Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخطأ في فصل الكروموسومات هو سمة شائعة في البويضات. لذلك ، فإن دراسة نقطة تفتيش تجميع المغزل تعطي أدلة مهمة حول الآليات اللازمة لإنتاج بيض صحي. يصف البروتوكول الحالي ثلاثة مقايسات تكميلية لتقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفئران.

Abstract

اختلال الصيغة الصبغية هو الشذوذ الوراثي الرئيسي الذي يسبب الإجهاض المبكر وفشل الحمل لدى البشر. تحدث معظم الأخطاء في فصل الكروموسومات التي تؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية أثناء الانقسام الميوزي في البويضات ، ولكن لماذا يكون الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية عرضة للخطأ لا يزال غير مفهوم تماما. أثناء انقسام الخلايا ، تمنع الخلايا الأخطاء في فصل الكروموسومات عن طريق تنشيط نقطة فحص تجميع المغزل (SAC). تعتمد آلية التحكم هذه على اكتشاف مرفقات كينيتوخور (KT) - الأنابيب الدقيقة (MT) واستشعار التوتر الناتج عن ألياف المغزل. عندما تكون KTs غير متصلة ، يتم تنشيط SAC ويمنع تقدم دورة الخلية. يتم تنشيط SAC أولا بواسطة كيناز MPS1 ، والذي يؤدي إلى تجنيد وتشكيل مجمع نقطة التفتيش الانقسامية (MCC) ، المكون من MAD1 و MAD2 و BUB3 و BUBR1. بعد ذلك ، ينتشر MCC في السيتوبلازم ويعزل CDC20 ، وهو منشط مركب / سيكلوسوم معزز للطور (APC / C). بمجرد أن تصبح KTs متصلة بالأنابيب الدقيقة ويتم محاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم إطلاق CDC20 ، ويتم تنشيط APC / C ، مما يؤدي إلى تدهور Cyclin B و Securin ، مما يسمح ببداية الطور. بالمقارنة مع الخلايا الجسدية ، فإن SAC في البويضات ليست فعالة لأن الخلايا يمكن أن تخضع للطور الانفصالي على الرغم من وجود KTs غير مرتبطة. إن فهم سبب كون SAC أكثر تساهلا وما إذا كان هذا التساهل هو أحد أسباب أخطاء فصل الكروموسومات في البويضات لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحقيق. يصف البروتوكول الحالي التقنيات الثلاث لتقييم سلامة SAC بشكل شامل في بويضات الفئران. تتضمن هذه التقنيات استخدام نوكودازول لإزالة بلمرة MTs لتقييم استجابة SAC ، وتتبع إسكات SAC باتباع حركية تدمير Securin ، وتقييم توظيف MAD2 إلى KTs عن طريق التألق المناعي. تعمل هذه التقنيات معا على فحص الآليات اللازمة لإنتاج بويضات صحية من خلال توفير تقييم كامل لسلامة SAC.

Introduction

اختلال الصيغة الصبغية ، الذي ينشأ عن أخطاء في فصل الكروموسومات ، هو السبب الرئيسي للإجهاض المبكر ويرتبط ارتباطا وثيقا بالأخطاء في الانقسام الاختزالي1. يختلف الانقسام الميوزي عن الانقسام الميتوزي؛ لأنه يتكون من جولتين من الانقسام الخلوي دون تدخل خطوة تضاعف الحمض النووي (DNA). في الانقسام الميوزي الأول، تنفصل الكروموسومات المتماثلة بينما تظل الكروماتيدات الشقيقة معا. في البويضات ، تكون هذه الخطوة عرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى إنتاج بيض اختلال الصيغة الصبغية2.

لمنع أخطاء فصل الكروموسومات ، تقوم معظم أنواع الخلايا بتنشيط آلية مراقبة توقف دورة الخلية مؤقتا ، تسمى نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC). تستشعر هذه الآلية مرفقات الكينيتوخور (KT) - الأنابيب الدقيقة (MT) ويتم توليد التوتر عندما يتم توجيه الكروموسومات بطريقة ثنائية القطب3. تؤدي الحركية غير المرتبطة إلى استجابة SAC التي تبدأ بتوظيف MPS1 ، المنظم الرئيسي ل SAC ، إلى kinetochores 3,4. يبدأ MPS1 في توظيف مكونات SAC الأخرى ، حيث يعمل كمنصة لتشكيل مجمع نقاط التفتيش الانقسامية (MCC). ينتشر MCC ، المكون من MAD1 و MAD2 و BUB3 و BUBR1 ، في السيتوبلازم ويمنع تنشيط APC / C عن طريق عزل المنشط CDC20. بمجرد ربط جميع الحركية بثبات ب MTs ومحاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم تفكيك MCC وإطلاق CDC20 ، مما يسمح بتنشيط APC / C. يؤدي APC / C النشط إلى تدهور Securin و Cyclin B ، وهما خطوتان رئيسيتان في تحفيز بداية الطور 5,6. في الخلايا الجسدية ، يكون SAC صارما لأنه يتم تنشيطه بواسطة حركية واحدة غير متصلة وهو كاف للحث على إيقاف دورة الخلية6. ومع ذلك ، أثناء الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية ، يكون SAC أكثر تساهلا ، ويمكن أن تدخل البويضات في الطور الانفصالي الأول مع واحد أو أكثر من الحركية غير المرتبطة6،7،8،9،10. إن فهم سبب كون SAC أكثر تساهلا في البويضات هو مجال تركيز مستمر في هذا المجال. يمكن أن تؤدي الآليات التي تسبب عيوبا في تنشيط SAC أو إسكات SAC إلى أخطاء في فصل الكروموسومات أو توقف دورة الخلية لفترات طويلة وموت الخلايا. لذلك ، فإن تقييم الآليات التي تحافظ على سلامة SAC في البويضات مهم لفهم عملية تكوين بويضات صحية ومتعددة الصبغيات.

يصف هذا البروتوكول تقنيات التقييم الشامل لسلامة SAC في الانقسام الاختزالي لبويضة الفأر من خلال فحص الخطوات الحرجة المختلفة لنقطة التفتيش. أولا ، يتم وصف تقييم استجابة SAC بعد تحفيز تنشيط SAC. يتم تحقيق هذا التنشيط عن طريق توليد حركية غير مرتبطة باستخدام نوكودازول ، وهو دواء يزيل بلمرة MTs11. ثانيا ، يتم وصف طريقة لمراقبة إسكات SAC من خلال تتبع ديناميكيات تدهور Securin أثناء نضوج البويضة. أخيرا ، يتم استخدام مقايسة قائمة على التألق المناعي لقياس تجنيد MAD2 ، أحد مكونات MCC ، إلى الحركية. معا ، تقوم هذه المقايسات بتقييم شامل لسلامة SAC أثناء النضج الاختزالي للبويضة.

Protocol

تم إيواء جميع الفئران المستخدمة في هذه البروتوكولات وتربيتها وفقا للجنة جامعة روتجرز المؤسسية لاستخدام الحيوانات ورعايتها (البروتوكول 201702497) وإرشادات المعاهد الوطنية للصحة. وافقت هذه الهيئات التنظيمية على جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على دراسات على الحيوانات. كانت جميع الفئران المستخدمة في الدراسة الحالية من الإناث CF-1 البالغة من العمر 6-8 أسابيع.

1. التحضير التجريبي

  1. قبل البدء في تقييمات SAC ، اجمع بويضات الفئران باتباع التقرير المنشور مسبقا12. قسم البويضات المجمعة إلى ثلاث مجموعات متساوية الحجم واحتفظ بها في وسائط استزراع Chatot و Ziomek و Bavister (CZB) تحتوي على 2.5 ميكرومتر ميلرينون (انظر جدول المواد) لتجنب الاستئناف الاختزالي13.
    ملاحظة: تكوين CZB: 81.6 mM كلوريد الصوديوم ؛ 4.8 مللي متر KCl ؛ 1.2 مللي متر KH2PO4 ؛ 1.2 مللي متر MgSO4-7H 2O ؛ 0.27 مليمتر بيروفات. 1.7 مللي متر CaCl2 ؛ 30.8 mM DL-حمض اللبنيك. 7 مليمتر توراين. 0.1 مللي متر EDTA ؛ 25 مللي متر NaHCO3 ؛ الجنتاميسين; و 0.3٪ BSA.
  2. تحضير cRNA للحقن المجهري كما هو موضح سابقا12،14. تضخيم جين Securin للفأر من cDNA المستنسخ من بويضات الحويصلة الجرثومية للفأر ، متبوعا بالاستنساخ الفرعي في ناقل pMDL2 الذي يحتوي على تسلسل Gfp15,16.
    1. لتحضير Securin-Gfp cRNA ، قم بخطي البلازميد باستخدام Nde I الهضم. إجراء النسخ في المختبر باستخدام بوليميراز T3 RNA وتنقية cRNA16.
      ملاحظة: قم بتخزين cRNA في حصص 2-3 ميكرولتر عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. علاج نوكودازول والتصوير الحي

  1. تحضير 1 مل من وسائط الاستزراع (CZB) التي تحتوي على 5 ميكرومتر نوكودازول (NOC) ، و 1 مل من وسائط الاستزراع مع 5 ميكرومتر من NOC بالإضافة إلى 0.5 ميكرومتر من الانعكاس (NOC + REV) ، و 1 مل من وسائط الاستزراع مع ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (1: 2000) كعنصر تحكم (انظر جدول المواد).
  2. لنضوج البويضات والتصوير الحي ، استخدم صفيحة 96 بئرا تم تسخينها مسبقا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 ، ورطوبة 80٪. في البئر الأول ، قم بتحميل 150 ميكرولتر من معالجة DMSO للتحكم ؛ في البئر الثاني ، تحميل 150 ميكرولتر من معالجة شهادة عدم الممانعة ؛ وفي البئر الثالث ، قم بتحميل 150 ميكرولتر من معالجة NOC + REV. احتفظ باللوحة في الحاضنة في نفس الظروف المذكورة أعلاه حتى الحاجة.
    ملاحظة: في اللوحة المكونة من 96 بئرا، تجنب استخدام الصف الأول والعمود الأول لأن ظل الحد يتداخل مع جودة الصور.
  3. لبدء النضج الاختزالي ، قم بإزالة الميلرينون. أثناء عرض البويضات تحت مجهر مجسم باستخدام التكبير بين 30x-64x ، اغسل milrinone من الوسائط عن طريق نقل البويضات بالتتابع من خلال ست قطرات من 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة الخالية من milrinone التي تحتوي على DMSO ووضعها في البئر المقابلة للوحة 96 بئر باستخدام ماصة تعمل باليد أو الفم.
    1. عد البويضات عن طريق التقاطها باستخدام ماصة تعمل باليد أو الفم وتوصيلها إلى القطرة التالية لتجنب فقدان أي منها. البويضات مفردة وكبيرة (~ 80 ميكرومتر في القطر) وخلايا مستديرة. ستظهر النواة كزر في وسط الخلية ، ويحيط الغشاء والمنطقة الشفافة بالبويضة.
      ملاحظة: انقل البويضات بين القطرات مع تحريك أقل كمية ممكنة من السائل. هذا يسمح بالإزالة المثلى للميلرينون من وسائط الثقافة. إذا فشلت البويضات في استئناف الانقسام الاختزالي ، فمن المحتمل أن الميلرينون لم تتم إزالته بشكل فعال.
  4. كرر نفس العملية (الخطوة 2.3) لعلاج NOC و NOC + REV.
  5. صور البويضات باستخدام مجهر برايت فيلد مجهز بغرفة حاضنة مع بيئة خاضعة للرقابة في ظل هذه الظروف: 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 80٪ رطوبة. التقط الصور في المستوى الأوسط للبويضات على فترات 20 دقيقة لمدة 24 ساعة.
  6. حدد عدد البويضات التي تقذف الجسم القطبي (PB) عن طريق تحديد الخلايا التي تمر عبر التحريك الخلوي غير المتماثل. ستكون النتيجة خلية صغيرة (PB) بجوار البويضة وداخل المنطقة الشفافة المشتركة. عرض الصور باستخدام برنامج التصوير (ImageJ، انظر جدول المواد).
  7. قم باستيراد تسلسل الصور إلى برنامج تحليل الصور وقم بتطوير الإطارات حتى تمر خلية واحدة أو أكثر من خلال التحريك الخلوي غير المتماثل. احسب النسبة المئوية للبويضات التي تقذف PB من إجمالي البويضات17.

3. مراقبة نمط تدهور Securin-gfp أثناء النضج الاختزالي

  1. جهاز طرد مركزي 3 ميكرولتر من Securin-Gfp cRNA (الخطوة 1.2) عند 19,283 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية18.
    ملاحظة: استخدم المادة الطافية لتجنب تحميل الشوائب التي قد تسبب انسداد الإبرة أثناء الحقن المجهري.
  2. اتبع الحقن المجهري للبويضات خطوة بخطوة ، الموصوف على نطاق واسع في المرجع12. حقن ميكرو طور بويضات محجوزة I مع 100 نانوغرام / ميكرولتر من Securin-gfp cRNA المحضرة في الخطوة 1.2.
  3. بعد الحقن المجهري ، اسمح للبويضات باستعادة وترجمة الحمض النووي الريبي في حاضنة CO2 لمدة 3 ساعات على الأقل. تحقق من التعبير من خلال مراقبة البويضات في نظام تصوير مضان آلي متعدد القنوات (انظر جدول المواد) لعرض إشارة GFP.
  4. كما هو موضح في الخطوة 2.2 ، قم بتحميل 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع مع أو بدون 5 ميكرومتر من نوكودازول و 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع مع 0.5 ميكرومتر من الانعكاس في ثلاثة آبار مختلفة من صفيحة 96 بئر.
  5. اغسل البويضات المحقونة الدقيقة من خلال ست قطرات من وسائط المزرعة الخالية من الميلرينون وانقل 1/3 من البويضات إلى كل علاج.
  6. احتفظ باللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ CO2 و 80٪ رطوبة حتى تستأنف البويضات الانقسام الاختزالي ، حوالي 3 ساعات بعد غسل ميلرينون.
    ملاحظة: استخدم مجهرا مجسما مع تكبير بين 30x-64x لتقييم انهيار الغلاف النووي كسمة مميزة للاستئناف الاختزالي.
  7. سجل صورا لنضوج البويضة باستخدام مجهر مضان مجهز بغرفة حاضنة كما هو موضح في الخطوة 2.6. استخدم إعدادات برايتفيلد للعثور على البويضات في البئر. استخدم مرشح 488 للكشف عن إشارة Securin-gfp وضبط شدة التألق لتجنب الإفراط في تعريض الخلايا.
    1. إذا كان نظام التصوير آليا ، فاحفظ مواضع البويضات في كل بئر. نظرا لأن Securin-gfp موزع بالتساوي في السيتوبلازم ، التقط الصور في المستوى الأوسط للبويضات على فترات 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. لالتقاط مجموعات من البويضات في صورة واحدة ، استخدم عدسة موضوعية تكبير أقل مثل 10x.
  8. استخدم برنامج تحليل الصور لتحديد تدمير Securin-gfp. افتح صور قناة GFP. ابدأ من النقطة الزمنية 1. في برنامج التحليل المفضل ، استخدم أداة تحديد أو شكل لتمييز كل خلية بويضة وإنشاء منطقة اهتمام (ROI) لكل خلية.
    1. استخدم نفس عائد الاستثمار لتحديد منطقة خلفية ليتم طرحها لاحقا. قم بقياس كثافة بكسل GFP في كل عائد استثمار.
  9. باستخدام عائد الاستثمار لكل خلية بويضة تم إنشاؤها في الخطوة 3.8 ، قم بقياس شدة GFP في جميع النقاط الزمنية.
    ملاحظة: في بعض البرامج، تسمح علامة التبويب "تحليل" بتحديد وظيفة القياس.
    1. بعد ذلك ، تقدم إلى الإطار الزمني التالي وكرر هذه العملية لقياس شدة GFP في كل إطار زمني. أخيرا ، لكل قيمة GFP ، اطرح قياس عائد الاستثمار في الخلفية المحددة في الخطوة 3.8. سيعطي هذا التحليل قيمة لشدة Securin-gfp لكل بويضة في كل نقطة زمنية.
  10. استخراج بارامترات مختلفة من نمط تدمير Securin: (أ) الوقت الذي بدأ فيه تدهور Securin-gfp. هذا يخبرنا متى بدأ إسكات SAC ؛ (ب) وقت الإشارة الدنيا Securin-gfp. هذا يخبرنا عندما ينخفض إسكات SAC إلى ما دون مستوى العتبة للسماح بتنشيط APC / C العالي والتدهور الكامل ل Securin-GFP ؛ (ج) معدل تدمير سيكورين - هيئة أجيال السلام19. يوضح هذا مدى سرعة انخفاض نشاط SAC إلى ما دون مستوى عتبة تنشيط APC / C وتدهور Securin-GFP.

4. تجنيد MAD2 في الحركية عن طريق التألق المناعي أثناء النضج الاختزالي

ملاحظة: لجمع البويضات ونضجها ، راجع التقريرالمنشور مسبقا 12.

  1. تقسيم البويضات إلى ثلاث مجموعات. نقل كل مجموعة من البويضات إلى قطرات 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة الخالية من الملرينون. قم بتغطية القطرات بالزيت المعدني وضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 80٪ رطوبة) لمدة 3 ساعات و 5 ساعات و 7 ساعات للوصول إلى المرحلة الأولى المبكرة ، والمرحلة الأولى المتأخرة ، والمرحلة الأولى ، على التوالي.
    ملاحظة: ضع كل نقطة زمنية في طبق مختلف لتجنب إخراج نفس الطبق من الحاضنة عدة مرات ، مما يؤثر على التوقيت المنتظم للنضج الاختزالي.
  2. في النقاط الزمنية المحددة ، قم بإصلاح البويضات عن طريق نقلها إلى قطرات 500 ميكرولتر من 2٪ PFA في 1x PHEM عازلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، باستخدام طبق زجاجي من 9 آبار كما هو موضح سابقا20. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى بئر نظيف يحتوي على قطرة 500 ميكرولتر من محلول الحجب (PBS + 0.3٪ BSA + 0.01٪ Tween-20 + 0.02٪ NaN3).
    ملاحظة: تكوين PHEM: أنابيب 60 مللي متر. 25 ملي متر هيبس ؛ 10 مللي متر EGTA ؛ و 2 mM MgCl2.
    ملاحظة: يمكن للمرء التوقف عند هذه النقطة وتخزين البويضات في محلول مانع في لوحة 9 آبار عند 4 درجات مئوية حتى الوقت المناسب لإكمال التألق المناعي.
  3. لمواصلة الكشف عن MAD2 ، انقل البويضات إلى بئر نظيف يحتوي على قطرة 500 ميكرولتر من محلول النفاذية (PBS + 0.3٪ BSA + 0.1٪ TritonX-100 + 0.02٪ NaN3). احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم نقل الخلايا إلى بئر جديد من محلول الحجب واحتضانها لمدة 10 دقائق.
  4. بالنسبة لبقية خطوات التألق المناعي ، استخدم غطاء طبق 96 بئرا مع مسافات بادئة كما هو موضح سابقا20. استخدم غرفة مظلمة مرطبة لتجنب التعرض للضوء والتبخر. انقل البويضات إلى قطرة 30 ميكرولتر من محلول الحجب مع الجسم المضاد ل MAD2 (1: 1000 ، أرنب) والجسم المضاد المضاد للسنتروميريك (ACA) (1:30 ، الإنسان) (انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يوفر غطاء الطبق المكون من 96 بئرا مساحة لمعالجة العديد من البروتينات والمجموعات في نفس الوقت.
  5. لغسل الأجسام المضادة الأولية الزائدة ، انقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من 1x PHEM عازلة مكملة بنسبة 0.5٪ Triton واحتضانها لمدة 10 دقائق في الغرفة المرطبة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  6. قم بإجراء الغسيل الرابع ، ونقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من 1x PHEM عازلة بدون 0.5٪ 1x Triton ، واحتضانها لمدة 10 دقائق.
  7. انقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من محلول الحجب الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية مثل anti-human-633 (1: 200) و anti-rabbit-568 (1: 200) (انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: اختر مجموعة من الفلوروفورات بناء على ليزر المجهر أو المرشحات.
  8. لغسل الأجسام المضادة الثانوية الزائدة ، كرر الخطوات 4.5-4.6.
  9. لتركيب الخلايا على شريحة المجهر ، انقل الخلايا إلى قطرة 10 ميكرولتر من وسائط التركيب التي تحتوي على DAPI (0.1 مجم / مل) (انظر جدول المواد). أضف نقاطا صغيرة من الفازلين إلى كل ركن من أركان الغطاء ، وضعها بعناية فوق قطرة الوسائط المتصاعدة ، واضغط ببطء للتوزيع. استخدمي طلاء أظافر شفاف لإغلاق الغطاء على الشريحة. للحصول على وصف أكثر تفصيلا لعملية التركيب ، انظر المرجع20.
  10. حركية الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد) مجهز بهدف 40x أو 63x. باستخدام إشارة ACA ، حدد النطاق z الذي يسمح بتصوير منطقة الكروموسوم بأكملها.
    ملاحظة: يمكن استخدام تكبير/تصغير بصري 4.0 وحجم z-step 0.5 ميكرومتر في بعض أنظمة التصوير. قد تختلف هذه المعلمات من نظام إلى آخر ، وسيكون التحسين ضروريا.
  11. تحليل شدة MAD2 في الحركية باستخدام برنامج تحليل الصور. قم بعمل عرض أقصى ل z-stack ثم قم بتقسيم القنوات.
  12. أولا ، قم بإنشاء قناع باستخدام قناة ACA عن طريق تحديد قناة ACA لإنشاء عتبة تحدد جميع إشارات الحركية. انتقل إلى علامة التبويب تحرير وأنشئ تحديدا. بعد ذلك ، قم بإنشاء عائد استثمار باستخدام هذا التحديد.
  13. حدد قناة MAD2 وقم بإحضار التحديد الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.12. حدد طريقة عتبة تتكيف بشكل أفضل مع إشارة MAD2. قياس شدة.
    ملاحظة: حدد طريقة العتبة في علاج التحكم واحتفظ بها ثابتة عند تحليل العلاجات المختلفة.
  14. لإجراء حسابات كثافة البكسل النسبية ، قسم شدة كل خلية على متوسط شدة بويضات WT في التجربة.

النتائج

تقييم استجابة SAC عن طريق علاج نوكودازول
الغرض من هذه التجربة هو تقييم تنشيط SAC وقوته. باستخدام نوكودازول لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة المغزل ، سيتم فك جميع الحركية ، مما سيؤدي إلى توقف دورة الخلية بوساطة SAC. في نظام التصوير الحالي ، قامت بويضات التحكم المعالجة ب DMSO ببثق جسم قطبي ...

Discussion

نقطة تفتيش تجميع المغزل هي آلية تحكم حرجة أثناء انقسام الخلايا مصممة لمنع أخطاء فصل الكروموسومات. يسمح للخلية بالحصول على وقت كاف لتصحيح مرفقات KT-MT غير الصحيحة. الانقسام الاختزالي في البويضات هو عملية معرضة للخطأ ، حيث يحدث معظم الفصل الخاطئ للكروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي الأول ، مم...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R35GM136340 إلى KS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA4503
DAPILife TechnologiesD1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)SigmaD5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568Life TechnologiesA10042
EVOS FL Auto Imaging SystemLife TechnologiesFluorescence microscope
EVOS Onstage IncubatorLife TechnologiesIncubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoatedMatTek CorporationP96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633Life TechnologiesA21091
HEPESSigmaH3537
Human anti-ACAAntibodies Incorporated15-234Dilution 1/30
ImageJNIH
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objectiveLeica
MgSO4·7H20SigmaM7774
MilrinoneSigmaM4659
Na2HPO4SigmaS2429
NaClSigmaS5886
NaN3SigmaS2002
NocodazoleSigmaM1404
Paraformaldhyde (PFA)SigmaP6148
PIPESSigmaP6757
Rabbit anti- MAD2Biolegend924601Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
ReversineCayman Chemical10004412
Triton-XSigma274348
Tween-20SigmaX100
VectashieldVector laboratoriesH-1000

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved