משתמש במספור הבסיס המתאים למוטציה שנחקרה, כך שניתן יהיה לזהות בקלות את מיקום ה- SNP.
   2. העתק 1,000 זוגות בסיסים במעלה ובמורד הזרם של אתר SNP, והדבק את הרצף החתוך בתוכנה המיועדת לעיצוב פריימר pyrosequencing (ראה טבלת חומרים).
   3. הגדר את בסיס SNP מנותח כיעד של בדיקת pyrosequencing בתוכנה על ידי הדגשת הבסיס הפולימורפי ולחיצה ימנית על ולאחר מכן בחירת אזור היעד המוגדר.
   4. לחץ על סמל ההפעלה בפינה השמאלית העליונה של הממשק כדי להפעיל בחירת פריימר.
   5. המתן עד שהתוכנה תייצר כעת באופן אוטומטי שלישיות פריימר: שני פריימרים להגברה מוקדמת של DNA התבנית ופריימר שלישי לריצוף על ידי סינתזה במכונת pyrosequencing. שמור על כל ערכות הפריימר על-ידי לחיצה ימנית ובחירה באפשרות העתק את כל ערכות הפריימר.
2. בחירת ערכות הפריימר האופטימליות מהרשימה שנוצרה
   1. שמור על ערכות הפריימר עם ציון האיכות הגבוה ביותר בהתבסס על פלט התוכנה, המספק ערכות פריימר בסדר יורד בהתבסס על ציון האיכות. במידת האפשר, השמיט ערכות פריימר עם ציון נמוך מ- 80.
   2. עבור ערכות הפריימר השמורות, זהה והעתיק את האמפליקון המיוצר על ידי פריימרי ההגברה.
   3. יישר את האמפליקונים המיוצרים עם כל הגנום של האורגניזם כדי לעבור גנוטיפ באמצעות NCBI Blast באמצעות פורטל ההגשה המקוון https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. מהתפריטים הנפתחים במהלך השליחה, בחר את האפשרויות הבאות:
      1. בחר מסד נתונים | מסדי נתונים גנומיים + תמלילים.
      2. בחר אנושי או עכבר בתפריט הנפתח, בהתאם ל- SNP שניתח.
      3. בחר מטב עבור | רצפים דומים במקצת (Blastn).
   4. (אופציונלי) אם מדובר בגנוטיפ של אורגניזם שאינו עכבר או אדם, בחר את הפרטים הבאים במהלך השליחה:
      1. בחר מסד נתונים | מסד נתונים רגיל.
      2. בחר RefSeq Representative genomes בתפריט הנפתח
      3. בחר מטב עבור | רצפים דומים במקצת (Blastn)
   5. במידת האפשר, השמיט את כל האמפליקונים שיש להם הומולוגיה מושלמת למגבר mtDNA, במיוחד אם אזורי הקישור הראשוניים הומולוגיים לחלוטין (ראה דיון).
      הערה: כלי היישור BLAST יחזיר כל רצף עם הומולוגיה ניכרת למגברי קדם-הגברה. זה מאפשר זיהוי של NUMTs המתוארים במבוא, אשר אם לא נלקח בחשבון, יכול לגרום להטיה כפי שהם מוגברים יחד עם ה- DNA המיטוכונדריאלי.
   6. להזמין את האוליגוס שהושגו באמצעות צינור זה. יש לוודא כי שינוי ביוטין 5' מתווסף לפריימר ההגברה הנכון במהלך סדר הסינתזה, כך שפריימר הריצוף יהיה משלים לגדיל הביוטינילציה.
      הערה: הבחירה בפריימר ריצוף גמישה יותר מפריימר ההגברה, ומומלץ שיהיה לפחות בסיס אחד המפריד בין קצה 3' של פריימר הרצף לבין המיקום המשתנה.

2. אופטימיזציה של PCR לפני הגברה

1. הכינו את דגימות הדנ"א על ידי חילוץ הדנ"א הגנומי הכולל בשיטה מתאימה.
   הערה: הדבר תלוי במידה רבה במספר התאים שעוברים גנוטיפ ובמקורם. אם מבודדים DNA מתאים בודדים באמצעות חיץ ליזה המכיל פרוטאינאז K, הדגימה חייבת להיות deproductd ב 95 ° C במשך 10 דקות כדי לא לשבש את פולימראז במהלך PCR הבאים.
2. הגדרת PCR והגדרות חסימה תרמית
   1. הגדר את ה- PCR עם פולימראז באיכות גבוהה לבחירה. הכינו מאסטר מיקס לארבע תגובות. מכיוון שרק 10 μL של תגובת PCR נדרשים לריצת pyrosequencing, הכינו 25 μL של תגובות PCR (כדי לאפשר חזרה טכנית במידת הצורך). השתמש 40 מחזורים של PCR עם כ 10 ng של DNA גנומי כחומר המוצא עם 1 מיקרומטר של פריימרים קדימה ואחורה.
   2. הגדר את זמן ההארכה בהתאם למפרט היצרן עבור הפולימראז בו נעשה שימוש, תוך התחשבות באורך פריימרים קדם-הגברה שנבחרו.
   3. השתמש במחזור תרמי עם הגדרות טמפרטורת חישול משתנות. מכיוון שטמפרטורת החישול יכולה להשתנות בהתאם לרצף הפריימר, תכולת המלח של חיץ הפולימראז, וגורמים אחרים, מתכנתים ארבע טמפרטורות חישול שונות לתוכנית המחזור התרמי.
      הערה: הדוגמה העובדת בתוצאות המייצגות השתמשה בטמפרטורות הבאות: 55 °C, 60 °C, 65 °C (70 °F) ו- 70 °C (70 °C).
   4. פצלו את Master Mix לארבעה צינורות PCR של 200 μL, והגדירו אותם לפעול בכל אחת מארבע טמפרטורות החישול שנבחרו במחזור התרמי במשך 40 מחזורים.
3. תצוגה חזותית של רצועת קדם-הגברה
   1. במהלך ריצת PCR, הכינו ג'ל אגרוז 2% (w/v) ב-1x TBE עם SYBR Safe או אתידיום ברומיד כחומר ויזואלי.
      הערה: אחוז גבוה יותר של ג'ל מומלץ להדמיה מכיוון שהשברים המוגברים הם בדרך כלל קצרים, בדרך כלל בטווח של 100 עד 500 זוגות בסיסים.
   2. לאחר השלמת ה-PCR בשלב 2.2, יש לערבב 10 μL של התגובה עם כמות מתאימה של מאגר טעינת DNA, ולהפעיל על ג'ל אגרוז 2% ב-7 וולט/ס"מ למשך כ-45 דקות.
   3. דמיינו את מקטעי הדנ"א המתקבלים על טרנסילטור UV.
      הערה: תנאי המחזור התרמי שנבחרו לשלב ההגברה אמורים לייצר רצועה נקייה אחת בגודל הצפוי. טמפרטורות חישול נמוכות יותר יכולות לעיתים לגרום להגברה מחוץ למטרה, מה שעלול לגרום להטיות לריצוף הפירוז שלאחר מכן.
   4. בחר את טמפרטורת החישול הנמוכה ביותר המפיקה פס נקי בגודל הנכון עבור הגברות הבאות.
   5. (אופציונלי) הבלו רצועה בגודל הצפוי, לטהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל לפי בחירה, ולנתח על ידי ריצוף Sanger כדי לאשר את ההטרופלזמה המשוערת של הדגימה כהפניה.

3. הגדרת מכשירים והפעלתם

הערה: לאחר ששלב ה-PCR בסעיף הקודם ממוטב, השלב הבא כולל תכנות הפירורצ'ר עם רצף הנוקלאוטידים הנכון לניתוח עבור SNP ספציפי. זה כרוך בהזנת 10 בסיסים ישירות במורד הזרם של קצה 3' של פריימר הרצף. זה מפורט בסעיף הבא.

1. תצורת Assay
   1. פתח את תוכנת ההפעלה שסופקה עם pyrosequencer, ובחר New Assay בפינה השמאלית העליונה של הממשק.
   2. בחר את תבנית בדיקת הכימות של Allele .
   3. הזן את הרצף שיש לנתח בתיבה המתאימה על ידי הקלדת הנוקלאוטידים שישולבו ישירות במורד הזרם של פריימר הרצף, אשר אמור להיות במעלה הזרם של SNP של עניין. עבור מיקום המשתנה, ציין את שני הבסיסים האפשריים המופרדים באמצעות קו נטוי (לדוגמה, A/T).
   4. לחץ על צור סדר ניפוק, ותן לתוכנה לקבוע באופן אוטומטי סדר מתאים לחלוקת הנוקלאוטידים בתגובת הרצף על ידי סינתזה.
   5. שמור וספק שם עבור הבדיקה.
2. הכנת מגיבים ואחסון
   1. יש לדלל את פריימר הריצוף שהוזמן ל-4 מיקרומטר במאגר החישול המסופק בערכת מגיב פירורצף.
      הערה: תחילה ניתן לדלל את פריימר הריצוף במים עד 100 מיקרומטר כתמיסת ציר ולאחר מכן לדלל עוד יותר בחיץ חיץ ל-4 מיקרומטר לפי הצורך.
   2. הכנת אנזימים וסובסטרטים וטיפול בהם
      1. בעת פתיחת האריזה הראשונה, יש להמיס מחדש את האנזים והמצע הליופיליים בהתאם להמלצות היצרן. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C כאשר אינו בשימוש.
      2. בשימוש לאחר מכן, הפשירו את בקבוקוני האנזים והמצע מ-20°C.
         הערה: כל שאר הריאגנטים בערכה המסופקת יכולים להישמר בקירור בטמפרטורה של 4°C. פריימרים לריצוף מדולל יכולים להישמר גם בטמפרטורה של 4°C.
   3. מניחים את הכמות הנדרשת של כל מגיב על קרח.
   4. שמור את שאר הרכיבים הדרושים, כלומר חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין, רצועות בולמים, ודיסקים pyrosequencing, ב 4 ° C.
3. הפעל ביצוע
   הערה: כאשר בדיקה מתוכננת לראשונה, יש לכייל אותה באמצעות מוצרי PCR של הטרופלזמה ידועה, מה שמבטיח שהבדיקה יכולה להבחין במדויק בין הטרופלסמים. חוקרים יכולים להשתמש בתערובות של מוצרי PCR של הטרופלזמה ידועה כסטנדרטים. ניתן לאמת דגימות גם בשיטות אחרות שהוזכרו במבוא ובדיון, בעיקר NGS.
   1. דללו את הדנ"א לניתוח ל-5 ננוגרם/מיקרוליטר. במיוחד בסיבוב הראשון, הקפידו לכלול דגימות של הטרופלזמה ידועה כדגימות ייחוס ו/או דגימות מסוג פרא.
   2. בצע ריצוף PCR של 5 μL של DNA מדולל בתגובות 25 μL באמצעות פריימרים הגברה ופרמטרים שזוהו בסעיף 1 ובסעיף 2. בצע שכפול PCR טכני עבור כל דגימה.
      הערה: ניתן לאחסן את ה-PCR לפני הגברה לטווח קצר ב-4°C או לטווח ארוך ב-20°C לפני שממשיכים לרצף.
   3. הפעל את הגדרת הקובץ
      1. בחר הפעלה חדשה בפינה השמאלית העליונה של תוכנת pyrosequencer.
      2. הפירורצנר יכול לרצף בו זמנית 48 תגובות מוגברות נפרדות, כאשר ריבוע ריק מייצג היטב רצף יחיד על דיסק pyrosequencing. טען את הבדיקות שהוגדרו בסעיף 3.1 על ידי לחיצה ימנית על ריבוע ובחירה במבחן טעינה. במידת הצורך, רצף עד ארבע בדיקות נפרדות עם פריימרים שונים לריצוף.
      3. הגדר את מצב חלוקת הפריימר לאוטומטי כדי להקצות אוטומטית תא הזרקה לכל פריימר רצף המשמש לריצה.
      4. הגדר את מצב הפעלה לרגיל , אלא אם כן אתה מפעיל ארבעה סוגים שונים של בדיקות בדיסק רצף אחד.
      5. ודא שמספר הבדיקות בקובץ תבנית ההפעלה תואם למספר תגובות ה- PCR המוגברות.
         הערה: אם אתה מפעיל יותר מ- 48 דוגמאות, יהיה צורך להגדיר קבצי הפעלה נוספים.
      6. שמור את קבצי ההפעלה בכונן USB.
   4. הקדמת הפירורצ'ר
      1. לחץ על לחצן הניקוי במסך המגע הראשי של המכשיר, ונקה את כל המזרקים במים בעלי טוהר גבוה בהתאם להוראות שעל המסך. בעת הכנסת פס הבולם למכונה, ודא שהקצוות נפגשים במצב "השעה 9" (ישירות משמאל למרכז).
      2. חבר את התקן ה- USB עם הפעלות שהוגדרו בשלב 3.3.3, וטען את קבצי ההפעלה שהוגדרו בשלב 3.3.3.
         הערה: יש לשמור את קבצי ההפעלה מחוץ לכל ספריה או תיקיה ב- USB, אחרת המחשב אינו יכול לקרוא אותם.
      3. בצע את ההוראות שעל המכשיר כדי לטעון ולהפעיל את הריאגנטים כנדרש לתוך המזרקים המתאימים במכשיר.
   5. הכנת דיסק לדוגמה והשקת בדיקה
      1. אפשרו לחרוזים המגנטיים המצופים בסטרפטווידין להתאזן לטמפרטורת החדר.
         הערה: חרוזים אלה יאפשרו למכשיר ללכוד את גדיל הביוטינילציה משלב ה-PCR שלפני ההגברה. יש לרכוש אותם בנפרד מהערכה.
      2. טען 3 μL של חרוזים לתוך הבארות שהוגדרו בקובץ ההפעלה משלב 3.3.3.
      3. טען 10 μL של כל תגובת PCR כדי להיות רצף לתוך הדגימה המתאימה, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הדגימה עם חרוזים מגנטיים. הימנעו מבועות במידת האפשר.
      4. חפש את האינדיקציה בפירורצף הראשוני שניתן לטעון את הדיסק למכונה. פתחו את הברגת הצלחת המחזיקה את האגוז לפני יישור צלחת הדגימה הטעונה עם פין המתכת בתא הדיסק.
      5. לאחר הברגת הצלחת בחוזקה לתא הצלחת, הפעל את ריצת הרצף על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בממשק מסך המגע.

4. רכישת תוצאות

1. לאחר השלמת ההפעלה, הסר את כונן ה- USB מהמכשיר וחבר אותו בחזרה למחשב שבו פועלת תוכנת הפירורצף. תוך כדי ביצוע השלבים הבאים, המשך בניקוי הפירורצ'ר בהתאם להנחיות אם זו הריצה הסופית של היום.
2. המתן עד שקובץ ההפעלה החדש שנוצר יופיע בכונן ה- USB ולחץ פעמיים על קובץ תוצאת ההפעלה. זה מנתח באופן אוטומטי את פלט הלוציפראז של כל באר עם שילוב הנוקלאוטידים ומכמת את האלל המיטוכונדריאלי של העניין שהוגדר במהלך תצורת הבדיקה בסעיף 3.1.
3. חפש את ציוני הצבעים הבאים המוצגים על-ידי התוכנה בהתבסס על איכות הקריאות. כחול מציין ריצה אופטימלית, צהוב ריצה עם אזהרה, ואדום ריצה כושלת. כדי לשמור את התוצאות, בחר דוחות בחלון העליון | דו"ח מלא ליצירת קובץ .pdf המכיל את הפירוגרמות והתוצאות מכל באר של הריצה. לחלופין, הורד את התוצאות בפורמטים אחרים תחת הכרטיסיה דוחות .

תוצאות

חלק זה מציג דוגמה לאופטימיזציה של בדיקת pyrosequencing עבור מוטציה פתוגנית mtDNA אנושית, כמו גם נתוני ריצוף מהגנוטיפ של פיברובלסטים עובריים הטרופלזמיים (m.5024C>T) של עכברים (MEFs) המטופלים בנוקלאזות אצבע אבץ מיטוכונדריאליות (mtZFN). אופטימיזציה של הבדיקה עבור תאים אנושיים והשוואת שתי בדיקות שונות מדגימה כ...

Discussion

היבט קריטי להצלחת הפרוטוקול הוא הימנעות מזיהום, במיוחד בעת שימוש בכמויות נמוכות של חומר מוצא. מומלץ להשתמש בקולט אדים UV וקצוות פיפטה מסוננים בעת הכנת הדגימות במידת האפשר, כמו גם לשמור על הפרדה בין אזורי טרום הגברה ופוסט-הגברה. מדידות ריקות ודגימות של הטרופלזמה ידועה (כגון דנ"א מסוג פרא) צרי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325