הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

Summary

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

Abstract

Aneuploidy היא החריגה הגנטית המובילה הגורמת להפלה מוקדמת וכישלון הריון בבני אדם. רוב הטעויות בהפרדת הכרומוזומים הגורמות לאנאופלואידיות מתרחשות במהלך מיוזה בביציות, אך עדיין לא ברור לחלוטין מדוע מיוזה ביצית מועדת לשגיאות. במהלך חלוקת התא, תאים מונעים טעויות בהפרדת הכרומוזומים על ידי הפעלת מחסום הרכבת הציר (SAC). מנגנון בקרה זה מסתמך על זיהוי חיבורי קינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) וחישת מתח שנוצר על ידי סיבי ציר. כאשר KT אינם מחוברים, ה- SAC מופעל ומונע התקדמות מחזור התא. ה-SAC מופעל תחילה על ידי MPS1 קינאז, אשר מפעיל את הגיוס וההיווצרות של קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC), המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1. לאחר מכן, MCC מתפזר לתוך הציטופלסמה ו sequesters CDC20, מפעיל קומפלקס / ציקלוזום מקדם anaphase (APC/C). ברגע ש-KT מתחברים למיקרוטובולים והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, CDC20 משתחרר, וה-APC/C מופעל, מה שגורם להתפרקות של ציקלין B וסקורין, ובכך מאפשר הופעת אנאפאזה. בהשוואה לתאים סומטיים, SAC בביציות אינו יעיל באותה מידה מכיוון שתאים יכולים לעבור אנאפאזות למרות שיש להם KT לא מחוברים. ההבנה מדוע ה- SAC מתירני יותר ואם מתירנות זו היא אחד הגורמים לטעויות בהפרדת כרומוזומים בביציות עדיין דורשת חקירה נוספת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שלוש הטכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC בביציות עכבר. טכניקות אלה כוללות שימוש בנוקודזול לדה-פולימריזציה של MTs כדי להעריך את תגובת SAC, מעקב אחר השתקת SAC על ידי מעקב אחר הקינטיקה של הרס סקורין, והערכת הגיוס של MAD2 ל-KT על ידי אימונופלואורסצנציה. יחד, טכניקות אלה בודקות את מנגנוני הבדיקה הדרושים לייצור ביציות בריאות על ידי מתן הערכה מלאה של שלמות SAC.

Introduction

Aneuploidy, אשר נובע מטעויות בהפרדת כרומוזומים, הוא הגורם המוביל להפלות מוקדמות והוא קשור מאוד לטעויות במיוזה¹. מיוזה נבדלת ממיטוזה מכיוון שהיא מורכבת משני סבבים של חלוקת תאים ללא שלב שכפול DNA מתערב. במיוזה I, כרומוזומים הומולוגיים נפרדים בעוד כרומטידים אחים נשארים יחד. בביציות, שלב זה נוטה לשגיאות, מה שמוביל לייצור ביציות אנופלואידיות².

כדי למנוע שגיאות בהפרדת כרומוזומים, רוב סוגי התאים מפעילים מנגנון מעקב המשהה את מחזור התא, הנקרא מחסום הרכבת ציר (SAC). מנגנון זה חש את חיבורי הקינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) והמתח נוצר כאשר הכרומוזומים מכוונים באופן דו-קוטבי³. קינטוכורים לא מחוברים מעוררים תגובת SAC שמתחילה בגיוס MPS1, הרגולטור הראשי של SAC, לקינטוכורים ^3,4. MPS1 יוזמת גיוס של רכיבי SAC אחרים, ופועלת כפלטפורמה ליצירת קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC). ה-MCC, המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1, מתפזר לתוך הציטופלסמה ומעכב את הפעלת APC/C על ידי תפיסת המפעיל שלו CDC20. ברגע שכל הקינטוכורים מחוברים ביציבות ל-MTs והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, וה-MCC מפרק ומשחרר CDC20, ובכך מאפשר הפעלת APC/C. APC/C פעיל משפיל את סקורין וציקלין B, שני שלבים מרכזיים בהפעלת הופעת אנאפאזה ^5,6. בתאים סומטיים, ה-SAC מחמיר מכיוון שהוא מופעל על ידי קינטוחור יחיד שאינו מחובר ומספיק כדי לגרום למעצר מחזור התא⁶. עם זאת, במהלך מיוזה של ביציות, SAC הוא מתירני יותר, וביציות יכולות להיכנס anaphase I עם אחד או יותר kinetochores unconnected 6,7,8,9,10. ההבנה מדוע SAC מתירני יותר בביציות היא תחום מתמשך של התמקדות בתחום. מנגנונים הגורמים לפגמים בהפעלת SAC או השתקת SAC עלולים להוביל לטעויות בהפרדת הכרומוזומים או למעצר ממושך של מחזור התא ולמוות תאי. לכן, הערכת המנגנונים השומרים על שלמות SAC בביציות חשובה להבנת תהליך יצירת הביציות האופלואידיות הבריאות.

פרוטוקול זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC במיוזה של ביציות עכבר על ידי בחינת שלבים קריטיים שונים של המחסום. ראשית, מתוארת הערכת תגובת SAC לאחר גרימת הפעלת SAC. הפעלה זו מושגת על ידי יצירת kinetochores unattached באמצעות nocodazole, תרופה depolymerizes MTs¹¹. שנית, שיטה לניטור השתקת SAC מתוארת על ידי מעקב אחר הדינמיקה של פירוק סקורין במהלך הבשלת הביציות. לבסוף, נעשה שימוש בבדיקה מבוססת אימונופלואורסנציה כדי למדוד את הגיוס של MAD2, אחד מרכיבי MCC, לקינטוכורות. יחד, בדיקות אלה מעריכות באופן מקיף את שלמות SAC במהלך הבשלה מיוטית של ביציות.

Protocol

כל העכברים ששימשו בפרוטוקולים אלה שוכנו וגודלו על פי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ראטגרס (פרוטוקול 201702497) והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. גופים רגולטוריים אלה אישרו את כל הליכי הניסויים הכוללים ניסויים בבעלי חיים. כל העכברים ששימשו במחקר הנוכחי היו נקבות CF-1 בנות 6-8 שבועות.

1. הכנה ניסיונית

1. לפני תחילת הערכות SAC, אספו ביציות עכבר בעקבות דוח¹² שפורסם בעבר. חלקו את הביציות שנאספו לשלוש קבוצות בגודל שווה ושמרו אותן בתרבית Chatot, Ziomek ו-Bavister (CZB) המכילות 2.5 מיקרומטר מילינון (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע חידוש מיוטי¹³.
   הערה: הרכב CZB: 81.6 mM NaCL; 4.8 mM KCl; 1.2 mM KH₂PO₄; 1.2 mM MgSO_{4-7H 2}O; 0.27 מ"מ פירובט; 1.7 mM CaCl₂; 30.8 mM DL-חומצה לקטית; 7 מ"מ טאורין; 0.1 מ"מ EDTA; 25 mM NaHCO₃; גנטמיצין; ו-0.3% BSA.
2. הכינו את ה-cRNA למיקרו-הזרקה כפי שתואר קודם לכן^12,14. הגבירו את הגן Securin של העכבר מה-cDNA המשובט מביציות שלפוחית נבט של עכברים, ולאחר מכן תת-שיבוט לווקטור pMDL2 המכיל רצף Gfp^15,16.
   1. כדי להכין Securin-Gfp cRNA, ליניארי את פלסמיד עם עיכול Nde I. בצע שעתוק חוץ גופי באמצעות T3 RNA פולימראז וטיהור cRNA¹⁶.
      הערה: יש לאחסן cRNA באליציטוטים של 2-3 μL בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

2. טיפול Nocodazole והדמיה חיה

1. הכן 1 מ"ל של מדיה תרבותית (CZB) המכילה 5 מיקרומטר nocodazole (NOC), 1 מ"ל של מדיה תרבותית עם 5 μM של NOC בתוספת 0.5 μM reversine (NOC + REV), ו 1 מ"ל של מדיה תרבית עם Dimethyl sulfoxide (DMSO) (1:2000) כבקרה (ראה טבלה של חומרים).
2. להבשלת ביציות והדמיה חיה, יש להשתמש בצלחת 96 בארות שחוממה מראש באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5%_CO2 ו-80% לחות. בבאר הראשונה, עומס 150 μL של טיפול DMSO בקרה; בבאר השנייה, עומס 150 μL של טיפול NOC; ובבאר השלישית, עומס 150 μL של טיפול NOC + REV. שומרים את הצלחת באינקובטור באותם תנאים כנ"ל עד לצורך.
   הערה: בלוח של 96 בארות, הימנע משימוש בשורה הראשונה ובעמודה הראשונה מכיוון שצל הגבול מפריע לאיכות התמונות.
3. כדי להתחיל התבגרות מיוטית, להסיר milrinone. תוך כדי צפייה בביציות תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות הגדלה בין 30x-64x, שטפו את המילרינון מהמדיה על ידי העברה רציפה של הביציות דרך שש טיפות של 100 μL של מדיה תרבית נטולת מילרינון המכילה DMSO והניחו אותן בבאר המתאימה של צלחת 96 הבארות באמצעות פיפטה המופעלת ביד או בפה.
   1. ספרו ביציות על ידי הרמתן באמצעות פיפטה המופעלת ביד או בפה והעברתן לטיפה הבאה כדי להימנע מאיבודן. הביציות הן יחידות, גדולות (~ 80 מיקרומטר קוטר), ותאים עגולים. הגרעין ייראה כמו כפתור במרכז התא, והקרום והזונה פלוצ'ידה מקיפים את הביצית.
      הערה: העבירו את הביציות בין טיפות תוך כדי הזזת כמות קטנה ככל האפשר של נוזלים. זה מאפשר הסרה אופטימלית של המילרינון מאמצעי התקשורת. אם הביציות לא מצליחות לחדש את המיוזה, סביר להניח שהמילרינון לא הוסר ביעילות.
4. חזור על אותו תהליך (שלב 2.3) לטיפול NOC ו- NOC + REV.
5. דמיינו את הביציות באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד המצויד בתא אינקובטור עם סביבה מבוקרת בתנאים הבאים: 37°C, 5%_CO2 ו-80% לחות. צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות.
6. כמת את מספר הביציות שפולטות גוף קוטבי (PB) על ידי זיהוי התאים שעוברים ציטוקינזיס אסימטרי. התוצאה תהיה תא קטן (PB) ליד הביצית ובתוך הזונה פלוצ'ידה המשותפת. הצג את התמונות באמצעות תוכנת הדמיה (ImageJ, ראה רשימת חומרים).
7. ייבאו רצף תמונות לתוכנת ניתוח התמונה וקדמו את המסגרות עד שתא אחד או יותר יעבור ציטוקינזיס אסימטרי. חישוב אחוז הביציות הפולטות PB מסך הביציות¹⁷.

3. מעקב אחר דפוס התפרקות Securin-gfp במהלך הבשלה מיוטית

1. צנטריפוגה 3 μL של Securin-Gfp cRNA (שלב 1.2) ב 19,283 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C¹⁸.
   הערה: השתמש בסופרנאטנט כדי למנוע העמסת זיהומים שעלולים לגרום לחסימת מחטים במהלך מיקרו-הזרקה.
2. בצע שלב אחר שלב מיקרו-הזרקת ביציות, המתוארת בהרחבה בהפניה¹². מיקרו-הזרקת ביציות שלב I עם 100 ng/μL של Securin-gfp cRNA מוכן בשלב 1.2.
3. לאחר מיקרו-הזרקה, לאפשר לביציות להתאושש ולתרגם את הרנ"א באינקובטור CO₂ למשך 3 שעות לפחות. בדוק את הביטוי על ידי התבוננות בביציות במערכת הדמיה פלואורסצנטית רב-ערוצית אוטומטית (ראה טבלת חומרים) כדי להציג את אות GFP.
4. כמתואר בשלב 2.2, טען 150 μL של מדיה תרבותית עם או בלי 5 μM של nocodazole ו 150 μL של מדיה תרבותית עם 0.5 μM של reversine בשלוש בארות שונות של צלחת 96 בארות.
5. שטפו את הביציות המוזרקות באמצעות שש טיפות של תרבית ללא מילרין והעבירו 1/3 מהביציות לכל טיפול.
6. שמרו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, עם 5%_CO2 ו-80% לחות עד שהביציות יחזרו למיוזה, כ-3 שעות לאחר שטיפת המילרינון.
   הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ עם הגדלה בין 30x-64x כדי להעריך את התמוטטות המעטפת הגרעינית כסימן היכר של חידוש meiotic.
7. הקלט תמונות של הבשלת ביציות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בתא אינקובטור כמתואר בשלב 2.6. השתמש בהגדרות שדה בהיר כדי למצוא את הביציות בבאר. השתמש במסנן 488 כדי לזהות את אות Securin-gfp ולהתאים את עוצמת הפלואורסצנטיות כדי למנוע חשיפת יתר של התאים.
   1. אם מערכת ההדמיה אוטומטית, שמרו את מיקומי הביציות בכל באר. מכיוון שסקורין-gfp מופץ באופן שווה לתוך הציטופלסמה, צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות. כדי ללכוד קבוצות של ביציות בתמונה אחת, השתמש בעדשה אובייקטיבית בהגדלה נמוכה יותר, כגון 10x.
8. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת הרס Securin-gfp. פתח את התמונות של ערוץ GFP. התחל בנקודת זמן 1. בתוכנת הניתוח המועדפת, השתמש בכלי בחירה או צורה כדי לסמן כל ביצית וליצור אזור עניין (ROI) עבור כל תא.
   1. השתמש באותו החזר השקעה כדי לבחור אזור רקע לחיסור מאוחר יותר. מדוד את עוצמת הפיקסלים של GFP בכל החזר השקעה.
9. באמצעות החזר ההשקעה עבור כל ביצית הנוצרת בשלב 3.8, למדוד את עוצמת GFP בכל נקודות הזמן.
   הערה: בתוכנות מסוימות, כרטיסיית "נתח" מאפשרת בחירה של הפונקציה מדידה.
   1. לאחר מכן, התקדם למסגרת הזמן הבאה וחזור על תהליך זה כדי למדוד את עוצמת ה- GFP בכל מסגרת זמן. לבסוף, לכל ערך GFP, החסר את מדידת החזר ההשקעה ברקע שנבחר בשלב 3.8. ניתוח זה ייתן ערך עבור עוצמת Securin-gfp עבור כל ביצית בכל נקודת זמן.
10. חלץ פרמטרים שונים מדפוס הרס סקורין: (א) הזמן שבו החלה השפלת סקורין-GFP. זה אומר מתי השתקת SAC החלה; (ב) זמן האות המינימלי Securin-gfp. זה אומר מתי השתקת SAC ירדה מתחת לרמת סף כדי לאפשר הפעלה גבוהה של APC/C והשפלה מלאה של Securin-GFP; (ג) שיעור ההרס של סקורין-GFP¹⁹. זה אומר באיזו מהירות פעילות SAC יורדת מתחת לרמת סף להפעלת APC/C והשפלת Securin-GFP.

4. גיוס MAD2 בקינטוכורים על ידי אימונופלואורסנציה במהלך הבשלה מיוטית

הערה: לאיסוף ביציות והבשלהן, עיין בדוח¹² שפורסם בעבר.

1. חלקו את הביציות לשלוש קבוצות. העבירו כל קבוצת ביציות לטיפות של 100 μL של תרבית ללא מילרינון. כסו את הטיפות בשמן מינרלי והניחו אותן באינקובטור (37°C, 5% CO₂ ו-80% לחות) למשך 3 שעות, 5 שעות ו-7 שעות כדי להגיע לשלב המוקדם של prometaphase I, שלב Prometaphase I מאוחר ושלב metaphase I, בהתאמה.
   הערה: מניחים כל נקודת זמן בכלי אחר כדי להימנע מהוצאת אותה מנה מהאינקובטור מספר פעמים, מה שמשפיע על העיתוי הרגיל של ההבשלה המיוטית.
2. בנקודות הזמן שהוקצו, תקן את הביציות על ידי העברתן לטיפות של 500 μL של 2% PFA במאגר PHEM 1x למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות צלחת זכוכית 9 בארות כפי שתואר קודם לכן²⁰. לאחר מכן, להעביר את התאים לבאר נקייה המכילה טיפה 500 μL של פתרון חסימה (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN₃).
   הערה: הרכב PHEM: 60 mM PIPES; 25 מ"מ HEPES; 10 mM EGTA; ו 2 mM MgCl₂.
   הערה: ניתן לעצור בשלב זה ולאחסן את הביציות בתמיסה חוסמת בצלחת 9 בארות ב 4 ° C עד הזמן הנוח כדי להשלים immunofluorescence.
3. להמשך גילוי MAD2, העבירו את הביציות לבאר נקייה המכילה טיפה של 500 μL של תמיסת חדירה (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN₃). דוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מעבירים את התאים לבאר חדשה של תמיסת חסימה ודגרים במשך 10 דקות.
4. עבור שאר השלבים immunofluorescence, להשתמש מכסה צלחת 96 היטב עם כניסות כפי שתואר קודם²⁰. השתמשו בתא כהה ולח כדי למנוע חשיפה לאור ואידוי. מעבירים את הביציות לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת עם נוגדן אנטי-MAD2 (1:1000, ארנבת) ונוגדן אנטי-צנטרומרי (ACA) (1:30, אנושי) (ראו טבלת חומרים) ודגורים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
   הערה: מכסה צלחת 96 בארות מאפשר מקום לעיבוד של מספר חלבונים וקבוצות בו זמנית.
5. כדי לשטוף נוגדנים ראשוניים עודפים, להעביר את התאים לטיפה 30 μL של 1x PHEM מאגר בתוספת 0.5% טריטון לדגור במשך 10 דקות בתא לחות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
6. בצע את השטיפה הרביעית, העברת התאים לטיפה של 30 μL של חיץ PHEM 1x ללא 0.5% 1x טריטון, ודגרה במשך 10 דקות.
7. מעבירים את התאים לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת המכילה נוגדנים משניים כגון אנטי-אדם-633 (1:200) ואנטי-ארנב-568 (1:200) (ראו טבלת חומרים) ודגורים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   הערה: בחר את השילוב של פלואורופורים בהתבסס על לייזרים או מסננים במיקרוסקופ.
8. כדי לשטוף נוגדנים משניים עודפים, חזור על שלבים 4.5-4.6.
9. כדי להרכיב את התאים בשקופית המיקרוסקופ, העבר את התאים לטיפה של 10 μL של מדיית הרכבה המכילה DAPI (0.1 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלת חומרים). הוסף נקודות קטנות של וזלין לכל פינה של הכיסוי, הנח אותן בזהירות על גבי טיפת המדיה ההרכבה ולחץ לאט כדי לפזר. השתמשי בלק שקוף כדי לאטום את הכיסוי למגלשה. לתיאור מפורט יותר של תהליך ההרכבה, ראה הפניה²⁰.
10. צלם קינטוכורים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרה של 40x או 63x. באמצעות אות ACA, לקבוע את טווח z המאפשר הדמיה של כל אזור הכרומוזומים.
    הערה: ניתן להשתמש בזום אופטי של 4.0 וגודל z-step של 0.5 מיקרומטר במערכות הדמיה מסוימות. פרמטרים אלה עשויים להשתנות ממערכת למערכת, ואופטימיזציה יהיה צורך.
11. נתח את עוצמת MAD2 בקינטוכורים באמצעות תוכנה לניתוח תמונה. בצע הקרנה מקסימלית של ערימת z ולאחר מכן פצל את הערוצים.
12. ראשית, צור מסיכה באמצעות ערוץ ACA על ידי בחירת ערוץ ACA כדי לקבוע סף המזהה את כל אותות הקינטוחור. עבור אל הכרטיסיה עריכה וצור בחירה. לאחר מכן, צור החזר השקעה באמצעות בחירה זו.
13. בחר את ערוץ MAD2 והבא את הבחירה שנוצרה בשלב 4.12. בחר שיטת סף המתאימה יותר לאות MAD2. מדדו את העוצמה.
    הערה: בחר את שיטת הסף בטיפול הבקרה ושמור אותה קבועה בעת ניתוח טיפולים שונים.
14. כדי לבצע חישובי עוצמת פיקסלים יחסית, חלקו את העוצמה של כל תא בעוצמה הממוצעת של ביציות WT בניסוי.

תוצאות

הערכת היענות SAC על ידי טיפול nocodazole
מטרת ניסוי זה היא להעריך את ההפעלה והחוזק של SAC. על ידי שימוש בנוקודזול לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים של צירים, כל הקינטוכורים לא יהיו מחוברים, מה שיגרום למעצר מחזור התא בתיווך SAC. במערכת ההדמיה הנוכחית, ביציות בקרה שטופלו ב-DMSO הוציאו גוף קוטבי ...

Discussion

מחסום הרכבת הציר הוא מנגנון בקרה קריטי במהלך חלוקת התא שנועד למנוע טעויות בהפרדת כרומוזומים. זה מאפשר לתא מספיק זמן לתקן קבצים מצורפים KT-MT לא תקינים. מיוזה בביציות היא תהליך נוטה לשגיאות, שבו רוב ההפרדה השגויה של הכרומוזומים מתרחשת במהלך מיוזה I, מה שמוביל ליצירת ביציות אנאופלואידיות שהן ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)	Sigma	D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Human anti-ACA	Antibodies Incorporated	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective	Leica
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazole	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti- MAD2	Biolegend	924601	Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector laboratories	H-1000