Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

Özet

Pirosekans testleri, heteroplazmik hücrelerde veya dokularda mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin sağlam ve hızlı genotiplendirilmesini sağlar.

Özet

Mitokondriyal genomdaki (mtDNA) mutasyonlar maternal kalıtsal genetik hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, mtDNA polimorfizmlerine olan ilgi, mtDNA mutagenezi ile model üretme yeteneğinin yakın zamanda geliştirilmesi ve mitokondriyal genetik anormallikler ile kanser, diyabet ve demans gibi yaşa bağlı yaygın hastalıklar arasındaki ilişkinin yeni bir şekilde değerlendirilmesi nedeniyle son yıllarda artmıştır. Pyrosequencing, rutin genotipleme deneyleri için mitokondriyal alanda yaygın olarak kullanılan bir sentez yoluyla sıralama tekniğidir. Masif paralel dizileme yöntemleriyle karşılaştırıldığında göreceli olarak satın alınabilirliği ve uygulama kolaylığı, onu mitokondriyal genetik alanında paha biçilmez bir teknik haline getirmekte ve heteroplazminin artan esneklikle hızlı bir şekilde nicelleştirilmesine izin vermektedir. Bu yöntemin pratikliğine rağmen, mtDNA genotiplemesinin bir aracı olarak uygulanması, özellikle biyolojik veya teknik kökenli belirli önyargılardan kaçınmak için belirli kılavuzların gözlemlenmesini gerektirir. Bu protokol, heteroplazmi ölçümü bağlamında kullanılmak üzere pyrosequencing testlerinin tasarlanması ve uygulanmasında gerekli adımları ve önlemleri özetlemektedir.

Giriş

Mitokondriyal genom, matris olarak adlandırılan mitokondrinin en iç bölmesinde bulunan küçük (16.5 kb) dairesel moleküller (mtDNA) formunda bulunur ve mitokondriyal solunum zincirinin 13 alt birimini ve ayrıca mitokondriyal ribozom¹ tarafından yerinde translasyonu için gerekli olan tRNA'ları ve rRNA'ları kodlar. Bu genom, mitokondriyal fonksiyon için gerekli olan tüm proteinlerin yaklaşık% 1'ini temsil eder, geri kalanı nükleer DNA (nDNA) tarafından kodlanır. Mitokondrilerin, alfa-proteobakteriyel bir ata ile atasal bir ökaryotik hücre arasındaki endosimbiyotik füzyon olayından türetildiği varsayılmaktadır. Bu varsayımsal simbiyoz gerçekleştikten sonra, mitokondrinin genetik bilgisi, modern^{siyanobakterilerin} genomlarıyla karşılaştırıldığında mtDNA'nın yukarıda belirtilen kompaktlığını açıklayan çağlar boyunca çekirdeğe kademeli olarak aktarıldı. Genlerin böyle bir transferi, mtDNA'da bulunan dizilere oldukça homolog olan uzun nDNA uzantılarının varlığı ile en güçlü şekilde kanıtlanmıştır. Bu nükleer mitokondriyal diziler (NUMT'ler), genotipleme sırasında yaygın bir yanlış yorumlama kaynağıdır ve mtDNA^3'ü genotiplendirirken nükleer önyargıları önlemek için bazı önlemler alınmalıdır (Şekil 1A).

mtDNA'nın bir diğer ayırt edici özelliği, kopya sayısının hücre tipine bağlı olarak değişmesi ve^{hücre başına on} binlerce kopya 4 arasında herhangi bir yerde numaralandırılmasıdır. Bu çok kopyalı doğası nedeniyle, mtDNA, tek bir hücre içinde çok çeşitli genotipleri barındırabilir, bu da kromozomların zigotluğu göz önüne alındığında, nükleer genlerle ilişkili ayrık alellerin aksine, alellerin daha sürekli bir dağılımına neden olabilir. Mitokondriyal alellerin bu heterojenliği, tipik olarak belirli bir mutasyonun yüzde prevalansında belirli bir hücredeki toplam mtDNA'nın bir oranı olarak ifade edilen mitokondriyal heteroplazmi olarak adlandırılır. Heteroplazmi, bir hücrede bulunan benzersiz bir mtDNA türünü ifade eden homoplazmi ile karşılaştırılabilir.

Mitokondriyal heteroplazminin ölçülmesi, patojenik varyantları barındıran mtDNA moleküllerinin oranını ölçerken özellikle ilgi çekicidir. Bu tür varyantlar, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), küçük indeller veya büyük ölçekli delesyonlar şeklinde gelir⁵. Çoğu insan patojenik varyantlar için heteroplazmiktir; Bununla birlikte, genellikle eşik etkisi⁶ olarak adlandırılan bir fenomende patojenik mtDNA'nın daha yüksek heteroplazmi seviyelerinde ortaya çıkan herhangi bir klinik fenotip sergilemezler. Patojenite ile ilişkili değerler, patojenik mutasyonun doğasına ve meydana geldiği dokuya büyük ölçüde bağlı olsa da, tipik olarak% 60 heteroplazmi^7'nin üzerindedir.

Mitokondriyal genotiplemenin yaygın olduğu birkaç araştırma alanı vardır. Tıp alanında, mtDNA mutasyonlarının test edilmesi veya ölçülmesi, birçoğu kökenleri olarak mtDNA anormalliklerine sahip olan mitokondriyal hastalıklar için bir tanı kriteri olarak hizmet edebilir⁵. İnsan patojenik mutasyonlarının incelenmesine ek olarak, mtDNA'da patojenik SNP'leri barındıran hayvan modellerinin prevalansının artması muhtemeldir, mitokondriyal olarak hedeflenmiş DddA kaynaklı sitozin baz editörleri (DdCBE'ler)⁸ ve adenin baz düzenlemesi için TALE bazlı deaminazlar (TALED'ler) tarafından sağlanan mitokondriyal baz düzenlemesinin son zamanlarda ortaya çıkması göz önüne alındığında⁹. Bu yaklaşım, anormal mitokondriyal genotipler ile ortaya çıkan işlev bozuklukları arasındaki etkileşimi anlamada etkili olacaktır. Ayrıca, insan mitokondriyal hastalıklarında terapötik bir strateji olarak nihai kullanım için mitokondriyal genomun, heteroplazmi kayması olarak bilinen bir yaklaşımla yeniden şekillendirilmesi için devam eden bilimsel araştırmalar da vardır. Bu araştırma alanı öncelikle mutasyona özgü nükleazların mitokondriyal matrise yönlendirilmesini içerir; bu, patojenik mtDNA'nın tercihli bozulmasına neden olur ve fenotip^{10,11,12,13'te} kurtarmalara yol açar. Mitokondriyal genotipin yeniden şekillendirilmesini içeren herhangi bir deney, heteroplazmi kaymalarını değerlendirmek için sağlam bir nicel yöntem gerektirir.

MtDNA'yı genotiplemek için çok çeşitli yöntemler kullanılır ve bunlar mutasyonun doğasına göre değişir. Yeni nesil dizileme (NGS) yöntemleri, mtDNA'daki SNP'lerin nicelleştirilmesi söz konusu olduğunda daha hassastır; Bununla birlikte, bu yöntemler, özellikle numune sayısı küçükse, mitokondriyal heteroplazminin rutin nicelleştirilmesi için engelleyici derecede pahalı olmaya devam etmektedir. Sanger dizilimi, SNP'lerin algılanmasına da izin verebilir; Bununla birlikte, bu yaklaşım nicel değildir ve genellikle düşük heteroplazmi seviyelerini tespit etmekte başarısız olur veya yüksek heteroplazmileri tahmin ederken yanlış olabilir. Pyrosequencing, minimal hazırlık içeren ve herhangi bir mtDNA örneği için heteroplazminin hızlı bir şekilde nicelleştirilmesini sağlayan bir tahlil olarak, bu iki uç nokta arasında uygun bir uzlaşma olarak önerilmektedir. Bu yöntem, adli analiz 14,15^, klinik tanı ¹⁶ veya mtDNA'nın tek hücrelerden genotiplenmesi ¹⁷ dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda çok sayıda araştırmacı tarafından mitokondriyal SNP'leri ölçmek için rutin olarak kullanılmıştır.

Bu tahlil, mtDNA'da SNP'yi çevreleyen bir bölgenin ilk PCR preamplifikasyon adımını içerir ve bunu daha önce üretilen amplikonun bir ipliğini kullanarak sentez yoluyla bir sıralama testi izler. Ön amplifikasyon adımında kullanılan iki primerden biri, 5' ucunda biyotinillenmelidir, bu da pirozanslama aparatının, dizileme reaksiyonu için şablon olarak kullanılacak tek DNA ipliğini izole etmesini sağlayacaktır. Üçüncü bir dizileme primeri daha sonra tutulan biyotinile iplikçik üzerine tavlanır, bu da deoksinükleotidler olarak ortaya çıkan DNA sentezinin reaksiyon odasına önceden tanımlanmış bir sırayla dağıtılmasına izin verir. Pirosequencer, ışıldayan bir okumaya dayanarak dahil edilen her bir bazın miktarını kaydeder ve DNA sentezi üzerine mutant ve vahşi tip mitokondriyal alellerin nispi nicelleştirilmesine izin verir (Şekil 1B). Lüminesans, ATP varlığında ışık yayan bir lusiferaz enzimi tarafından üretilir, bu da bir ATP sülfürilazın her bir nükleotid tarafından salınan pirofosfatlardan her birleşme olayında de novo sentezlediği ışığı yayar. Bu iki reaksiyon şu şekilde özetlenebilir:

1. PP_i (nükleotid birleşmesinden) + APS → ATP + sülfat (ATP sülfürilaz)

2. ATP + lusiferin +_O2 → AMP + PP_i + oksilüsiferin + CO₂ + ışık (lusiferaz)

İkinci reaksiyonda lusiferaz ile çapraz reaksiyona giren ATP olmadan pirosequencer tarafından adenin bazlarının tespit edilmesi bir zorluktur. Bununla birlikte, bu, DNA sentezi için bir adenin analoğu, yani dATPαS kullanılarak çözülür. Lusiferaz için mükemmel bir substrat olmamasına rağmen, pirosequencer tarafından dijital olarak ayarlanan ve 0.9 faktörüne ayarlanan diğer üç nükleotid ile karşılaştırıldığında daha güçlü bir lüminesans üretir. Bu doğal değişkenlik nedeniyle, SNP pozisyonunda adenin diziliminden kaçınılması önerilmektedir (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakınız).

Aşağıdaki protokol, pirozanslama ile mtDNA heteroplazmi değerlendirme yöntemini detaylandırmakta ve mtDNA'daki SNP'leri genotiplendirirken biyolojik veya teknik önyargıyı önlemek için amplifikasyon primerlerinin tasarımında gerekli önlemleri özetlemektedir. İkincisi, astar setlerinin dijital olarak incelenmesini ve seçilmesini, ön amplifikasyon PCR'sinin optimize edilmesini ve son olarak tahlilin sıralanmasını ve rafine edilmesini içerir. İki uygulamalı örnek tahlil gösterilmiştir: birincisi, en yaygın insan patojenik varyantı m.3243A>G^18'in optimizasyonu ve ikincisi, Cambridge 10,11,12,19,20,21,22'deki Minczuk laboratuvarında geliştirilen teknolojiler kullanılarak heteroplazmi kayması geçiren fare embriyonik fibroblast (MEF) hücrelerinin genotiplenmesi.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan insan 3243A>G cybrid hücrelerinin ve ölümsüzleştirilmiş m.5024C>T MEF'lerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verilmiştir. Hasta hücreleri Cambridge Üniversitesi'nde toplanmadığı için bu durumda etik onay gerekli değildi. Bununla birlikte, insan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Pirosekans için örnek DNA'yı hazırlarken PCR kurulumu için en iyi uygulamaları takip etmeniz şiddetle tavsiye edilir. Aynı primerlerin kullanıldığı sık amplifikasyon, amplikon kontaminasyonuna yol açabilir ve PCR öncesi ve PCR sonrası alanlar arasında katı bir ayrım gözlenmezse, sonraki genotiplemeye önyargı getirebilir. Burada sunulan boru hattı, tek bir üreticinin özel ekipmanlarını kullanır; detaylar Malzeme Tablosunda bulunabilir. PCR için astar tasarımı istenirse manuel olarak gerçekleştirilebilir; ancak, bu amaçla mevcut yazılımların kullanılması önerilir ( Malzeme Tablosuna bakınız).

1. Pyrosequencing astar tasarımı ve tahlil seçimi

1. Primer adaylarının yazılım ile elde edilmesi
   1. Genotiplendirilen türler için bir mtDNA dizi dosyası edinin ve SNP'nin konumunu tanımlayın. SNP'nin konumunun kolayca tanımlanabilmesi için kullanılan referans dizisinin, incelenen mutasyon için uygun baz numaralandırmasını kullandığından emin olun.
   2. SNP sitesinin yukarı ve aşağı yönünde 1.000 baz çiftini kopyalayın ve kesilen diziyi pyrosequencing astar tasarımı için tasarlanan yazılıma yapıştırın ( bkz.
   3. Analiz edilen SNP tabanını, polimorfik tabanı vurgulayarak ve sağ tıklayıp ardından hedef bölgeyi ayarla'yı seçerek yazılımdaki pyrosequencing testinin hedefi olarak ayarlayın.
   4. Primer seçimini başlatmak için arayüzün sağ üst köşesindeki oynat simgesine basın.
   5. Yazılımın şimdi otomatik olarak primer üçlüsü oluşturmasını bekleyin: şablon DNA'nın ön amplifikasyonu için iki primer ve pyrosequencing makinesinde sentez yoluyla dizileme için üçüncü bir astar. Sağ tıklayıp Tüm astar setlerini kopyala'yı seçerek tüm astar setlerini koruyun.
2. Oluşturulan listeden en uygun astar setlerinin seçilmesi
   1. Astarlama kümelerini, kalite puanına göre azalan sırada sağlayan yazılım çıktısına dayalı olarak en yüksek kalite puanına sahip astar kümelerini koruyun. Mümkünse, puanı 80'in altında olan astar setlerini atlayın.
   2. Tutulan astar setleri için, amplifikasyon primerleri tarafından üretilen amplikonu tanımlayın ve kopyalayın.
   3. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi'daki çevrimiçi gönderim portalını kullanarak NCBI Blast kullanılarak genotiplendirilecek organizmanın tüm genomu ile üretilen amplikonları hizalayın. Gönderim sırasında açılır menülerden aşağıdakileri seçin:
      1. Veritabanı Seçin | Genomik + Transkript veritabanları.
      2. Analiz edilen SNP'ye bağlı olarak açılır menüden İnsan veya Fare'yi seçin.
      3. Şunun için optimize et'i seçin | Biraz benzer diziler (Blastn).
   4. (İsteğe bağlı) Fare veya insan dışında bir organizmayı genotiplendiriyorsanız, gönderim sırasında aşağıdakileri seçin:
      1. Veritabanı Seçin | Standart veritabanı.
      2. Açılır menüden RefSeq Temsilcisi genomları'nı seçin
      3. Şunun için optimize et'i seçin | Biraz benzer diziler (Blastn)
   5. Mümkün olduğunda, mtDNA amplikonuna mükemmel homolojiye sahip herhangi bir amplikonu atlayın, özellikle de primer bağlanma bölgeleri mükemmel homolog ise (tartışmaya bakınız).
      NOT: BLAST hizalama aracı, amplifikasyon öncesi amplikonlara kayda değer homolojiye sahip herhangi bir diziyi döndürecektir. Bu, girişte açıklanan NUMT'lerin tespit edilmesine izin verir; bu, hesaba katılmazsa, mitokondriyal DNA ile birlikte güçlendirildikleri için bir önyargıya neden olabilir.
   6. Bu boru hattı ile elde edilen oligoları sipariş edin. Sentez sırası sırasında doğru amplifikasyon primerine 5' biyotin modifikasyonunun eklendiğinden emin olun, böylece dizileme astarı biyotinile ipliği tamamlayıcı olacaktır.
      NOT: Sıralama astarı seçimi, amplifikasyon primerlerinden daha esnektir ve sıralama astarının 3' ucunu ve değişken konumu ayıran en az bir bazın olması önerilir.

2. Preamplifikasyon PCR optimizasyonu

1. Uygun bir yöntem kullanarak toplam genomik DNA'yı çıkararak DNA örneklerini hazırlayın.
   NOT: Bu büyük ölçüde genotiplendirilen hücrelerin sayısına ve kökenlerine bağlı olacaktır. DNA, proteinaz K içeren bir lizis tamponu kullanılarak tek hücrelerden izole ediliyorsa, numune, sonraki PCR sırasında polimerazı bozmamak için 10 dakika boyunca 95 ° C'de denatüre edilmelidir.
2. PCR kurulumu ve termal blok ayarları
   1. PCR'yi tercih edilen yüksek doğruluklu bir polimeraz ile ayarlayın. Dört reaksiyon için bir Master Mix hazırlayın. Bir pirozezans çalışması için sadece 10 μL PCR reaksiyonu gerektiğinden, 25 μL PCR reaksiyonu hazırlayın (gerekirse teknik bir tekrara izin vermek için). Hem ileri hem de geri primerlerin 1 μM'si ile başlangıç materyali olarak yaklaşık 10 ng genomik DNA içeren 40 döngü PCR kullanın.
   2. Uzatma süresini, seçilen ön amplifikasyon primerlerinin uzunluğunu dikkate alarak, kullanılan polimeraz için üreticinin spesifikasyonlarına göre ayarlayın.
   3. Değişken tavlama sıcaklığı ayarlarına sahip bir termal döngüleyici kullanın. Tavlama sıcaklığı astar dizisine, polimeraz tamponunun tuz içeriğine ve diğer faktörlere bağlı olarak farklılık gösterebildiğinden, termal döngü programına dört farklı tavlama sıcaklığı programlayın.
      NOT: Temsili sonuçlarda çalışılan örnekte aşağıdaki sıcaklıklar kullanılmıştır: 55 °C, 60 °C, 65 °C ve 70 °C.
   4. Master Mix'i dört adet 200 μL PCR tüpüne bölün ve bunları 40 döngü boyunca termal döngüleyicide seçilen dört tavlama sıcaklığının her birinde çalışacak şekilde ayarlayın.
3. Ön amplifikasyon bandı görselleştirme
   1. PCR çalışması sırasında, görselleştirme maddesi olarak SYBR Safe veya ethidyum bromür ile 1x TBE'de% 2'lik (w / v) bir agaroz jeli hazırlayın.
      NOT: Güçlendirilmiş parçalar genellikle kısa, tipik olarak 100 ila 500 baz çifti arasında değiştiğinden, görselleştirme için daha yüksek bir yüzde jeli önerilir.
   2. Adım 2.2'deki PCR tamamlandıktan sonra, reaksiyonun 10 μL'sini uygun miktarda DNA yükleme tamponu ile karıştırın ve yaklaşık 45 dakika boyunca 7 V / cm'de% 2 agaroz jeli üzerinde çalıştırın.
   3. Elde edilen DNA parçalarını bir UV transilluminatörü üzerinde görselleştirin.
      NOT: Ön amplifikasyon adımı için seçilen termal döngü koşulları, beklenen boyutta tek bir temiz bant üretmelidir. Daha düşük tavlama sıcaklıkları bazen hedef dışı amplifikasyona neden olabilir, bu da sonraki pyrosequencing'e önyargılar getirebilir.
   4. Sonraki amplifikasyonlar için doğru boyutta temiz bir bant üreten en düşük tavlama sıcaklığını seçin.
   5. (İsteğe bağlı) Beklenen boyuttaki bir bandı tüketin, tercih edilen bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın ve numunenin yaklaşık heteroplazmisini referans olarak doğrulamak için Sanger dizilimi ile analiz edin.

3. Cihaz kurulumu ve çalıştırması

NOT: Önceki bölümdeki PCR adımı optimize edildikten sonra, bir sonraki adım, spesifik SNP'yi analiz etmek için pirosequencer'ı doğru nükleotid dizisiyle programlamayı içerir. Bu, sıralama astarının 3' ucunun doğrudan aşağı yönünde 10 baz girmeyi içerir. Bu, aşağıdaki bölümde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. Tahlil yapılandırması
   1. Pirosequencer ile birlikte verilen çalıştırma yazılımını açın ve arayüzün sol üst köşesindeki Yeni Tahlil'i seçin.
   2. Alel niceleme testi şablonunu seçin.
   3. Analiz edilecek Sekansı, ilgili SNP'nin yukarı akışı olması gereken dizileme astarının doğrudan aşağı yönünde dahil edilecek nükleotidleri yazarak ilgili kutuya girin. Değişken konum için, eğik çizgiyle ayrılmış iki olası tabanı belirtin (örneğin, A/T).
   4. Dağıtım sırası oluştur düğmesine basın ve yazılımın sentez yoluyla sıralama reaksiyonunda dağıtılacak nükleotidler için uygun bir sırayı otomatik olarak belirlemesine izin verin.
   5. Kaydedin ve test için bir ad sağlayın.
2. Reaktif hazırlama ve depolama
   1. Pirosequencer reaktif kitinde sağlanan Tavlama Tamponunda 4 μM'ye sipariş edilen sıralama astarını seyreltin.
      NOT: Sıralama astarı önce bir stok çözeltisi olarak suda 100 μM'ye kadar seyreltilebilir ve daha sonra gerektiğinde Tavlama Tamponunda 4 μM'ye kadar seyreltilebilir.
   2. Enzim ve substrat hazırlama ve kullanma
      1. İlk kutudan çıkarken, liyofilize enzimi ve substratı üreticinin tavsiyelerine göre yeniden çözün. Kullanılmadığında -20 °C'de saklayın.
      2. Daha sonraki kullanımda, enzim ve substrat şişelerini -20 ° C'den çözün.
         NOT: Sağlanan kitteki diğer tüm reaktifler 4 °C'de buzdolabında tutulabilir. Seyreltilmiş dizileme astarları da 4 °C'de tutulabilir.
   3. Her reaktifin gerekli miktarını buz üzerine yerleştirin.
   4. Gerekli kalan bileşenleri, yani streptavidin kaplı manyetik boncukları, emici şeritleri ve pyrosequencing disklerini 4 ° C'de tutun.
3. Yürütmeyi çalıştır
   NOT: Bir tahlil ilk tasarlandığında, bilinen heteroplazmiye sahip PCR ürünleri kullanılarak kalibre edilmelidir, bu da tahlilin heteroplazmileri doğru bir şekilde ayırt edebilmesini sağlar. Araştırmacılar, bilinen heteroplazmideki PCR ürünlerinin karışımlarını standart olarak kullanabilirler. Örnekler, giriş ve tartışmada belirtilen diğer yöntemlerle, özellikle de NGS ile doğrulanabilir.
   1. Analiz edilecek DNA'yı 5 ng / μL'ye seyreltin. Özellikle ilk çalışmada, bilinen heteroplazmi örneklerini referans olarak ve / veya vahşi tip örnekleri dahil ettiğinizden emin olun.
   2. Bölüm 1 ve bölüm 2'de tanımlanan amplifikasyon primerlerini ve parametrelerini kullanarak 25 μL reaksiyonlarda 5 μL seyreltilmiş DNA'nın ön sekanslama PCR'sini gerçekleştirin. Her numune için teknik PCR çoğaltmaları gerçekleştirin.
      NOT: Ön amplifikasyon PCR, dizilemeye geçmeden önce 4 ° C'de kısa süreli veya -20 ° C'de uzun süreli olarak saklanabilir.
   3. Dosya kurulumunu çalıştırma
      1. Pyrosequencer yazılımının sol üst köşesindeki Yeni Çalıştır'ı seçin.
      2. Pirosequencer, aynı anda 48 ayrı önceden güçlendirilmiş reaksiyonu sıralayabilir, boş bir kare bir pirozanslama diskinde tek bir sıralama kuyusunu temsil eder. Bölüm 3.1'de yapılandırılan tahlilleri bir kareye sağ tıklayıp yük tahlilini seçerek yükleyin. Gerekirse, farklı sıralama primerleri ile dört adede kadar ayrı tahlil sıralayın.
      3. Çalıştırma için kullanılan her sekanslama astarı için otomatik olarak bir enjeksiyon odası atamak üzere astar dağıtım modunu Otomatik olarak ayarlayın.
      4. Bir sıralama diskinde dört farklı türde tahlil çalıştırmadıkça Çalıştırma modunu Standart olarak ayarlayın.
      5. Çalıştırma şablonu dosyasındaki tahlil sayısının, yükseltilen PCR reaksiyonlarının sayısıyla eşleştiğinden emin olun.
         NOT: 48'den fazla örnek çalıştırıyorsanız, ek çalıştırma dosyalarının ayarlanması gerekir.
      6. Çalıştırma dosyalarını bir USB sürücüsüne kaydedin.
   4. Pirosequencer'ın astarlanması
      1. Cihazın ana dokunmatik ekranındaki Temizleme düğmesine basın ve ekrandaki talimatları izleyerek tüm enjektörleri yüksek saflıkta suyla temizleyin. Emici şeridi makineye takarken, uçların "saat 9 yönünde" (merkezin doğrudan solunda) buluştuğundan emin olun.
      2. Adım 3.3.3'te ayarlanan çalıştırmalarla USB belleği takın ve adım 3.3.3'te tanımlanan çalışma dosyalarını yükleyin.
         NOT: Çalıştırma dosyaları USB'deki herhangi bir dizin veya klasörün dışına kaydedilmelidir, aksi takdirde makine tarafından okunamazlar.
      3. Reaktifleri makinedeki ilgili enjektörlere gerektiği gibi yüklemek ve astarlamak için cihazdaki talimatları izleyin.
   5. Örnek disk hazırlama ve tahlil başlatma
      1. Streptavidin kaplı manyetik boncukların oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
         NOT: Bu boncuklar, cihazın ön amplifikasyon PCR adımından biyotinile ipliği yakalamasını sağlayacaktır. Kitten ayrı olarak satın alınmaları gerekir.
      2. Adım 3.3.3'ten itibaren çalıştırma dosyasında tanımlanan kuyucuklara 3 μL boncuk yükleyin.
      3. İlgili numuneye dizilenecek her PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve numuneyi manyetik boncuklarla karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Mümkünse kabarcıklardan kaçının.
      4. Astarlanmış pirosequencer'da diskin makineye yüklenebileceğinin göstergesini arayın. Yüklü numune plakasını disk bölmesindeki metal pimle hizalamadan önce plaka tutma somununu sökün.
      5. Plaka plaka bölmesine sıkıca vidalandıktan sonra, dokunmatik ekran arayüzündeki başlat düğmesine basarak sıralama işlemini başlatın.

4. Sonuç elde etme

1. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, USB sürücüsünü makineden çıkarın ve pirosequencer yazılımını çalıştıran bilgisayara tekrar takın. Aşağıdaki adımlarla devam ederken, günün son çalışması ise istemleri izleyerek pirosequencer'ı temizlemeye devam edin.
2. Yeni oluşturulan çalıştırma dosyasının USB sürücüsünde görünmesini bekleyin ve çalıştırma sonucu dosyasına çift tıklayın. Bu, nükleotid katılımı üzerine her bir kuyucuğun lusiferaz çıkışını otomatik olarak analiz eder ve bölüm 3.1'deki tahlil konfigürasyonu sırasında tanımlanan mitokondriyal alelini nicelleştirir.
3. Okumaların kalitesine bağlı olarak yazılım tarafından gösterilen aşağıdaki renk puanlarını arayın. Mavi en uygun çalıştırmayı, sarı uyarı içeren bir çalıştırmayı ve kırmızı başarısız bir çalıştırmayı gösterir. Sonuçları kaydetmek için üst pencerede Raporlar'ı seçin | Pirogramları ve çalıştırmanın her bir kuyucuğundan elde edilen sonuçları içeren bir .pdf dosyası oluşturmak için tam rapor. Alternatif olarak, sonuçları Raporlar sekmesi altındaki diğer biçimlerde de indirebilirsiniz.

Sonuçlar

Bu bölümde, insan patojenik mtDNA mutasyonu için bir pirozanslama testinin örnek optimizasyonunun yanı sıra, mitokondriyal çinko parmak nükleazları (mtZFN'ler) ile tedavi edilen heteroplazmik (m.5024C>T) fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) genotiplendirilmesinden elde edilen dizileme verileri sunulmaktadır. Tahlilin insan hücreleri için optimize edilmesi ve iki farklı tahlilin karşılaştırılması, en doğru olanın nasıl seçileceğini gösterirken, ikinci örnekte genetiği değiştirilmiş M...

Tartışmalar

Protokolün başarısı için kritik bir husus, özellikle düşük miktarda başlangıç malzemesi kullanıldığında kontaminasyondan kaçınmaktır. Numuneleri hazırlarken mümkün olduğunca UV davlumbaz ve filtrelenmiş pipet uçlarının kullanılması, ayrıca ön amplifikasyon ve amplifikasyon sonrası alanların ayrı tutulması önerilir. Boş ölçümler ve bilinen heteroplazmi örnekleri (vahşi tip DNA gibi), teknik veya biyolojik önyargıyı kontrol etmek için kıyaslama ölçütü olarak kullanılmak ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325