Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Riepilogo

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Abstract

L'aneuploidia è la principale anomalia genetica che causa l'aborto spontaneo precoce e il fallimento della gravidanza negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica che danno origine all'aneuploidia si verificano durante la meiosi negli ovociti, ma il motivo per cui la meiosi degli ovociti è soggetta a errori non è ancora completamente compreso. Durante la divisione cellulare, le cellule prevengono gli errori nella segregazione cromosomica attivando il punto di controllo dell'assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo di controllo si basa sul rilevamento degli attacchi cinetocomeri-microtubuli (MT) e sul rilevamento della tensione generata dalle fibre del mandrino. Quando i KT non sono attaccati, il SAC viene attivato e impedisce la progressione del ciclo cellulare. Il SAC viene attivato prima dalla chinasi MPS1, che innesca il reclutamento e la formazione del complesso del checkpoint mitotico (MCC), composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Quindi, l'MCC si diffonde nel citoplasma e sequestra CDC20, un attivatore del complesso/ciclosoma che promuove l'anafase (APC/C). Una volta che i KT si attaccano ai microtubuli e i cromosomi sono allineati alla piastra di metafase, il SAC viene silenziato, CDC20 viene rilasciato e l'APC / C viene attivato, innescando la degradazione di ciclina B e Securin, consentendo così l'insorgenza dell'anafase. Rispetto alle cellule somatiche, il SAC negli ovociti non è altrettanto efficace perché le cellule possono subire anafase nonostante abbiano KT non attaccati. Capire perché il SAC è più permissivo e se questa permissività è una delle cause degli errori di segregazione cromosomica negli ovociti richiede ancora ulteriori indagini. Il presente protocollo descrive le tre tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC negli ovociti di topo. Queste tecniche includono l'uso del nocodazolo per depolimerizzare MT per valutare la risposta SAC, il monitoraggio del silenziamento del SAC seguendo la cinetica della distruzione della Securin e la valutazione del reclutamento di MAD2 in KT mediante immunofluorescenza. Insieme, queste tecniche sondano i meccanismi necessari per produrre uova sane fornendo una valutazione completa dell'integrità del SAC.

Introduzione

L'aneuploidia, che deriva da errori nella segregazione cromosomica, è la principale causa di aborti precoci ed è altamente legata agli errori nella meiosi¹. La meiosi si distingue dalla mitosi perché consiste in due cicli di divisione cellulare senza una fase di replicazione del DNA intermedia. Nella meiosi I, i cromosomi omologhi si separano mentre i cromatidi fratelli rimangono insieme. Negli ovociti, questo passaggio è soggetto a errori, portando alla produzione di uova aneuploidi².

Per prevenire errori di segregazione cromosomica, la maggior parte dei tipi di cellule attiva un meccanismo di sorveglianza che mette in pausa il ciclo cellulare, chiamato checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo rileva gli attaccamenti cinetocomeri-microtubuli (MT) e la tensione viene generata quando i cromosomi sono orientati in modo bipolare³. I cinetocori non collegati innescano una risposta SAC che inizia con il reclutamento di MPS1, il regolatore principale del SAC, ai cinetocori ^3,4. MPS1 avvia il reclutamento di altri componenti SAC, fungendo da piattaforma per formare il complesso del checkpoint mitotico (MCC). L'MCC, composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1, si diffonde nel citoplasma e inibisce l'attivazione di APC/C sequestrando il suo attivatore CDC20. Una volta che tutti i cinetocori sono stabilmente attaccati alle MT e i cromosomi sono allineati alla piastra metafase, il SAC viene silenziato e l'MCC si smonta e rilascia CDC20, consentendo così l'attivazione APC / C. L'APC/C attivo degrada Securin e Cyclin B, due passaggi chiave per innescare l'insorgenza dell'anafase ^5,6. Nelle cellule somatiche, il SAC è rigoroso perché è attivato da un singolo cinetocore non attaccato ed è sufficiente per indurre l'arresto del ciclo cellulare⁶. Tuttavia, durante la meiosi ovocitaria, il SAC è più permissivo e gli ovociti possono entrare in anafase I con uno o più cinetocori non attaccati 6,7,8,9,10. Capire perché il SAC è più permissivo negli ovociti è un'area di interesse costante nel campo. I meccanismi che causano difetti nell'attivazione del SAC o nel silenziamento del SAC potrebbero portare a errori nella segregazione cromosomica o all'arresto prolungato del ciclo cellulare e alla morte cellulare. Pertanto, valutare i meccanismi che mantengono l'integrità del SAC negli ovociti è importante per comprendere il processo di formazione di uova sane ed euploidi.

Questo protocollo descrive le tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC nella meiosi degli ovociti di topo esaminando diversi passaggi critici del checkpoint. In primo luogo, viene descritta la valutazione della risposta SAC dopo aver indotto l'attivazione del SAC. Questa attivazione si ottiene generando cinetocori non attaccati utilizzando nocodazolo, un farmaco che depolimerizza MTs¹¹. In secondo luogo, un metodo per monitorare il silenziamento del SAC è descritto monitorando la dinamica della degradazione della Securin durante la maturazione degli ovociti. Infine, un saggio basato sull'immunofluorescenza viene impiegato per misurare il reclutamento di MAD2, uno dei componenti MCC, nei cinetori. Insieme, questi test valutano in modo completo l'integrità del SAC durante la maturazione meiotica degli ovociti.

Protocollo

Tutti i topi utilizzati in questi protocolli sono stati ospitati e allevati secondo il Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali della Rutgers University (protocollo 201702497) e le linee guida del National Institutes of Health. Questi organismi di regolamentazione hanno approvato tutte le procedure sperimentali che coinvolgono studi sugli animali. Tutti i topi utilizzati nel presente studio erano femmine CF-1 di 6-8 settimane.

1. Preparazione sperimentale

1. Prima di iniziare le valutazioni SAC, raccogliere ovociti di topo seguendo il rapporto¹² precedentemente pubblicato. Dividere gli ovociti raccolti in tre gruppi di dimensioni uniformi e tenerli in terreni di coltura Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) contenenti 2,5 μM di milrinone (vedi Tabella dei materiali) per evitare la ripresa meiotica¹³.
   NOTA: Composizione CZB: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH₂PO₄; 1,2 mM MgSO 4-7H ₂O; 0,27 mM di piruvato; 1,7 mM CaCl₂; 30,8 mM di acido DL-lattico; 7 mM di taurina; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO₃; Gentamicina; e lo 0,3% BSA.
2. Preparare il cRNA per la microiniezione come descritto in precedenza^12,14. Amplificare il gene Securin di topo dal cDNA clonato da ovociti di vescicole germinali di topo, seguito da subclonazione nel vettore pMDL2 contenente la sequenza Gfp^15,16.
   1. Per preparare Securin-Gfp cRNA, linearizzare il plasmide con digestione Nde I. Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando la T3 RNA polimerasi e purificando il cRNA¹⁶.
      NOTA: Conservare il cRNA in aliquote di 2-3 μL a -80 °C fino all'uso.

2. Trattamento con nocodazolo e imaging dal vivo

1. Preparare 1 mL di terreno di coltura (CZB) contenente 5 μM di nocodazolo (NOC), 1 mL di terreno di coltura con 5 μM di NOC più 0,5 μM di reversina (NOC + REV) e 1 mL di terreno di coltura con dimetilsolfossido (DMSO) (1:2000) come controllo (vedere Tabella dei materiali).
2. Per la maturazione degli ovociti e l'imaging dal vivo, utilizzare una piastra da 96 pozzetti preriscaldata nell'incubatore a 37 ° C, 5% di CO₂ e 80% di umidità. Nel primo pozzetto, caricare 150 μL del trattamento DMSO di controllo; nel secondo pozzetto, caricare 150 μL di trattamento NOC; e nel terzo pozzetto, caricare 150 μL di trattamento NOC + REV. Tenere la piastra nell'incubatore nelle stesse condizioni di cui sopra fino al momento del bisogno.
   NOTA: nella piastra a 96 pozzetti, evitare di utilizzare la prima riga e la prima colonna perché l'ombra del bordo interferisce con la qualità delle immagini.
3. Per iniziare la maturazione meiotica, rimuovere milrinone. Durante la visualizzazione degli ovociti sotto uno stereomicroscopio utilizzando un ingrandimento tra 30x-64x, lavare il milrinone dal terreno trasferendo sequenzialmente gli ovociti attraverso sei gocce di 100 μL di terreni di coltura privi di milrinone contenenti DMSO e posizionarli nel pozzetto corrispondente della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta azionata a mano o a bocca.
   1. Contare gli ovociti raccogliendoli con una pipetta azionata a mano o a bocca e consegnandoli alla goccia successiva per evitare di perderli. Gli ovociti sono cellule singole, grandi (~ 80 μm di diametro) e rotonde. Il nucleo apparirà come un pulsante al centro della cellula, e la membrana e la zona pellucida circondano l'ovocita.
      NOTA: Trasferire gli ovociti tra le gocce spostando la minor quantità possibile di liquido. Ciò consente una rimozione ottimale del milrinone dai terreni di coltura. Se gli ovociti non riescono a riprendere la meiosi, è probabile che il milrinone non sia stato rimosso efficacemente.
4. Ripetere lo stesso processo (fase 2.3) per il trattamento NOC e NOC + REV.
5. Visualizzare gli ovociti utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di una camera di incubazione con un ambiente controllato in queste condizioni: 37 °C, 5% CO₂ e 80% di umidità. Cattura immagini sul piano intermedio degli ovociti ad intervalli di 20 minuti per 24 ore.
6. Quantificare il numero di ovociti che estrudono un corpo polare (PB) identificando le cellule che attraversano la citochinesi asimmetrica. Il risultato sarà una piccola cellula (PB) accanto all'uovo e all'interno della zona pellucida condivisa. Visualizzare le immagini utilizzando un software di imaging (ImageJ, vedere Tabella dei materiali).
7. Importare la sequenza di immagini nel software di analisi delle immagini e far avanzare i fotogrammi fino a quando una o più cellule passano attraverso la citochinesi asimmetrica. Calcola la percentuale di ovociti che estrudono un PB sul totale degli ovociti¹⁷.

3. Monitoraggio del pattern di degradazione di Securin-gfp durante la maturazione meiotica

1. Centrifugare 3 μL di cRNA Securin-Gfp (fase 1.2) a 19.283 x g per 30 minuti a 4 °C¹⁸.
   NOTA: Utilizzare il surnatante per evitare di caricare impurità che potrebbero causare il blocco dell'ago durante la microiniezione.
2. Seguire passo dopo passo la microiniezione di ovociti, ampiamente descritta nel riferimento¹². Microiniettare ovociti arrestati in profase I con 100 ng/μL di cRNA Securin-gfp preparati nella fase 1.2.
3. Dopo la microiniezione, lasciare che gli ovociti recuperino e traducano l'RNA nell'incubatore di CO₂ per almeno 3 ore. Controllare l'espressione osservando gli ovociti in un sistema automatizzato di imaging a fluorescenza multicanale (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare il segnale GFP.
4. Come descritto al punto 2.2, caricare 150 μL di terreno di coltura con o senza 5 μM di nocodazolo e 150 μL di terreno di coltura con 0,5 μM di reversine in tre diversi pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
5. Lavare gli ovociti microiniettati attraverso sei gocce di terreno di coltura privo di milrinone e trasferire 1/3 degli ovociti in ciascun trattamento.
6. Tenere la piastra nell'incubatrice a 37 °C, con il 5% di CO₂ e l'80% di umidità fino a quando gli ovociti non riprendono la meiosi, circa 3 ore dopo il lavaggio con milrinone.
   NOTA: Utilizzare uno stereomicroscopio con ingrandimento compreso tra 30x-64x per valutare la rottura dell'involucro nucleare come segno distintivo della ripresa meiotica.
7. Registrare le immagini della maturazione degli ovociti utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una camera di incubazione come descritto al punto 2.6. Utilizzare le impostazioni del campo luminoso per trovare gli ovociti nel pozzetto. Utilizzare un filtro 488 per rilevare il segnale Securin-gfp e regolare l'intensità della fluorescenza per evitare la sovraesposizione delle cellule.
   1. Se il sistema di imaging è automatizzato, salvare le posizioni degli ovociti in ciascun pozzetto. Poiché Securin-gfp è uniformemente distribuito nel citoplasma, catturare immagini nel piano intermedio degli ovociti ad intervalli di 20 minuti per 24 ore. Per catturare gruppi di ovociti in un'immagine, utilizzare un obiettivo a ingrandimento inferiore, ad esempio 10x.
8. Utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare la distruzione di Securin-gfp. Aprire le immagini del canale GFP. Inizia dal punto temporale 1. Nel software di analisi preferito, utilizzare uno strumento di selezione o forma per contrassegnare ciascun ovocita e generare una regione di interesse (ROI) per ogni cellula.
   1. Utilizza lo stesso ROI per selezionare un'area di sfondo da sottrarre in seguito. Misura l'intensità dei pixel GFP in ogni ROI.
9. Utilizzando i ROI per ogni ovocita generato nella fase 3.8, misurare l'intensità della GFP in tutti i punti temporali.
   NOTA: In alcuni programmi software, una scheda "Analizza" consente la selezione della funzione Misura.
   1. Quindi, passare al periodo successivo e ripetere questo processo per misurare l'intensità della GFP in ciascun intervallo di tempo. Infine, a ciascun valore GFP, sottrarre la misurazione del ROI sullo sfondo selezionato nel passaggio 3.8. Questa analisi darà un valore per l'intensità di Securin-gfp per ciascun ovocita in ogni punto temporale.
10. Estrarre diversi parametri dal modello di distruzione di Securin: (a) il momento in cui è iniziata la degradazione di Securin-gfp. Questo dice quando è iniziato il silenziamento SAC; b) il tempo del segnale minimo Securin-gfp. Questo indica quando il silenziamento SAC è sceso al di sotto di un livello di soglia per consentire un'elevata attivazione APC/C e la completa degradazione della Securin-GFP; c) il tasso di distruzione di Securin-GFP¹⁹. Questo indica quanto rapidamente l'attività SAC scende al di sotto di un livello di soglia per l'attivazione APC/C e la degradazione di Securin-GFP.

4. Reclutamento di MAD2 a cinetocori mediante immunofluorescenza durante la maturazione meiotica

NOTA: Per la raccolta e la maturazione degli ovociti, fare riferimento al rapporto¹² pubblicato in precedenza.

1. Dividere gli ovociti in tre gruppi. Trasferire ogni gruppo di ovociti in 100 μL di gocce di terreno di coltura privo di milrinone. Coprire le gocce con olio minerale e metterle nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂ e 80% umidità) per 3 ore, 5 ore e 7 ore per raggiungere rispettivamente la prometafase I precoce, la prometafase I tardiva e la fase I della metafase I.
   NOTA: Posizionare ogni punto temporale in un piatto diverso per evitare di estrarre lo stesso piatto dall'incubatrice più volte, il che influisce sui tempi regolari di maturazione meiotica.
2. Nei punti temporali assegnati, fissare gli ovociti trasferendoli in gocce da 500 μL di PFA al 2% in 1x tampone PHEM per 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzando un piatto di vetro a 9 pozzetti come descritto in precedenza²⁰. Quindi, trasferire le cellule in un pozzetto pulito contenente una goccia di 500 μL di soluzione bloccante (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN₃).
   NOTA: Composizione PHEM: 60 mM TUBAZIONI; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; e 2 mM MgCl₂.
   NOTA: Ci si può fermare a questo punto e conservare gli ovociti in soluzione bloccante nella piastra a 9 pozzetti a 4 °C fino al momento opportuno per completare l'immunofluorescenza.
3. Per continuare la rilevazione di MAD2, trasferire gli ovociti in un pozzetto pulito contenente una goccia di 500 μL di soluzione di permeabilizzazione (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN₃). Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire le cellule in un nuovo pozzetto di soluzione bloccante e incubare per 10 minuti.
4. Per il resto delle fasi di immunofluorescenza, utilizzare un coperchio a 96 pozzetti con rientranze come descritto in precedenza²⁰. Utilizzare una camera buia umidificata per evitare l'esposizione alla luce e l'evaporazione. Trasferire gli ovociti in una goccia da 30 μL di soluzione bloccante con anticorpo anti-MAD2 (1:1000, coniglio) e anticorpo anti-centromerico (ACA) (1:30, umano) (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
   NOTA: Il coperchio del piatto a 96 pozzetti consente la lavorazione di diverse proteine e gruppi contemporaneamente.
5. Per lavare gli anticorpi primari in eccesso, trasferire le cellule a una goccia di 30 μL di tampone PHEM 1x integrato con Triton allo 0,5% e incubare per 10 minuti nella camera umidificata. Ripetere questo passaggio altre due volte.
6. Eseguire il quarto lavaggio, trasferendo le cellule su una goccia di 30 μL di tampone PHEM 1x senza 0,5% 1x Triton e incubare per 10 minuti.
7. Trasferire le cellule in una goccia da 30 μL di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari quali anti-umano-633 (1:200) e anti-coniglio-568 (1:200) (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   NOTA: Scegli la combinazione di fluorofori in base ai laser o ai filtri del tuo microscopio.
8. Per lavare gli anticorpi secondari in eccesso, ripetere i passaggi 4.5-4.6.
9. Per montare le cellule sul vetrino del microscopio, trasferire le cellule su una goccia di 10 μL di supporto di montaggio contenente DAPI (0,1 mg/ml) (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere piccoli punti di vaselina a ciascun angolo del vetrino, posizionarli con cura sopra la goccia del supporto di montaggio e premere lentamente per distribuire. Utilizzare uno smalto trasparente per sigillare la copertina sul vetrino. Per una descrizione più dettagliata del processo di montaggio, vedere il riferimento²⁰.
10. Cinetocori di immagini utilizzando un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo 40x o 63x. Utilizzando il segnale ACA, determinare la gamma z che consente l'imaging dell'intera area cromosomica.
    NOTA: su alcuni sistemi di imaging è possibile utilizzare uno zoom ottico di 4,0 e una dimensione z-step di 0,5 μm. Questi parametri possono variare da sistema a sistema e sarà necessaria un'ottimizzazione.
11. Analizza l'intensità MAD2 ai cinetocori utilizzando il software di analisi delle immagini. Effettuare una proiezione massima z-stack e quindi dividere i canali.
12. Innanzitutto, creare una maschera utilizzando il canale ACA selezionando il canale ACA per stabilire una soglia che identifichi tutti i segnali cinetocori. Vai alla scheda Modifica e crea una selezione. Quindi, crea un ROI con questa selezione.
13. Selezionare il canale MAD2 e inserire la selezione creata nel passaggio 4.12. Selezionare un metodo di soglia che si adatti meglio al segnale MAD2. Misura l'intensità.
    NOTA: Selezionare il metodo di soglia nel trattamento di controllo e mantenerlo costante quando si analizzano trattamenti diversi.
14. Per calcolare l'intensità relativa dei pixel, dividere l'intensità di ciascuna cellula per l'intensità media degli ovociti WT nell'esperimento.

Risultati

Valutazione della risposta al SAC mediante trattamento con nocodazolo
Lo scopo di questo esperimento è valutare l'attivazione e la forza del SAC. Utilizzando il nocodazolo per depolimerizzare i microtubuli del fuso, tutti i cinetocori saranno scollegati, il che causerà un arresto del ciclo cellulare mediato da SAC. Nell'attuale sistema di imaging, gli ovociti di controllo trattati con DMSO hanno estruso un corpo polare circa 14 ore dopo il rilascio dal milrinone (Figura 1

Discussione

Il checkpoint di assemblaggio del mandrino è un meccanismo di controllo critico durante la divisione cellulare progettato per prevenire errori di segregazione cromosomica. Consente alla cellula di avere abbastanza tempo per correggere gli attacchi KT-MT impropri. La meiosi negli ovociti è un processo soggetto a errori, in cui la maggior parte della mis-segregazione cromosomica si verifica durante la meiosi I, portando alla generazione di uova aneuploidi che sono la principale causa di aborti precoci e infertilità nell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)	Sigma	D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Human anti-ACA	Antibodies Incorporated	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective	Leica
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazole	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti- MAD2	Biolegend	924601	Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector laboratories	H-1000