Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Résumé

L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

Résumé

L’aneuploïdie est la principale anomalie génétique causant une fausse couche précoce et un échec de grossesse chez l’homme. La plupart des erreurs dans la ségrégation chromosomique qui donnent lieu à l’aneuploïdie se produisent pendant la méiose dans les ovocytes, mais pourquoi la méiose ovocytaire est sujette aux erreurs n’est toujours pas entièrement comprise. Pendant la division cellulaire, les cellules préviennent les erreurs de ségrégation chromosomique en activant le point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC). Ce mécanisme de contrôle repose sur la détection des attaches kinétochore (KT)-microtubule (MT) et la détection de la tension générée par les fibres de fuseau. Lorsque les KT ne sont pas attachés, le SAC est activé et empêche la progression du cycle cellulaire. Le SAC est activé d’abord par la kinase MPS1, qui déclenche le recrutement et la formation du complexe de points de contrôle mitotiques (MCC), composé de MAD1, MAD2, BUB3 et BUBR1. Ensuite, le MCC diffuse dans le cytoplasme et séquestre CDC20, un activateur du complexe/cyclosome favorisant l’anaphase (APC/C). Une fois que les KT se fixent aux microtubules et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence, CDC20 est libéré et l’APC / C est activé, déclenchant la dégradation de la cycline B et de la sécurine, permettant ainsi l’apparition de l’anaphase. Comparé aux cellules somatiques, le SAC dans les ovocytes n’est pas aussi efficace parce que les cellules peuvent subir une anaphase malgré des KT non attachées. Comprendre pourquoi le SAC est plus permissif et si cette permissivité est l’une des causes des erreurs de ségrégation chromosomique dans les ovocytes nécessite encore des recherches plus approfondies. Le présent protocole décrit les trois techniques permettant d’évaluer de manière exhaustive l’intégrité des OAC dans les ovocytes de souris. Ces techniques comprennent l’utilisation du nocodazole pour dépolymériser les MT afin d’évaluer la réponse au SAC, le suivi du silençage du SAC en suivant la cinétique de destruction de la sécurine et l’évaluation du recrutement de MAD2 en KT par immunofluorescence. Ensemble, ces techniques sondent les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains en fournissant une évaluation complète de l’intégrité du SAC.

Introduction

L’aneuploïdie, qui résulte d’erreurs dans la ségrégation chromosomique, est la principale cause de fausses couches précoces et est fortement liée aux erreurs de la méiose¹. La méiose est distincte de la mitose parce qu’elle consiste en deux cycles de division cellulaire sans étape intermédiaire de réplication de l’ADN. Dans la méiose I, les chromosomes homologues se séparent tandis que les chromatides sœurs restent ensemble. Dans les ovocytes, cette étape est sujette aux erreurs, conduisant à la production d’œufs aneuploïdes².

Pour éviter les erreurs de ségrégation chromosomique, la plupart des types de cellules activent un mécanisme de surveillance qui interrompt le cycle cellulaire, appelé point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC). Ce mécanisme détecte les attaches kinétochore (KT)-microtubule (MT) et la tension est générée lorsque les chromosomes sont orientés de manière bipolaire³. Les kinétochores non attachées déclenchent une réponse SAC qui commence par le recrutement de MPS1, le régulateur maître du SAC, aux kinétochores ^3,4. MPS1 initie le recrutement d’autres composants du SAC, agissant comme une plate-forme pour former le complexe de points de contrôle mitotiques (MCC). Le MCC, composé de MAD1, MAD2, BUB3 et BUBR1, diffuse dans le cytoplasme et inhibe l’activation de l’APC/C en séquestrant son activateur CDC20. Une fois que tous les kinétochores sont fixés de manière stable aux MT et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence et le MCC se désassemble et libère CDC20, permettant ainsi l’activation de l’APC / C. L’APC/C actif dégrade la sécurine et la cycline B, deux étapes clés dans le déclenchement de l’apparition de l’anaphase ^5,6. Dans les cellules somatiques, le SAC est rigoureux car il est activé par un seul kinétochore non attaché et est suffisant pour induire l’arrêt du cycle cellulaire⁶. Cependant, au cours de la méiose ovocytaire, le SAC est plus permissif, et les ovocytes peuvent entrer en anaphase I avec une ou plusieurs kinétochores 6,7,8,9,10 non attachées. Comprendre pourquoi le SAC est plus permissif dans les ovocytes est un domaine d’intérêt continu dans le domaine. Les mécanismes qui causent des défauts dans l’activation du SAC ou le silençage SAC pourraient entraîner des erreurs dans la ségrégation chromosomique ou un arrêt prolongé du cycle cellulaire et la mort cellulaire. Par conséquent, l’évaluation des mécanismes qui maintiennent l’intégrité du SAC dans les ovocytes est importante pour comprendre le processus de formation d’œufs euploïdes sains.

Ce protocole décrit des techniques permettant d’évaluer de manière exhaustive l’intégrité du SAC dans la méiose ovocytaire de souris en examinant différentes étapes critiques du point de contrôle. Tout d’abord, l’évaluation de la réponse du SAC après avoir induit l’activation du SAC est décrite. Cette activation est obtenue en générant des kinétochores non attachées à l’aide de nocodazole, un médicament qui dépolymérise MTs¹¹. Deuxièmement, une méthode de surveillance du silençage des SAC est décrite en suivant la dynamique de la dégradation de la sécurine pendant la maturation des ovocytes. Enfin, un test basé sur l’immunofluorescence est utilisé pour mesurer le recrutement de MAD2, l’un des composants du MCC, dans les kinétochores. Ensemble, ces tests évaluent de manière exhaustive l’intégrité du SAC au cours de la maturation méiotique des ovocytes.

Protocole

Toutes les souris utilisées dans ces protocoles ont été hébergées et élevées conformément au Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protocol 201702497) et aux directives des National Institutes of Health. Ces organismes de réglementation ont approuvé toutes les procédures expérimentales impliquant des études sur les animaux. Toutes les souris utilisées dans la présente étude étaient des femelles CF-1 âgées de 6 à 8 semaines.

1. Préparation expérimentale

1. Avant de commencer les évaluations du SAC, prélever des ovocytes de souris en suivant le rapport publié précédemment¹². Diviser les ovocytes prélevés en trois groupes de taille égale et les conserver dans des milieux de culture Chatot, Ziomek et Bavister (CZB) contenant 2,5 μM de milrinone (voir le tableau des matériaux) pour éviter la reprise méiotique¹³.
   NOTE: Composition CZB: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH₂PO₄; 1,2 mM MgSO 4-7H2O; 0,27 mM de pyruvate; 1,7 mM CaCl₂; 30,8 mM d’acide DL-lactique; 7 mM de taurine; 0,1 mM d’EDTA; NaHCO₃ 25 mM; Gentamicine; et 0,3 % BSA.
2. Préparer l’ARNc pour la micro-injection comme décrit précédemment^12,14. Amplifier le gène de la sécurine de souris à partir de l’ADNc cloné à partir d’ovocytes germinaux de souris, puis le sous-clonage dans le vecteur pMDL2 contenant la séquence Gfp^15,16.
   1. Pour préparer l’ARNc Securin-Gfp, linéariser le plasmide avec digestion Nde I. Effectuer une transcription in vitro en utilisant l’ARN polymérase T3 et en purifiant l’ARNc¹⁶.
      REMARQUE : Conserver l’ARNc dans des aliquotes de 2 à 3 μL à -80 °C jusqu’à utilisation.

2. Traitement au nocodazole et imagerie en direct

1. Préparer 1 mL de milieu de culture (CZB) contenant 5 μM de nocodazole (AC), 1 mL de milieu de culture contenant 5 μM de NOC plus 0,5 μM de réversine (AC + REV) et 1 mL de milieu de culture avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) (1:2000) comme témoin (voir le tableau des matières).
2. Pour la maturation ovocytaire et l’imagerie en direct, utilisez une plaque de 96 puits préchauffée dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ et 80% d’humidité. Dans le premier puits, charger 150 μL du traitement DMSO témoin; dans le deuxième puits, charger 150 μL de traitement par ACN; et dans le troisième puits, charger 150 μL de traitement AC + REV. Gardez la plaque dans l’incubateur dans les mêmes conditions que ci-dessus jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
   REMARQUE: Dans la plaque de 96 puits, évitez d’utiliser la première ligne et la première colonne car l’ombre de la bordure interfère avec la qualité des images.
3. Pour commencer la maturation méiotique, retirez la milrinone. Tout en observant les ovocytes sous un stéréomicroscope en utilisant un grossissement compris entre 30x-64x, laver la milrinone hors du milieu en transférant séquentiellement les ovocytes à travers six gouttes de 100 μL de milieux de culture sans milrinone contenant du DMSO et les placer dans le puits correspondant de la plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette manuelle ou buccale.
   1. Comptez les ovocytes en les ramassant à l’aide d’une pipette manuelle ou buccale et en les livrant à la goutte suivante pour éviter d’en perdre. Les ovocytes sont des cellules simples, grandes (~80 μm de diamètre) et rondes. Le noyau apparaîtra comme un bouton au centre de la cellule, et la membrane et la zone pellucide entourent l’ovocyte.
      REMARQUE: Transférer les ovocytes entre les gouttes tout en déplaçant le moins de liquide possible. Cela permet une élimination optimale de la milrinone des milieux de culture. Si les ovocytes ne parviennent pas à reprendre la méiose, il est probable que la milrinone n’a pas été éliminée efficacement.
4. Répéter le même processus (étape 2.3) pour le traitement AC et AC + REV.
5. Imagez les ovocytes à l’aide d’un microscope à fond clair équipé d’une chambre d’incubateur avec un environnement contrôlé dans ces conditions : 37 °C, 5% de CO₂ et 80% d’humidité. Prenez des images au plan médian des ovocytes à des intervalles de 20 minutes pendant 24 h.
6. Quantifier le nombre d’ovocytes qui extrudent un corps polaire (PB) en identifiant les cellules qui subissent une cytocinèse asymétrique. Le résultat sera une petite cellule (PB) à côté de l’œuf et dans la zone pellucide partagée. Visualisez les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie (ImageJ, voir Tableau des matériaux).
7. Importez la séquence d’images dans le logiciel d’analyse d’image et avancez les images jusqu’à ce qu’une ou plusieurs cellules subissent une cytocinèse asymétrique. Calculer le pourcentage d’ovocytes qui extrudent un PB du total des ovocytes¹⁷.

3. Surveillance du schéma de dégradation de Securin-gfp pendant la maturation méiotique

1. Centrifuger 3 μL d’ARNc Securin-Gfp (étape 1.2) à 19,283 x g pendant 30 min à 4 °C¹⁸.
   REMARQUE : Utilisez le surnageant pour éviter de charger des impuretés qui pourraient causer le blocage de l’aiguille pendant la micro-injection.
2. Suivre étape par étape la microinjection ovocytaire, décrite en détail dans la référence¹². Microinjecter des ovocytes arrêtés par la prophase I avec 100 ng/μL d’ARNc Securin-gfp préparé à l’étape 1.2.
3. Après micro-injection, laisser les ovocytes récupérer et traduire l’ARN dans l’incubateur de CO₂ pendant au moins 3 h. Vérifiez l’expression en observant les ovocytes dans un système automatisé d’imagerie par fluorescence multicanal (voir le tableau des matériaux) pour visualiser le signal GFP.
4. Tel que décrit à l’étape 2.2, charger 150 μL de milieux de culture avec ou sans 5 μM de nocodazole et 150 μL de milieu de culture avec 0,5 μM de réversine dans trois puits différents d’une plaque de 96 puits.
5. Lavez les ovocytes micro-injectés à travers six gouttes de milieu de culture sans milrinone et transférez 1/3 des ovocytes dans chaque traitement.
6. Conserver la plaque dans l’incubateur à 37 °C, avec 5% de CO₂ et 80% d’humidité jusqu’à ce que les ovocytes reprennent la méiose, environ 3 h après le lavage de la milrinone.
   REMARQUE: Utilisez un stéréomicroscope avec un grossissement compris entre 30x et 64x pour évaluer la dégradation de l’enveloppe nucléaire comme caractéristique de la reprise méiotique.
7. Enregistrer des images de la maturation ovocytaire à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une chambre d’incubateur comme décrit à l’étape 2.6. Utilisez les paramètres de fond clair pour trouver les ovocytes dans le puits. Utilisez un filtre 488 pour détecter le signal Securin-gfp et ajustez l’intensité de fluorescence pour éviter de surexposer les cellules.
   1. Si le système d’imagerie est automatisé, enregistrez les positions des ovocytes dans chaque puits. Étant donné que la sécurine-gfp est répartie uniformément dans le cytoplasme, capturez des images dans le plan médian des ovocytes à des intervalles de 20 minutes pendant 24 h. Pour capturer des groupes d’ovocytes dans une image, utilisez un objectif de grossissement inférieur tel que 10x.
8. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour quantifier la destruction de Securin-gfp. Ouvrez les images du canal GFP. Commencez au point temporel 1. Dans le logiciel d’analyse préféré, utilisez un outil de sélection ou de forme pour marquer chaque ovocyte et générer une région d’intérêt (ROI) pour chaque cellule.
   1. Utilisez le même retour sur investissement pour sélectionner une zone d’arrière-plan à soustraire ultérieurement. Mesurez l’intensité des pixels GFP dans chaque retour sur investissement.
9. À l’aide des ROI pour chaque ovocyte généré à l’étape 3.8, mesurez l’intensité de la GFP à tous les points temporels.
   REMARQUE: Dans certains logiciels, un onglet « Analyser » permet la sélection de la fonction Mesurer.
   1. Ensuite, passez à la période suivante et répétez ce processus pour mesurer l’intensité de la GFP dans chaque période. Enfin, à chaque valeur GFP, soustrayez la mesure du ROI dans l’arrière-plan sélectionné à l’étape 3.8. Cette analyse donnera une valeur pour l’intensité de Securin-gfp pour chaque ovocyte à chaque point temporel.
10. Extraire différents paramètres du modèle de destruction de Securin : (a) le moment où la dégradation de Securin-gfp a commencé. Cela indique quand le silence du SAC a commencé; b) l’heure du signal minimal Securin-gfp. Cela indique quand le silence SAC est tombé en dessous d’un seuil pour permettre une activation élevée de l’APC/C et une dégradation complète de la Securin-GFP ; c) le taux de destruction de Securin-GFP¹⁹. Cela indique à quelle vitesse l’activité du SAC tombe en dessous d’un seuil pour l’activation de l’APC/C et la dégradation de la Securine-GFP.

4. Recrutement de MAD2 au niveau des kinétochores par immunofluorescence au cours de la maturation méiotique

REMARQUE : Pour la collecte et la maturation des ovocytes, se reporter au rapport¹² publié précédemment.

1. Diviser les ovocytes en trois groupes. Transférer chaque groupe d’ovocytes dans des gouttes de 100 μL de milieux de culture sans milrinone. Couvrir les gouttes d’huile minérale et les placer dans l’incubateur (37 °C, 5% CO₂ et 80% d’humidité) pendant 3 h, 5 h et 7 h pour atteindre respectivement le stade précoce de prométaphase I, de prométaphase I tardive et de métaphase I.
   REMARQUE: Placez chaque point temporel dans un plat différent pour éviter de sortir le même plat de l’incubateur plusieurs fois, ce qui affecte le moment régulier de la maturation méiotique.
2. Aux points temporels assignés, fixez les ovocytes en les transférant dans des gouttes de 500 μL de PFA à 2% dans 1x tampon PHEM pendant 20 min à température ambiante, en utilisant un plat en verre à 9 puits comme décrit précédemment²⁰. Ensuite, transférer les cellules dans un puits propre contenant une goutte de 500 μL de solution de blocage (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN₃).
   NOTE: Composition PHEM: 60 mM PIPES; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; et 2 mM MgCl₂.
   REMARQUE: On peut s’arrêter à ce stade et stocker les ovocytes dans une solution de blocage dans la plaque à 9 puits à 4 ° C jusqu’au moment opportun pour compléter l’immunofluorescence.
3. Pour poursuivre la détection MAD2, transférer les ovocytes dans un puits propre contenant une goutte de 500 μL de solution de perméabilisation (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN₃). Incuber pendant 20 min à température ambiante, puis transférer les cellules dans un nouveau puits de solution bloquante et incuber pendant 10 min.
4. Pour le reste des étapes d’immunofluorescence, utilisez un couvercle à 96 puits avec des indentations comme décrit précédemment²⁰. Utilisez une chambre sombre humidifiée pour éviter l’exposition à la lumière et l’évaporation. Transférer les ovocytes dans une goutte de 30 μL de solution bloquante avec anticorps anti-MAD2 (1:1000, lapin) et anticorps anti-centromérique (ACA) (1:30, humain) (voir Tableau des matières) et incuber pendant 2 h à température ambiante.
   REMARQUE: Le couvercle à 96 puits permet le traitement de plusieurs protéines et groupes en même temps.
5. Pour laver l’excès d’anticorps primaires, transférer les cellules dans une goutte de 30 μL de 1x tampon PHEM supplémenté avec 0,5% de Triton et incuber pendant 10 minutes dans la chambre humidifiée. Répétez cette étape deux fois de plus.
6. Effectuer le quatrième lavage, en transférant les cellules dans une goutte de 30 μL de 1x tampon PHEM sans 0,5% 1x Triton, et incuber pendant 10 min.
7. Transférer les cellules dans une goutte de 30 μL de solution bloquante contenant des anticorps secondaires tels que l’anti-humain-633 (1:200) et l’anti-lapin-568 (1:200) (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h à température ambiante.
   REMARQUE: Choisissez la combinaison de fluorophores en fonction de vos lasers ou filtres de microscope.
8. Pour laver l’excès d’anticorps secondaires, répétez les étapes 4.5-4.6.
9. Pour monter les cellules sur la lame de microscope, transférez-les dans une goutte de 10 μL de support de montage contenant du DAPI (0,1 mg/mL) (voir le tableau des matériaux). Ajoutez de petits points de vaseline à chaque coin de la lame, placez-les soigneusement sur la goutte de support de montage et appuyez lentement pour distribuer. Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller le couvercle à la glissière. Pour une description plus détaillée du processus de montage, voir la référence²⁰.
10. Image des kinétochores à l’aide d’un microscope confocal (voir Tableau des matériaux) équipé d’un objectif 40x ou 63x. À l’aide du signal ACA, déterminez la plage z qui permet l’imagerie de toute la zone chromosomique.
    REMARQUE: Un zoom optique de 4,0 et une taille z-step de 0,5 μm peuvent être utilisés sur certains systèmes d’imagerie. Ces paramètres peuvent varier d’un système à l’autre, et une optimisation sera nécessaire.
11. Analysez l’intensité MAD2 à kinétochores à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Faites une projection maximale z-stack, puis divisez les canaux.
12. Tout d’abord, créez un masque en utilisant le canal ACA en sélectionnant le canal ACA pour établir un seuil qui identifie tous les signaux kinétochore . Accédez à l’onglet Modifier et créez une sélection. Ensuite, créez un retour sur investissement avec cette sélection.
13. Sélectionnez le canal MAD2 et importez la sélection créée à l’étape 4.12. Sélectionnez une méthode de seuil qui s’adapte mieux au signal MAD2. Mesurez l’intensité.
    REMARQUE: Sélectionnez la méthode de seuil dans le traitement de contrôle et maintenez-la constante lors de l’analyse de différents traitements.
14. Pour calculer l’intensité relative des pixels, divisez l’intensité de chaque cellule par l’intensité moyenne des ovocytes WT dans l’expérience.

Résultats

Évaluation de la réactivité au SAC par le traitement au nocodazole
Le but de cette expérience est d’évaluer l’activation et la force de SAC. En utilisant le nocodazole pour dépolymériser les microtubules fuseau, tous les kinétochores seront détachés, ce qui provoquera un arrêt du cycle cellulaire médié par le SAC. Dans le système d’imagerie actuel, les ovocytes témoins traités par DMSO extrudaient un corps polaire environ 14 heures après la libération de la milrinone (

Discussion

Le point de contrôle de l’assemblage de la broche est un mécanisme de contrôle critique pendant la division cellulaire conçu pour prévenir les erreurs de ségrégation chromosomique. Cela permet à la cellule d’avoir suffisamment de temps pour corriger les attachements KT-MT inappropriés. La méiose dans les ovocytes est un processus sujet aux erreurs, où la plupart des erreurs de ségrégation chromosomiques se produisent pendant la méiose I, conduisant à la génération d’ovules aneuploïdes qui sont la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)	Sigma	D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Human anti-ACA	Antibodies Incorporated	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective	Leica
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazole	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti- MAD2	Biolegend	924601	Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector laboratories	H-1000