Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

요약

T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.

초록

T 세포 수용체 자극에 대한 반응으로 칼슘 유입은 T 세포 신호 전달의 일반적인 척도입니다. 띠 통과 유세포 분석에 의한 칼슘 신호 전달을 평가하기 위해 여러 칼슘 지표 염료가 개발되었습니다. 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계되었습니다. 총 비장 세포는 세포 표면 분자에 대한 형광 색소 접합 항체 패널과 함께 비율 계량 칼슘 지표 염료 Indo-1로 표지됩니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석의 기능을 활용하면 Indo-1과 함께 다양한 세포 표면 염색을 활용할 수 있는 플랫폼이 제공됩니다. 이어서, 세포는 T 세포 수용체를 자극하기 위해 항-CD3 항체의 첨가 전후에 37°C에서 실시간으로 분석된다. 스펙트럼 신호를 혼합하지 않은 후, 칼슘 결합 대 칼슘이 없는 Indo-1의 비율이 계산되고 비장 세포의 각 게이트 집단에 대해 시간 경과에 따라 시각화될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여러 세포 집단에서 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.

서문

T 세포 수용체(TCR) 유도 칼슘 유입은 T 세포 활성화의 유용한 척도이며 T 세포 집단이 TCR 신호 전달 경로¹의 근위 단계에서 손상된 반응을 갖는지 여부를 결정하는 데 자주 사용됩니다. 칼슘 유입의 측정은 일반적으로 하나 또는 한 쌍의 형광 칼슘 지시약 염료로 T 세포를 사전 표지한 다음 TCR 가교^후 실시간으로 유세포 분석을 사용하여 형광 신호를 검사하여 수행됩니다 ^2,3,4. 비율 미터법 칼슘 염료인 Indo-1은 칼슘 결합⁵에 따라 두 가지 다른 파장에서 피크 방출로 UV 레이저에 의해 여기되며, 살아있는 림프구의 칼슘 반응에 대한 유세포 분석 분석에 일반적으로 사용되는 지표 염료입니다. Indo-1의 방출 프로파일이 매우 광범위하기 때문에 Indo-1 평가와 대역 통과 유세포 분석에 의한 여러 세포 표면 마커의 동시 분석을 결합하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 제한은 T 세포의 사전 정제된 집단 또는 제한된 세포 표면 분자 세트에 의해 식별된 집단에 대한 칼슘 반응의 유세포 분석 분석의 활용을 제한합니다.

띠통과 유세포 분석을 사용하여 원발성 림프구의 이질적인 집단에 대한 칼슘 반응 측정의 한계를 해결하기 위해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 Indo-1 형광을 측정하는 프로토콜이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화할 수 있으며, 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용할 수 있습니다. 기존의 유세포 분석에 비해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하면 형광 신호와 고도로 겹치는 염료를 구별할 수 있어 각 샘플에서 동시에 평가할 수 있는 표면 마커의 수가 증가한다는 장점이 있습니다. 종래의 유세포 분석은 대역통과 필터를 사용하며, 검출기 시스템당 하나의 형광색소로 제한된다⁶. 전체 스펙트럼 유세포 분석은 5-레이저 스펙트럼 유세포 분석 시스템 ^7,8에서 64개의 검출기를 사용하여 형광색소의 전체 스펙트럼에 걸쳐 신호를 수집합니다. 또한, 전체 스펙트럼 유세포 분석은 종래의 유세포 분석기에 존재하는 광전자 증배관 검출기에 비해 감도가 증가한 APD(Avalanche Photo Diode) 검출기를 이용한다⁸. 결과적으로, 이 접근법은 칼슘 염료 표지 전에 특정 T 세포 집단을 분리할 필요가 없기 때문에 말초 혈액 단핵 세포 또는 쥐 이차 림프 기관 세포 현탁액과 같은 이종 세포 집단에 이상적입니다. 대신, 데이터 수집 후 세포 표면 마커 발현 프로필 및 유세포 분석 게이팅을 사용하여 각 관심 집단에서 칼슘 반응을 평가할 수 있습니다. 이 보고서에서 볼 수 있듯이 Indo-1은 8개의 형광색소 접합 항체와 쉽게 결합되어 총 10개의 고유한 스펙트럼 시그니처를 생성할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 선천적으로 구별되는 마우스 계통의 세포 혼합물에 쉽게 적용할 수 있어 유전자 표적 마우스 계통의 칼슘 반응과 비교하여 야생형 T 세포의 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.

프로토콜

마우스는 IACUC 프로토콜에 따라 콜로라도 대학교 안슈츠 메디컬 캠퍼스에서 유지되었습니다. 모든 마우스는 AAALAC 기준에 따라 안락사시켰다.

1. 마우스 비장에서 면역세포의 제조

참고: 순진한 마우스를 CO₂ 안락사로 안락사시킵니다. Jackson Laboratories에서 구입하여 사내에서 사육한 C57BL/6 마우스를 6-12주령의 실험에 사용합니다. 수컷과 암컷 마우스 모두 실험에 활용됩니다.

1. 외부 오염 물질이 샘플에 들어갈 가능성을 줄이기 위해 70% 에탄올로 마우스 피부를 소독합니다.
2. 해부 도구, 수술용 가위, 집게를 사용하여 쥐 비장을 해부합니다. 비장을 채취하고 분리된 비장을 얼음 위에 ~5mL의 완전한 RPMI 배지(cRPMI)가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
   참고: Complete RPMI는 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성됩니다.
   1. 마우스 비장을 채취하려면 가위로 앞다리와 뒷다리 사이의 중간에 마우스 왼쪽을 따라 털과 피부를 5cm 절개합니다. 체강을 ~ 5cm 열고 집게를 사용하여 비장을 제거하십시오. 비장은 강낭콩의 색이며 인접한 신장보다 길고 평평합니다.
3. 1.2단계의 내용물을 새 50mL 원뿔형 튜브에 부착된 멸균 70μm 필터에 붓습니다. 필터 표면에 비장 펄프가 남지 않을 때까지 5mL 주사기 플런저로 필터를 통해 비장을 밀어 비장을 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 분리합니다.
4. 4°C에서 5분 동안 500 x g 의 스윙 아웃 로터 조리대 원심분리기를 사용하여 비장세포를 펠렛화합니다.
5. 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 펠렛화된 비장세포는 50mL 원추형 튜브의 바닥에 남아 있습니다.
6. 적혈구를 제거하려면 제조업체의 지침에 따라 1mL의 ACK 용해 완충액에 펠렛화된 비장세포를 3분 동안 다시 현탁합니다. 잘 섞다.
7. ACK 용해 완충액을 15mL의 cRPMI로 소멸시킵니다.
8. 1.4단계에서 지시한 대로 림프구를 펠렛화합니다.
9. 50mL 원뿔형 튜브에서 5mL의 cRPMI에 세포 현탁액을 다시 현탁합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
   1. 세포 수를 계산하려면 세포 현탁액 10μL를 0.6mL 미세원심분리기 튜브에 옮기고 트리판 블루 용액으로 1:1 비율로 희석합니다. 그런 다음 혈구계 또는 자동 세포 계수 시스템으로 옮깁니다.
10. 단계 1.9에서와 같이 세포 현탁액 중의 세포 농도에 따라 계수한 후, 세포를 탁상용 원심분리기에서 4° C에서 5 분 동안 5분 동안 첨가하여 Indo-1 AM 에스테르 염료를 함유하는 cRMPI 배지를 제조하였다.
11. 10-12 x 10⁶ cells/mL를 달성하기 위해 세포의 재현탁 부피를 계산합니다. 이것은 필요한 총 세포 수의 2배 농도입니다.
12. 단계 1.11에서 계산된 cRPMI의 부피로 세포를 재현탁한다. 뚜껑이 통기된 50 mL 원뿔형 튜브 또는 조직 배양 플레이트에 세포를 5%_CO2 와 함께 37°C에 놓습니다.

2. Indo-1 비율계량 염료 및 형광 항체 라벨링

1. 제조업체의 지침에 따라 50μg의 Indo-1 AM이 들어 있는 바이알에 50μL의 DMSO를 추가합니다. 원액의 농도는 1μg/μL입니다.
   알림: DMSO는 DMSO의 산화를 방지하기 위해 키트와 함께 마이크로 바이알에 제공됩니다.
2. 스톡 분취량(1μg/μL)을 2배 농도인 6μg/mL 농도의 cRPMI의 적절한 실험 부피(1.11에 설정됨)로 희석합니다. Indo-1을 수용액에 보관하지 마십시오.
   참고: 칼슘이 첨가된 다른 완충액은 세포 필요에 따라 사용할 수 있습니다.
3. Indo-1이 포함된 완전한 배지를 37°C의 수조에 따로 보관합니다.
   알림: 적절한 신호를 얻기 위해 필요한 최소 농도의 Indo-1 AM 에스테르를 사용하십시오. 이것은 다양한 세포 유형에 대해 적정되어야 합니다. 일반적으로 3-5 μM 사이의 농도로 충분합니다. 일차 T 세포의 경우, 농도 >5μg/mL의 Indo-1을 로딩하는 세포는 스펙트럼 유세포 분석기에서 평균 형광 강도(MFI)를 로그 6 이상으로 증가시킵니다. 이 경우 UV 레이저 강도를 줄이고 Indo-1을 더 낮은 농도로 적정하십시오.
4. 2.2단계에서 제조된 2x Indo-1 배지를 포함하여 이전에 제조된 세포 현탁액(단계 1.12)을 cRPMI에서 1:1로 희석한다. 세포가 5-6 x 10⁶/mL 사이의 농도인지 확인하십시오.
   참고: 염색되지 않은 단일 염색 대조군 또는 표면 마커 단일 염색 세포 대조군을 Indo-1로 염색하지 마십시오. 단일 염색 항체 대조군에 Indo-1을 추가하면 단일 염색 세포에 Indo-1이 추가되어 다중 색상 샘플이 생성됩니다. 2.6단계에서 생성된 샘플 플레이트에 indo-1(칼슘 무함유) EGTA 첨가 대조군을 포함시킨다.
5. 12-웰 조직 배양 플레이트에 1mL의 세포/웰/실험 조건을 추가합니다.
6. 이전에 Indo-1 염료가 로드된 세포를 사용하여 Indo-1(칼슘 프리) 샘플에 대한 단일 염색 대조군을 만들고 EGTA를 최종 농도 2mM에 추가합니다. EGTA는 세포 현탁액에서 칼슘을 킬레이트화하여 더 깨끗한 대조군 샘플을 제공합니다.
   1. 유세포분석기에서 염료가 로드된 세포 현탁액에 50μM의 이오노마이신을 추가하여 Indo-1 양성 대조군(Indo-1 칼슘 결합)을 만듭니다. 이오노마이신은 칼슘 이온에 결합하고 칼슘 이온이 세포로 전달되는 것을 촉진하는 막 투과성 칼슘 이온단입니다.
7. 형광단이나 Indo-1 염료가 없는 생물학적 음성 조절을 위한 웰을 만듭니다.
8. 유세포 분석 패널 설계에서 항체 접합 형광단을 사용하여 관심 있는 추가 세포 집단(항체 사용자 정의)에 대한 단일 염색 제어를 위한 웰을 만듭니다. 여기에는 Indo-1 비율계량 염료가 포함되지 않습니다.
9. 표면 염색을 위해 형광색소 접합 항체를 추가하기 전에 제조업체의 지침에 따라 Fc 수용체 차단 항체(~2μg/1 x 10⁶ 세포)를 추가합니다.
10. 플레이트를 5%_CO2와 함께 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다.
11. 15분마다 플레이트를 부드럽게 두드려 12웰 플레이트에 세포를 재현탁합니다.
12. 배지에 현탁된 세포의 전체 부피를 12-웰 플레이트로부터 혼합하고 제거한다. 그런 다음 세포 현탁액을 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다.
13. 실온에서 5분 동안 500 x g 의 미세 원심분리기에서 세포를 펠렛화합니다. 상청액을 경사 제거하고, 예열된 cRPMI 1 mL를 첨가하여 세포를 세척한다. 다시 펠렛을 만들고 상청액을 디캔팅합니다.
    참고: 세포를 세척하면 남아 있는 FC 차단 항체가 제거됩니다.
14. 1.7mL 미세원심분리기 튜브에 cRPMI 1mL의 세포를 재현탁하고 각 튜브를 37°C에서 5%_CO2에서 추가로 30분 동안 배양하고 가스 교환을 허용하기 위해 튜브의 상단을 약간 열어 둡니다. 이를 통해 세포내 AM 에스테르의 완전한 탈에스테르화를 가능하게 합니다.
15. 필요한 경우 세포를 12웰 조직 배양 플레이트로 다시 옮깁니다. 추가적인 사용자 정의 적정 형광색소 접합 항체는 휴지기에 추가될 수 있습니다.
    참고: 분석법 패널에 사용된 마커에는 Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 및 CD1d/α-galcer tetramer가 포함됩니다. 마커는 T 세포 하위 집합을 분석하기 위해 선택됩니다.
    1. 관심 있는 세포 유형에 따라 사용자 정의된 모든 형광색소 접합 항체의 마스터 믹스를 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 미리 적정한 부피로 만듭니다.
    2. 휴지기 세포에 대한 적정된 항체에 따라 세포 부피 1mL에 대해 계산된 마스터 믹스를 추가합니다.
       참고: 이후 단계 2.18 대신 단계 2.15에서 염색하면 단계 2.15에서 염색하면 실험의 전체 배양 시간이 단축된다는 장점이 있습니다. 그러나 2.15 단계에서 총 부피 1mL로 염색하면 항체 사용량이 증가합니다.
16. 휴식 후, 실온에서 5분 동안 500 x g 에서 세포를 펠렛화한다.
    참고: 12웰 조직 배양 플레이트의 세포는 플레이트 원심분리기 액세서리를 사용하여 플레이트에서 펠릿화할 수 있습니다. 그렇지 않으면 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 세포를 펠릿화합니다.
17. 펠렛을 4°C의 차가운 cRPMI에 1 mL에 재현탁하여 세포를 세척하고, 단계 2.16에서와 같이 세포를 다시 펠렛화한다. 세포를 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 세포 표면을 별도로 염색하는 경우 2.18단계에서 탈에스테르화 후 더 적은 항체 부피가 필요합니다. 이 단계에서의 표면 염색은 저온 유동 완충액(1% FBS가 첨가된 1x DPBS)에서 휴지 단계 후에 사용자 정의 항체를 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 수행할 수 있습니다. 단계 2.17에서와 같이 cRPMI로 염색한 후 세포를 세척한다.
    1. DPBS에서 1:7,500으로 희석된 생존력 얼룩 Ghost540을 제조업체의 지침에 따라 샘플에 추가합니다. 열은 단일 염색 된 살아 있거나 죽은 통제를 위해 온난화 블록에서 55 ° C에서 세포를 죽입니다.
       참고: 유세포 분석에서 죽은 세포를 제거하기 위한 Viability functional dye 염색은 FBS 없이 수행됩니다. FBS는 제조업체의 지침에 따라 아민 염료와 상호 작용할 수 있습니다.
18. 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 플로우 튜브를 사용하여 500μL의 cRPMI(페놀 레드 프리)에 개별 샘플을 재현탁합니다.
    참고: 세포는 최대 한 시간 동안 4°C에 보관할 수 있습니다.
19. 세포를 함유하는 5 mL 튜브마다 개별적으로, 7분 동안 비드 배스를 사용하여 37°C로 가온하여 샘플 간의 시간을 일정하게 유지하는 유세포 분석기 상에서 분석하였다. 타이머를 사용합니다.

3. 비드 목욕 튜브: 칼슘 플럭스 분석 중 온도 유지

1. 물을 첨가하지 않은 작은 수조에 목욕 구슬을 추가하십시오. 37 °C까지 예열합니다.
2. 면도날로 50mL 원뿔형 튜브를 25mL 표시에서 조심스럽게 반으로 자릅니다. 튜브의 상단을 버리십시오.
3. 반으로 자른 튜브의 3/4을 목욕 구슬로 채 웁니다.
4. 3.2단계에서 만든 튜브를 3.1단계에서 만든 비드 배스에 넣습니다. 튜브와 비드를 37°C로 가져옵니다.
5. 시료 분석을 준비하기 위해 온도를 유지하기 위해 유세포 분석기 옆의 전기 콘센트에 비드 배스를 꽂습니다.
6. 유세포 분석기에서 실행하는 동안 튜브를 제자리에 배치하기 위해 하나의 튜브를 고정하기 위해 자른 50mL 원뿔형 스티로폼 랙을 추가합니다. 이렇게 하면 곡선 분석 기간 동안 튜브를 수동으로 잡을 필요가 없습니다.

4. 유세포 분석을 이용한 칼슘 유입량 획득

1. 유세포 분석기에서 유세포 분석기 소프트웨어에 로그인합니다.
2. 라이브러리 탭을 클릭하여 Indo-1(칼슘 결합) 및 Indo-1(칼슘 없음) 형광 태그를 추가합니다. 왼쪽의 소프트웨어 메뉴에서 Fluorescent Tags를 선택합니다. 형광 태그 그룹에서 UV 레이저를 선택하고 +추가를 클릭하여 라이브러리에 형광 태그 이름(Indo-1(칼슘 포함)/Indo-1(칼슘 없음))을 추가합니다. 레이저 여기 파장과 방출 파장을 선택한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 실험 설정을 계속합니다.
   참고: Indo-1은 355nm 파장의 UV 레이저에 의해 여기됩니다. Indo-1 (칼슘 결합)의 방출 파장은 372 nm입니다. Indo-1(칼슘 프리)의 방출 파장은 514nm입니다.
3. 획득 탭을 클릭합니다. 새 실험을 열거나 만들고 원하는 형광 태그를 실험에 추가합니다.
4. 실험에 대한 참조 그룹 과 새 샘플 그룹을 만듭니다. 필요에 따라 샘플과 참조 그룹 모두에 레이블을 지정합니다.
5. 획득 탭에서 기록할 이벤트를 최대값(10,000,000)으로 설정합니다.
6. 정지 부피를 최대 부피인 3,000μL로 설정합니다.
7. 정지 시간을 최대 시간인 36,000초로 설정합니다.
8. 다색 패널에 포함된 정의된 접합 항체에 대한 단일 염색 대조군을 획득합니다.
9. Indo-1 기능성 염료에 대한 단일 염색 대조군을 획득합니다.
   1. 50μM의 이오노마이신을 칼슘 결합 Indo-1 양성 대조군에 추가합니다. 소용돌이 섞는다. 플로우 튜브를 샘플 주입 포트에 추가하고 Record(기록)를 클릭합니다.
   2. 칼슘이 없는 Indo-1 음성 대조군을 유세포 분석기에 추가하고 기록을 클릭합니다. EGTA는 단계 2.6에서 첨가되었다.
   3. Unmix 버튼을 클릭하여 단일 염색된 컨트롤을 혼합을 해제합니다.
      참고: 모든 접합 항체 및 기능성 염료의 모든 단일 염색 대조군은 샘플을 혼합 해제하기 전에 기록해야 합니다. Unmix 버튼이 작동하려면 먼저 모든 참조 컨트롤을 녹음해야 합니다. 혼합은 시료 채취 전후에 수행할 수 있습니다.
10. 혼합 해제가 완료되면 혼합되지 않은 워크시트를 사용하여 순차적 플롯을 만듭니다. SSC-A 대 FSC-A는 샘플에서 파편을 제거하고, SSC-A 대 SSC-H는 이중선을 제거합니다. 그 다음에는 관심 인구에 대한 추가 게이팅과 함께 생존 가능성 정화 게이트가 이어집니다. 게이트를 생성하려면 플롯을 클릭합니다. 워크시트에 플롯을 추가하고 게이트 내부를 두 번 클릭하여 다운스트림 게이트 모집단을 만듭니다. 관심 있는 모든 모집단이 설명될 때까지 계속합니다.
11. 순차적 분석을 위해 단일 염색된 대조군 샘플(섹션 Indo-1 비율계량 염료 및 형광 항체 표지의 단계 2.6-2.9로부터)을 37°C로 따뜻하게 합니다. 유세포 분석 소프트웨어를 설정합니다.
12. 유세포 분석기의 유체 안정성을 보장하기 위해 유세포 분석기에서 2-3분 동안 DI 물을 실행합니다.
13. Polygon, Rectangle 또는 Ellipse gate 버튼을 사용하여 게이트를 생성하여 혼합되지 않은 워크시트에 순차적 플롯을 설정합니다. 관심 모집단(즉, SSC-A 대 FSC-A를 사용하는 림프구[크기/림프구 식별])을 포함하는 게이트. 음수 모집단은 0 주위에 모여 있는 것처럼 보이지만 양성 모집단은 MFI를 증가시켜 시각화할 수 있습니다. 관심 모집단은 생물학적 질문에 따라 사용자가 정의합니다.
14. 생성된 게이트 내부를 두 번 클릭하고 Y축 및 X축 매개변수를 SSC-A 대 SSC-H(단일항 식별)로 변경합니다. 축의 단어를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 축 매개변수 정의를 완료합니다.
15. SSC-A 대 생존도 염료 신호(생존도 게이트 파라미터)를 사용하여 플롯을 생성합니다. 아민 염료 염색에 음성인 살아있는 세포에 대한 게이트 . 살아있는 죽은 염색에 대해 음성인 살아있는 세포는 Y축과 X축 모두에서 0 표시에 클러스터링됩니다.
16. 내부 플롯을 두 번 클릭하여 단세포 살아있는 림프구만 포함하는 새 플롯을 만듭니다. 칼슘 유입을 시각화하기 위해 X축에서 시간 대비 Y축을 Indo-1(경계 칼슘)(V1) 및/또는 Indo-1(자유 칼슘)(V7)로 변경합니다.
17. 데워진 생물학적 샘플을 기계 SIT에 놓고 샘플을 2,500-3,000 events/s로 실행하여 제한된 세포 수 집단(예: iNKT)에서 칼슘 유입을 시각화할 수 있습니다.
    참고: 세포를 1 x 10⁶/mL의 농도로 재현탁함으로써 중간 유속으로 수집된 세포 이벤트는 2,500-3,000 events/s와 같아야 합니다. 드롭다운 메뉴를 클릭하여 수집 제어 하에 있는 유속을 낮추거나 세포 현탁액의 농도가 증가한 경우 샘플을 희석하십시오. 높은 유속으로 샘플을 실행하면 패널의 한 형광단에서 다른 형광단으로 신호가 확산되는 것을 증가시킬 수 있습니다.
18. 다음 튜브를 비드 배스에 추가하여 37°C로 예열합니다.
19. Acquisition Control에서 Record를 눌러 30초 동안 초기 데이터를 기록하여 샘플에서 칼슘 신호의 기초 수준을 얻습니다.
20. Acquisition Control(수집 제어)에서 Stop(중지)을 클릭하고 Sample Injection Port(SIP)에서 튜브를 제거합니다.
21. 30μg의 비접합 항-CD3를 샘플 튜브에 직접 추가하여 칼슘 유입을 시작합니다. 튜브당 최종 농도는 60μg/mL입니다.
    참고: 항-CD3 첨가 후 세척 단계가 없습니다.
22. 가능한 한 빨리 튜브를 기계 SIP에 다시 놓고 소프트웨어에서 녹음 을 누릅니다.
23. 7분 동안 데이터를 기록하고 소프트웨어의 획득 제어에 따라 경과된 시간을 관찰하여 샘플 모집단 내에서 칼슘 유입의 시간 경과를 관찰합니다.
24. 7분 후 소프트웨어에서 중지 를 누르고 1μg/mL의 이오노마이신을 추가합니다. 관심 세포에서 최대 칼슘 신호를 얻기 위해 30초 동안 기록합니다. 이오노마이신의 다음 샘플로의 이월을 제한하려면 샘플 사이에 기기에서 두 번의 SIT 플러시를 완료하십시오.
25. 다음 샘플을 계속 진행하고 모든 샘플이 수집될 때까지 워크플로를 반복합니다.
26. 실험을 저장하고 zip 파일 내보내기 를 클릭합니다. 비혼합 파일(.fsc)은 외부 유세포 분석 소프트웨어에 업로드됩니다.

5. 칼슘 곡선 분석

1. 유세포 분석을 위한 분석 소프트웨어⁶ 를 사용하여 Indo-1 형광 신호를 타임랩스 칼슘 측정을 위한 비율로 변환합니다. 선형 스케일을 사용하여 참조 Indo-1(칼슘 결합)/Indo-1(자유 칼슘)을 삽입하여 도구 탭 아래에 매개 변수를 파생합니다. 최소값을 0으로 설정하고 칼슘 유입 비율에 따라 최대값을 설정(일반적으로 약 10)합니다. 최대 비율은 Indo-1의 세포 유형 및 MFI에 따라 다릅니다.
2. 선택한 매개변수를 강조 표시합니다. 도구(tools)에서 키네틱 분석(kinetic analysis)을 추가하고 키네틱스(Kinetics) 탭을 클릭하여 파라미터를 선택합니다. Y축을 derived로 설정합니다.
3. Kinetics 탭에서 MFI(mean fluorescent intensity)를 선택합니다.
4. 원하는 경우 가우스 스무딩을 추가합니다. 가우스 스무딩을 추가하려면 흐름 분석 소프트웨어의 풀다운 통계 메뉴에서 옵션을 선택합니다. 분석의 칼슘 유입 곡선의 시각화를 매끄럽게 하기 위해 가우스 평활화를 추가할 수 있습니다.
5. 샘플 내에서 생물학적 비교를 위해 칼슘 플럭스 시간 경과를 따라 통계에 대한 여러 범위를 만듭니다.
6. 샘플을 레이아웃 편집기로 드래그하고 원하는 대로 통계를 추가합니다. 통계 분석은 생물학적 질문에 따라 다릅니다. 출판을 위해 t-검정 또는 분산 분석을 사용하여 여러 반복실험을 분석합니다.
7. 시간 분석의 순간을 위해, 칼슘 플럭스를 따라 특정 순간에 게이트를 설정하십시오. 관심 모집단에 대한 원하는 표면 마커와 게이트를 검사합니다. 그런 다음 시간 영역의 해당 순간에 개폐된 세포에 대해 Indo-1(칼슘 없음) 대 Indo-1(칼슘 결합)의 2차원 도트 플롯을 평가합니다.

결과

다중화 표면 염색이 있는 Indo-1 비율계량 염료를 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 평가하는 실험 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 마우스 비장세포를 채취하여 단일 세포 현탁액으로 처리한 후, 세포를 Indo-1 AM 에스테르로 염색하고 표면을 형광 색소 결합 항체로 염색합니다. 염료 로딩 및 항체 염색이 완료되면 림프구 샘플을 생물학적 온도(37°C)로 예열합니다. ?...

토론

이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석 ^7,8을 사용하여 적정된 Indo-1 비율계량 지표 염료가 로드된 1차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계된 최적화된 분석을 설명합니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 칼슘 플럭스 분석을 수행하는 이점은 Indo-1 형광 평가와 함께 표면 세포 마커 염색을 멀티플렉싱할 수 있다는 것입니다. 전체 스펙?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath