تحليل تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف

Summary

يعد تدفق الكالسيوم ، وهو مقياس لإشارات الخلايا التائية ، طريقة فعالة لتحليل الاستجابات لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. يستفيد هذا البروتوكول لتعدد إرسال Indo-1 مع لوحات من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل.

Abstract

يعد تدفق الكالسيوم استجابة لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية مقياسا شائعا لإشارات الخلايا التائية. تم تطوير العديد من أصباغ مؤشر الكالسيوم لتقييم إشارات الكالسيوم عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. تم تصميم هذا البروتوكول لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. يتم تمييز الخلايا الطحالية الكلية بصبغة مؤشر الكالسيوم النسبي Indo-1 ، جنبا إلى جنب مع لوحة من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم لجزيئات سطح الخلية. توفر الاستفادة من قدرات قياس التدفق الخلوي كامل الطيف منصة لاستخدام مجموعة واسعة من بقع سطح الخلية بالاشتراك مع Indo-1. ثم يتم تحليل الخلايا في الوقت الفعلي عند 37 درجة مئوية قبل وبعد إضافة جسم مضاد ل CD3 لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. بعد فك خلط الإشارات الطيفية ، يتم حساب نسبة Indo-1 المرتبط بالكالسيوم إلى Indo-1 الخالي من الكالسيوم ويمكن تصوره بمرور الوقت لكل مجموعة مسورة من الخلايا الطحالية. يمكن أن تسمح هذه التقنية بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في مجموعات خلايا متعددة.

Introduction

يعد تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) مقياسا مفيدا لتنشيط الخلايا التائية وكثيرا ما يستخدم لتحديد ما إذا كانت مجموعة الخلايا التائية قد ضعفت الاستجابات في الخطوات القريبة من مسار إشارات TCR¹. يتم إجراء قياسات تدفق الكالسيوم بشكل عام عن طريق وضع العلامات المسبقة على الخلايا التائية بواحد أو زوج من أصباغ مؤشر الكالسيوم الفلورية ، ثم فحص إشارات الفلورسنت باستخدام قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي بعد ربط TCR^{المتقاطع 2}،^3،4. يتم إثارة Indo-1 ، صبغة الكالسيوم المترية النسبة ، بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع انبعاثات الذروة عند طولين موجيين مختلفين يعتمدان على ارتباط الكالسيوم⁵ ، وهو صبغة مؤشر شائعة الاستخدام لتحليل قياس التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية الحية. نظرا لأن ملف تعريف انبعاث Indo-1 واسع جدا ، فقد يكون من الصعب الجمع بين تقييم Indo-1 والتحليل المتزامن لعلامات سطح الخلية المتعددة عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. يقيد هذا القيد استخدام تحليل التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم لمجموعات الخلايا التائية المنقاة مسبقا أو المجموعات التي تحددها مجموعة محدودة من جزيئات سطح الخلية.

لمعالجة قيود قياس استجابات الكالسيوم على المجموعات غير المتجانسة من الخلايا الليمفاوية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي بتمرير النطاق ، تم تطوير بروتوكول لقياس مضان Indo-1 باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تسمح هذه الطريقة بتعدد إرسال Indo-1 بألواح من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية ، مع الاستفادة من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تتمثل ميزة استخدام قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف على قياس التدفق الخلوي التقليدي في قدرته على تمييز إشارات الفلورسنت عن الأصباغ شديدة التداخل ، وبالتالي زيادة عدد العلامات السطحية التي يمكن تقييمها في وقت واحد في كل عينة. يستخدم قياس التدفق الخلوي التقليدي مرشحات تمرير النطاق ويقتصر على فلوروكروم واحد لكل نظام كاشف⁶. يجمع قياس التدفق الخلوي كامل الطيف الإشارات عبر الطيف الكامل للفلوروكروم باستخدام 64 كاشفا على نظام قياس التدفق الخلوي بخمسة ليزر ^7,8. بالإضافة إلى ذلك ، يستفيد قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل من كاشفات APD (Avalanche Photo Diode) التي زادت من الحساسية بالنسبة لكاشفات أنبوب المضاعف الضوئي الموجودة في مقاييس التدفق الخلوي^{التقليدية 8}. وبالتالي ، فإن هذا النهج مثالي لمجموعات الخلايا غير المتجانسة ، مثل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية أو معلقات خلايا الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفئران ، لأنه يلغي الحاجة إلى عزل مجموعات معينة من الخلايا التائية قبل وضع علامات صبغة الكالسيوم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ملفات تعريف تعبير علامات سطح الخلية وبوابات قياس التدفق الخلوي بعد جمع البيانات لتقييم استجابات الكالسيوم في كل مجموعة من السكان موضع الاهتمام. كما هو موضح في هذا التقرير ، يمكن بسهولة دمج Indo-1 مع ثمانية أجسام مضادة مقترنة بالفلوروكروم ، مما ينتج عنه ما مجموعه 10 توقيعات طيفية فريدة. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على مخاليط الخلايا من خطوط الفئران المتميزة وراثيا ، مما يسمح بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في الخلايا التائية من النوع البري مقارنة بتلك الموجودة في خط الفئران المستهدف بالجينات.

Protocol

تم الحفاظ على الفئران في حرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي وفقا لبروتوكولات IACUC. تم القتل الرحيم لجميع الفئران وفقا لمعايير AAALAC.

1. تحضير الخلايا المناعية من طحال الفأر

ملاحظة: القتل الرحيم للفئران الساذجة بالقتل الرحيم_{CO 2} . يتم استخدام الفئران C57BL / 6 التي تم شراؤها من مختبرات جاكسون وتربيتها في المنزل للتجارب في عمر 6-12 أسبوعا. يتم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث للتجارب.

1. تطهير جلد الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول من أجل تقليل احتمالية دخول الملوثات الخارجية إلى العينة.
2. تشريح طحال الفأر باستخدام أدوات التشريح والمقص الجراحي والملقط. احصد الطحال وضع الطحال المنفصل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع ~ 5 مل من وسائط RPMI الكاملة (cRPMI) على الجليد.
   ملاحظة: يتكون RPMI الكامل من 10٪ FBS و 2 mM L-glutamine و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
   1. لحصاد طحال الفأر ، قم بعمل شق 5 سم في الفراء والجلد على طول الجانب الأيسر من الفأر في منتصف الطريق بين الساقين الأمامية والخلفية بالمقص. افتح تجويف الجسم ~ 5 سم وأزل الطحال باستخدام الملقط. الطحال هو لون حبة الكلى وهو أطول وأكثر تملقا من الكلى المجاورة.
3. صب محتويات الخطوة 1.2 على مرشح معقم 70 ميكرومتر متصل بأنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. افصل الطحال ميكانيكيا إلى معلق خلية واحدة عن طريق دفع الطحال عبر المرشح باستخدام مكبس حقنة سعة 5 مل حتى لا يبقى لب الطحال على سطح المرشح.
4. قم بحبيبات الخلايا الطحالية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار متأرجح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. صب بعناية طاف. تبقى الخلايا الطحالية الحبيبية في قاع الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
6. لإزالة خلايا الدم الحمراء ، أعد تعليق الخلايا الطحالية الحبيبية في 1 مل من محلول تحلل ACK لمدة 3 دقائق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تخلط جيدا.
7. قم بإخماد المخزن المؤقت لتحلل ACK ب 15 مل من cRPMI.
8. بيليه الخلايا الليمفاوية كما هو موضح في الخطوة 1.4.
9. أعد تعليق الخلية في 5 مل من cRPMI في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ضع العينات على الثلج.
   1. لحساب عدد الخلايا ، انقل 10 ميكرولتر من معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.6 مل وقم بتخفيفه بنسبة 1: 1 باستخدام محلول Trypan الأزرق. ثم ، نقل إلى مقياس الدم أو نظام عد الخلايا الآلي.
10. بعد العد ، اعتمادا على تركيز الخلية في تعليق الخلية كما في الخطوة 1.9 ، قم بتجميع الخلايا في جهاز طرد مركزي منضدية عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق للتحضير لإضافة وسائط cRMPI تحتوي على صبغة إستر Indo-1 AM.
11. احسب حجم إعادة تعليق الخلايا لتحقيق 10-12 × 10⁶ خلايا / مل. هذا هو تركيز 2x من إجمالي عدد الخلايا المطلوبة.
12. أعد تعليق الخلايا في حجم cRPMI المحسوب في الخطوة 1.11. ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ إما في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع تنفيس الغطاء أو لوحة زراعة الأنسجة.

2. صبغة Indo-1 النسبية ووسم الأجسام المضادة الفلورية

1. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، أضف 50 ميكرولتر من DMSO في قنينة تحتوي على 50 ميكروغرام من Indo-1 AM. تركيز محلول المخزون هو 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
   ملاحظة: يتم توفير DMSO في قوارير صغيرة مع المجموعة لمنع أي أكسدة DMSO.
2. قم بتخفيف حصصة المخزون (1 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى الحجم التجريبي المناسب (المحدد في 1.11) من cRPMI بتركيز 6 ميكروغرام / مل ، بتركيز 2x. لا تقم بتخزين Indo-1 في محلول مائي.
   ملاحظة: يمكن استخدام مخازن أخرى مع الكالسيوم المضاف حسب احتياجات الخلية.
3. ضع الوسائط الكاملة مع Indo-1 جانبا في حمام مائي على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: استخدم الحد الأدنى من تركيز إستر Indo-1 AM اللازم للحصول على إشارة كافية. يجب معايرة هذا لأنواع الخلايا المختلفة. عادة ما يكون التركيز بين 3-5 ميكرومتر كافيا. بالنسبة للخلايا التائية الأولية ، فإن تحميل الخلايا مع Indo-1 بتركيز >5 ميكروغرام / مل يزيد من متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) فوق سجل 6 على مقاييس التدفق الخلوي الطيفي. في حالة حدوث ذلك ، قم بتقليل شدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية وقم بمعايرة Indo-1 إلى تركيز أقل.
4. قم بتخفيف تعليق الخلية المعد مسبقا (في الخطوة 1.12) ، 1: 1 في cRPMI ، بما في ذلك وسائط Indo-1 2x المصنوعة في الخطوة 2.2. تأكد من أن الخلايا بتركيز يتراوح بين 5-6 × 10⁶ / مل.
   ملاحظة: لا تقم بصبغ الحمل غير الملوث للتحكم في البقع المفردة أو عناصر التحكم في خلية بقعة واحدة لعلامة السطح باستخدام Indo-1. ستؤدي إضافة Indo-1 إلى عناصر التحكم في الأجسام المضادة أحادية الصبغة إلى إنشاء عينة متعددة الألوان بسبب إضافة Indo-1 إلى الخلايا الملطخة المفردة. تضمين indo-1 (خالي من الكالسيوم) EGTA إضافة تحكم إلى لوحة العينة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.6.
5. أضف 1 مل من الخلايا / البئر / الحالة التجريبية إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا.
6. قم بإنشاء عنصر تحكم ملطخ واحد لعينة Indo-1 (الخالية من الكالسيوم) باستخدام خلايا Indo-1 المحملة مسبقا بالصبغة وإضافة EGTA إلى تركيز نهائي يبلغ 2 mM. سيقوم EGTA بتخليب الكالسيوم في تعليق الخلية ، مما يعطي عينة تحكم أنظف.
   1. قم بإنشاء عنصر تحكم إيجابي Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم Indo-1) عن طريق إضافة 50 ميكرومتر من الأيونوميسين إلى تعليق الخلية المحمل بالصبغة عند مقياس التدفق الخلوي. الأيونوميسين هو أيونوفور الكالسيوم المنفذ للغشاء الذي يربط أيونات الكالسيوم ويسهل نقل أيونات الكالسيوم إلى الخلايا.
7. قم بإنشاء بئر للتحكم السلبي البيولوجي بدون فلوروفورات أو صبغة Indo-1.
8. قم بإنشاء بئر للتحكم في البقع المفردة لأي مجموعات خلايا إضافية ذات أهمية (الأجسام المضادة المحددة من قبل المستخدم) باستخدام الفلوروفورات المترافقة للأجسام المضادة في تصميم لوحة قياس التدفق الخلوي. لن تشمل هذه صبغة Indo-1 النسبية.
9. أضف الجسم المضاد الذي يحجب مستقبلات Fc (~ 2 ميكروغرام / 1 × 10⁶ خلايا) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قبل إضافة أجسام مضادة إضافية مقترنة بالفلوروكروم لتلطيخ السطح.
10. احتضان الطبق لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO_2.
11. أعد تعليق الخلايا في لوحة ذات 12 بئرا عن طريق النقر برفق على اللوحة كل 15 دقيقة.
12. قم بخلط وإزالة الحجم الكامل للخلايا المعلقة في الوسائط من لوحة 12 بئرا. ثم أضف تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل.
13. بيليه الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب المادة الطافية واغسل الخلايا بإضافة 1 مل من cRPMI المسخن مسبقا. بيليه مرة أخرى وصب طاف.
    ملاحظة: غسل الخلايا يزيل أي أجسام مضادة متبقية تمنع FC.
14. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من cRPMI في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل واحتضان كل أنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية عند 5٪ CO₂ ، مع ترك الجزء العلوي من الأنبوب مفتوحا قليلا للسماح بتبادل الغازات. هذا يسمح بإزالة الأسترة الكاملة من استرات AM داخل الخلايا.
15. انقل الخلايا مرة أخرى إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا ، إذا لزم الأمر. يمكن إضافة أجسام مضادة فلوروكرومية مترافقة معايرة إضافية يحددها المستخدم في مرحلة الراحة.
    ملاحظة: تتضمن العلامات المستخدمة في لوحة الأساليب: Ghost 540 و CD4 و CD8 و TCRβ و TCRγδ و CD25 و CD1d / α-galcer tetramer. يتم اختيار العلامات لتحليل المجموعات الفرعية للخلايا التائية.
    1. قم بإنشاء مزيج رئيسي من جميع الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم المعرفة من قبل المستخدم وفقا لأنواع الخلايا ذات الأهمية بحجم معاير مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل.
    2. أضف مزيجا رئيسيا محسوبا ل 1 مل من حجم الخلية ، يعتمد على الأجسام المضادة المعايرة للخلايا المستريحة.
       ملاحظة: ميزة التلوين في الخطوة 2.15 بدلا من الخطوة اللاحقة 2.18 هي أن التلوين في الخطوة 2.15 سيقلل من وقت الحضانة الإجمالي للتجربة. ومع ذلك ، فإن التلوين بحجم إجمالي قدره 1 مل في الخطوة 2.15 يزيد من استخدام الأجسام المضادة.
16. بعد الراحة ، قم بتجميع الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن تكوير الخلايا الموجودة في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا في اللوحة باستخدام ملحق جهاز طرد مركزي للوحة. خلاف ذلك ، بيليه الخلايا في أنبوب طرد مركزي صغير 1.7 مل.
17. اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات في 1 مل من 4 درجات مئوية cRPMI بارد وحبيبات الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 2.16. ضع الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: إذا كانت خلايا تلطيخ السطح منفصلة ، بعد إزالة الأسترة في الخطوة 2.18 ، هناك حاجة إلى حجم أقل من الأجسام المضادة. يمكن إجراء تلطيخ السطح في هذه الخطوة بعد مرحلة الراحة في محلول التدفق البارد (1x DPBS مع إضافة 1٪ FBS) ، باستخدام الأجسام المضادة المعرفة من قبل المستخدم ، على الجليد لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا بعد البقعة في cRPMI كما في الخطوة 2.17.
    1. أضف بقعة الجدوى Ghost540 المخففة 1: 7,500 في DPBS إلى العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تقتل الحرارة الخلايا عند 55 درجة مئوية على كتلة تدفئة للتحكم في الأحياء / الموتى الملطخين.
       ملاحظة: يتم إجراء تلطيخ الصبغة الوظيفية للقضاء على الخلايا الميتة في تحليل قياس التدفق الخلوي بدون FBS. يمكن ل FBS التفاعل مع أصباغ الأمين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
18. أعد تعليق العينات الفردية في 500 ميكرولتر من cRPMI (خال من الفينول الأحمر) باستخدام أنبوب تدفق البوليسترين سعة 5 مل مع غطاء.
    ملاحظة: يمكن ترك الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ساعة.
19. قم بتسخين كل أنبوب سعة 5 مل يحتوي على خلايا ، بشكل فردي ، إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام خرز لمدة 7 دقائق قبل التحليل على مقياس التدفق الخلوي مع الحفاظ على اتساق الوقت بين العينات. استخدم مؤقتا.

3. أنبوب حمام الخرزة: الحفاظ على درجة الحرارة أثناء تحليل تدفق الكالسيوم

1. أضف حبات الحمام إلى حمام مائي صغير ، بدون إضافة ماء ؛ الاحماء حتى 37 درجة مئوية.
2. قطع بعناية أنبوب مخروطي 50 مل إلى النصف ، عند علامة 25 مل ، بشفرة حلاقة ؛ تخلص من الجزء العلوي من الأنبوب.
3. املأ الأنبوب النصفي 3/4 من الطريق بخرز الحمام.
4. ضع الأنبوب الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.2 في حمام الخرزة الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1. أحضر الأنبوب والخرز إلى 37 درجة مئوية.
5. قم بتوصيل حمام الخرزة بمأخذ كهربائي بجوار مقياس التدفق الخلوي من أجل الحفاظ على درجة الحرارة استعدادا لتحليل العينة.
6. أضف رف الستايروفوم المخروطي سعة 50 مل لتثبيت أنبوب واحد لوضع الأنبوب في مكانه أثناء تشغيله على مقياس التدفق الخلوي. سيؤدي ذلك إلى التخلص من الحاجة إلى تثبيت الأنبوب يدويا طوال مدة تحليل المنحنى.

4. اكتساب تدفق الكالسيوم باستخدام تحليل التدفق الخلوي

1. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج مقياس التدفق الخلوي على محلل التدفق.
2. انقر فوق علامة التبويب المكتبة لإضافة علامات الفلورسنت Indo-1 (المرتبطة بالكالسيوم) و Indo-1 (الخالية من الكالسيوم). حدد علامات الفلورسنت في قائمة البرامج على اليسار. حدد ليزر الأشعة فوق البنفسجية ضمن مجموعات علامات الفلورسنت وانقر فوق + إضافة لإضافة اسم علامة فلورسنت (Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) / Indo-1 (خال من الكالسيوم)) إلى المكتبة. اختر الطول الموجي لإثارة الليزر والطول الموجي للانبعاث ، ثم انقر فوق حفظ. تابع إلى الإعداد التجريبي.
   ملاحظة: يتم إثارة Indo-1 بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 355 نانومتر. الطول الموجي للانبعاث من Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) هو 372 نانومتر. الطول الموجي للانبعاث من Indo-1 (خال من الكالسيوم) هو 514 نانومتر.
3. انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ. افتح / أنشئ تجربة جديدة وأضف علامات الفلورسنت المطلوبة إلى التجربة.
4. إنشاء مجموعة مرجعية ومجموعة / مجموعات عينات جديدة للتجربة. قم بتسمية كل من العينات والمجموعات المرجعية حسب الضرورة.
5. ضمن علامة التبويب عمليات الاستحواذ ، قم بتعيين الأحداث المراد تسجيلها إلى الحد الأقصى: 10,000,000.
6. اضبط مستوى صوت الإيقاف على الحد الأقصى لمستوى الصوت: 3000 ميكرولتر.
7. اضبط وقت التوقف على أقصى وقت: 36000 ثانية.
8. احصل على عناصر تحكم مفردة ملونة للأجسام المضادة المترافقة المحددة المضمنة في اللوحة متعددة الألوان.
9. احصل على عناصر تحكم مفردة ملطخة للصبغة الوظيفية Indo-1.
   1. أضف 50 ميكرومتر من الأيونوميسين إلى التحكم الإيجابي Indo-1 المرتبط بالكالسيوم. دوامة لخلط. أضف أنبوب التدفق إلى منفذ حقن العينة وانقر فوق تسجيل.
   2. أضف التحكم السلبي Indo-1 الخالي من الكالسيوم إلى مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق تسجيل. تمت إضافة EGTA في الخطوة 2.6.
   3. قم بإلغاء خلط عناصر التحكم الملطخة الفردية بالنقر فوق الزر Unmix .
      ملاحظة: يجب تسجيل جميع عناصر التحكم الملطخة الفردية من جميع الأجسام المضادة المترافقة والأصباغ الوظيفية قبل فك خلط العينات. لكي يعمل زر Unmix ، يجب تسجيل جميع عناصر التحكم المرجعية أولا. يمكن إجراء فك الخلط قبل أو بعد جمع العينات.
10. بمجرد اكتمال إلغاء الخلط ، قم بإنشاء مخططات متسلسلة باستخدام ورقة العمل غير المختلطة. SSC-A مقابل FSC-A لإزالة الحطام من العينة ، SSC-A مقابل SSC-H لإزالة المزدوجات. ويتبع ذلك بوابة تنظيف قابلة للتطبيق إلى جانب المزيد من البوابات على السكان المعنيين. لإنشاء بوابات ، انقر فوق مؤامرة. أضف قطعة أرض إلى ورقة العمل ، وانقر نقرا مزدوجا داخل البوابة لإنشاء مجموعة سكانية مسورة في اتجاه مجرى النهر. استمر حتى يتم حساب جميع السكان المعنيين.
11. عينات التحكم المفردة الدافئة (من الخطوات 2.6-2.9 في قسم الصبغة النسبية الهندية -1 ووسم الأجسام المضادة الفلورية) إلى 37 درجة مئوية للتحليل المتسلسل. قم بإعداد برنامج قياس التدفق الخلوي.
12. قم بتشغيل ماء DI على مقياس الخلايا لمدة 2-3 دقائق لضمان الاستقرار السائل لمقياس التدفق الخلوي.
13. قم بإعداد مخططات متسلسلة على ورقة العمل غير المختلطة عن طريق إنشاء بوابات باستخدام أزرار البوابة المضلع أو المستطيل أو القطع الناقص. بوابة لتشمل السكان محل الاهتمام (أي الخلايا الليمفاوية باستخدام SSC-A مقابل FSC-A [تمييز الحجم / الخلايا الليمفاوية]). تظهر المجموعات السكانية السلبية متجمعة حول الصفر بينما يمكن تصور السكان الإيجابيين عن طريق زيادة MFI. سيتم تعريف السكان محل الاهتمام من قبل المستخدم بناء على السؤال البيولوجي.
14. انقر نقرا مزدوجا داخل البوابة التي تم إنشاؤها وقم بتغيير معلمات المحور Y والمحور X إلى SSC-A مقابل SSC-H (التمييز الفردي). أكمل تحديد معلمات المحور عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على الكلمات الموجودة على المحور.
15. قم بإنشاء مخطط باستخدام إشارة صبغة SSC-A مقابل الجدوى (معلمات بوابة الصلاحية). بوابة على الخلايا الحية ، والتي هي سلبية لتلطيخ صبغة أمين. الخلايا الحية ، السلبية للتلطيخ الميت الحي ، سوف تتجمع عند علامة 0 على كل من المحورين Y و X.
16. انقر نقرا مزدوجا فوق المؤامرة الداخلية لإنشاء مؤامرة جديدة تحتوي على خلايا ليمفاوية حية أحادية الخلية فقط. قم بتغيير المحور Y إلى Indo-1 (الكالسيوم المقيد) (V1) و / أو Indo-1 (الكالسيوم الحر) (V7) مقابل الوقت على المحور X لتصور تدفق الكالسيوم.
17. ضع العينة البيولوجية الدافئة على الجهاز SIT وقم بتشغيل العينات في 2,500-3,000 حدث / ثانية على الوسط للسماح بتصور تدفق الكالسيوم في مجموعات محدودة من الخلايا (على سبيل المثال ، iNKT).
    ملاحظة: من خلال تعليق الخلايا بتركيز 1 × 10⁶ / مل ، يجب أن تساوي أحداث الخلية التي تم جمعها بمعدل تدفق متوسط 2500-3000 حدث / ثانية. قم بخفض معدل التدفق تحت التحكم في الاستحواذ بالنقر فوق القائمة المنسدلة أو قم بتخفيف العينة إذا كان تعليق الخلية يحتوي على تركيز متزايد. يمكن أن يؤدي تشغيل العينات بمعدل تدفق مرتفع إلى زيادة انتشار الإشارة من فلوروفور إلى فلوروفورات أخرى في اللوحة.
18. أضف الأنبوب التالي إلى حمام الخرزة للتدفئة إلى 37 درجة مئوية.
19. في التحكم في الاستحواذ ، اضغط على Record لتسجيل البيانات الأولية لمدة 30 ثانية للحصول على مستوى أساسي من إشارات الكالسيوم في العينة.
20. في التحكم في الاستحواذ ، انقر فوق إيقاف وإزالة الأنبوب من منفذ حقن العينة (SIP).
21. أضف 30 ميكروغرام من مضاد CD3 غير المقترن مباشرة إلى أنبوب العينة لبدء تدفق الكالسيوم. التركيز النهائي لكل أنبوب هو 60 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: لا توجد خطوة غسيل بعد إضافة مضاد CD3.
22. ضع الأنبوب مرة أخرى على SIP للجهاز في أسرع وقت ممكن واضغط على Record (تسجيل ) في البرنامج.
23. سجل البيانات لمدة 7 دقائق ، ومشاهدة الوقت المنقضي بموجب ضوابط الاستحواذ في البرنامج ، لمراقبة المسار الزمني لتدفق الكالسيوم داخل مجموعات العينة.
24. بعد 7 دقائق ، اضغط على إيقاف في البرنامج وأضف 1 ميكروغرام / مل من الأيونوميسين. سجل لمدة 30 ثانية للحصول على أقصى إشارة الكالسيوم في الخلايا ذات الاهتمام. للحد من ترحيل الأيونوميسين إلى العينة التالية ، أكمل عمليتي شطف الحشرة العقيمة على الجهاز بين العينات.
25. تابع إلى العينة التالية وكرر سير العمل حتى يتم جمع كافة العينات.
26. احفظ التجربة وانقر على تصدير ملف مضغوط. يتم تحميل الملفات غير المختلطة (.fsc) إلى برنامج تحليل التدفق الخلوي الخارجي.

5. تحليل منحنى الكالسيوم

1. باستخدام برنامج تحليل⁶ لقياس التدفق الخلوي ، قم بتحويل إشارات الفلورسنت Indo-1 إلى نسبة لقياسات الكالسيوم ذات الفاصل الزمني. اشتق المعلمات ضمن علامة تبويب الأدوات عن طريق إدراج مراجع Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) / Indo-1 (الكالسيوم الحر) باستخدام مقياس خطي. اضبط الحد الأدنى على الصفر والحد الأقصى وفقا لنسبة تدفق الكالسيوم ، عادة حوالي 10. تختلف النسبة القصوى حسب نوع الخلية و MFI للهند -1.
2. قم بتمييز المعلمة المحددة. ضمن الأدوات ، أضف التحليل الحركي لاختيار المعلمة بالنقر فوق علامة التبويب الحركية . اضبط المحور ص على الاشتقاق.
3. حدد MFI (متوسط شدة الفلورسنت) ضمن علامة التبويب الحركية.
4. أضف التنعيم الغاوسي ، إذا رغبت في ذلك. لإضافة تجانس Gaussian ، حدد الخيار في قائمة الإحصائيات المنسدلة في برنامج تحليل التدفق. يمكن إضافة تجانس غاوسي لتنعيم تصور منحنى تدفق الكالسيوم للتحليل.
5. إنشاء نطاقات متعددة للإحصاءات على طول الدورة الزمنية لتدفق الكالسيوم للمقارنات البيولوجية داخل العينات.
6. اسحب العينات إلى محرر التخطيط وأضف الإحصائيات حسب الرغبة. يختلف التحليل الإحصائي حسب السؤال البيولوجي. لأغراض النشر ، يتم تحليل النسخ المتماثلة المتعددة باستخدام t-test أو ANOVA.
7. للحظة من تحليل الوقت ، اضبط البوابة على لحظة زمنية محددة على طول تدفق الكالسيوم. فحص علامات السطح المطلوبة والبوابة على السكان المعنيين ؛ بعد ذلك ، قم بتقييم مخطط نقطي ثنائي الأبعاد ل Indo-1 (خال من الكالسيوم) مقابل Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) للخلايا المسورة خلال تلك اللحظة في المنطقة الزمنية.

النتائج

يوضح الشكل 1 سير العمل التجريبي لتقييم استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية باستخدام صبغة Indo-1 ذات البقع السطحية المتعددة. بعد حصاد ومعالجة خلايا الطحال الفأرية في تعليق خلية واحدة ، يتم تلطيخ الخلايا بإستر Indo-1 AM والسطح ملطخ بالأجسام المضادة المرتبطة بالفلوروكرو...

Discussion

يصف هذا البروتوكول مقايسة محسنة مصممة لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية المحملة بصبغة مؤشر Indo-1 المعايرة باستخدام قياس التدفق الخلوي^لتدفق الطيف الكامل ^7,8. تتمثل ميزة إجراء فحوصات تدفق الكالسيوم باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath