Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Özet

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Özet

T hücresi reseptör stimülasyonuna yanıt olarak kalsiyum akışı, T hücresi sinyallemesinin yaygın bir ölçüsüdür. Kalsiyum sinyalizasyonunu bant geçişli akış sitometrisi ile değerlendirmek için çeşitli kalsiyum indikatör boyaları geliştirilmiştir. Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak birincil murin T-hücrelerindeki kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmıştır. Toplam splenositler, orantısal kalsiyum indikatör boyası Indo-1 ve hücre yüzey moleküllerine florokrom konjuge antikorlardan oluşan bir panel ile etiketlenir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin yeteneklerinden yararlanmak, Hint-1 ile kombinasyon halinde çok çeşitli hücre yüzeyi lekelerini kullanmak için bir platform sağlar. Hücreler daha sonra T hücresi reseptörünü uyarmak için bir anti-CD3 antikorunun eklenmesinden önce ve sonra 37 ° C'de gerçek zamanlı olarak analiz edilir. Spektral sinyallerin karıştırılmasından sonra, kalsiyuma bağlı kalsiyumun kalsiyumsuz Hint-1'e oranı hesaplanır ve her kapılı splenosit popülasyonu için zaman içinde görselleştirilebilir. Bu teknik, çoklu hücre popülasyonlarında kalsiyum yanıtlarının eşzamanlı analizine izin verebilir.

Giriş

T-hücresi reseptörü (TCR) ile indüklenen kalsiyum akışı, T-hücresi aktivasyonunun yararlı bir ölçüsüdür ve sıklıkla bir T-hücresi popülasyonunun TCR sinyal yolu^1'in proksimal adımlarında bozulmuş yanıtlara sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Kalsiyum akışının ölçümleri genellikle T hücrelerinin bir veya bir çift floresan kalsiyum gösterge boyası ile önceden etiketlenmesi ve daha sonra TCR çapraz bağlama ^2,3,4'ten sonra gerçek zamanlı olarak akış sitometrisi kullanılarak floresan sinyallerinin incelenmesiyle gerçekleştirilir. Orantı-metrik bir kalsiyum boyası olan Indo-1, kalsiyum bağlanma^5'e bağlı iki farklı dalga boyunda pik emisyonlara sahip UV lazer tarafından uyarılır ve canlı lenfositlerde kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizi için yaygın olarak kullanılan bir gösterge boyasıdır. Hint-1'in emisyon profili oldukça geniş olduğundan, Hint-1 değerlendirmesini bant geçişli akış sitometrisi ile çoklu hücre yüzey belirteçlerinin eşzamanlı analizi ile birleştirmek zor olabilir. Bu sınırlama, önceden saflaştırılmış T hücresi popülasyonlarına veya sınırlı sayıda hücre yüzey molekülü tarafından tanımlanan popülasyonlara kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizinin kullanımını kısıtlar.

Primer lenfositlerin heterojen popülasyonları üzerindeki kalsiyum yanıtlarının bant geçişli akış sitometrisi kullanılarak ölçülmesinin sınırlamalarını ele almak için, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak Hint-1 floresansını ölçmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu yöntem, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanarak, Hint-1'in hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoğullanmasına izin verir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre avantajı, floresan sinyallerini yüksek oranda örtüşen boyalardan ayırt etme kabiliyeti ve böylece her numunede aynı anda değerlendirilebilen yüzey belirteçlerinin sayısını arttırmasıdır. Geleneksel akış sitometrisi bandpass filtreleri kullanır ve dedektör sistemi⁶ başına bir florokrom ile sınırlıdır. Tam spektrumlu akış sitometrisi, beş lazerli spektral akış sitometri sistemi ^7,8 üzerinde 64 dedektör kullanarak florokromun tüm spektrumu boyunca sinyaller toplar. Ek olarak, tam spektrumlu akış sitometrisi, geleneksel akış sitometrelerinde bulunan fotoçarpan tüp dedektörlerine göre artan duyarlılığa sahip APD (Çığ Fotoğraf Diyot) dedektörlerinden yararlanır⁸. Sonuç olarak, bu yaklaşım, kalsiyum boya etiketlemesinden önce spesifik T hücresi popülasyonlarının izolasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırdığından, periferik kan mononükleer hücreleri veya murin sekonder lenfoid organ hücresi süspansiyonları gibi heterojen hücre popülasyonları için idealdir. Bunun yerine, veri toplandıktan sonra hücre yüzey belirteci ekspresyon profilleri ve akış sitometrisi geçişi, ilgilenilen her popülasyondaki kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu raporda gösterildiği gibi, Hint-1, sekiz florokrom konjuge antikorla kolayca birleştirilebilir ve bu da toplam 10 benzersiz spektral imza ile sonuçlanır. Ayrıca, bu yöntem konjenik olarak farklı fare çizgilerinden gelen hücre karışımlarına kolayca uygulanabilir ve bu da gen hedefli bir fare hattından gelenlere kıyasla vahşi tip T hücrelerindeki kalsiyum tepkilerinin eşzamanlı analizine izin verir.

Protokol

Fareler, IACUC protokollerine uygun olarak Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp kampüsünde tutuldu. Tüm fareler AAALAC standartlarına göre ötenazi yapıldı.

1. Fare dalağından bağışıklık hücrelerinin hazırlanması

NOT: CO₂ ötenazi ile naif fareleri ötenazi yapın. Jackson Laboratuvarları'ndan satın alınan ve şirket içinde yetiştirilen C57BL/6 fareleri, 6-12 haftalıkken deneyler için kullanılır. Deneyler için hem erkek hem de dişi fareler kullanılır.

1. Dış kirleticilerin numuneye girme olasılığını azaltmak için fare derisini %70 etanol ile dezenfekte edin.
2. Diseksiyon aletleri, cerrahi makas ve forseps kullanarak fare dalağını diseke edin. Dalağı hasat edin ve ayrılan dalağı buz üzerinde ~ 5 mL tam RPMI ortamı (cRPMI) ile 50 mL konik tüpe yerleştirin.
   NOT: Tam RPMI% 10 FBS, 2 mM L-glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin'den oluşur.
   1. Fare dalağını hasat etmek için, farenin sol tarafı boyunca kürk ve cilde 5 cm'lik bir kesi yapın, ön ve arka bacakların ortasına kadar makasla yapın. Vücut boşluğunu ~ 5 cm açın ve forseps kullanarak dalağı çıkarın. Dalak, bir böbrek çekirdeğinin rengidir ve komşu böbrekten daha uzun ve düzdür.
3. Adım 1.2'nin içeriğini, yeni bir 50 mL konik tüpe bağlı steril bir 70 μm filtreye dökün. Dalağı, filtre yüzeyinde dalak hamuru kalmayıncaya kadar 5 mL'lik bir şırınga pistonu ile filtreden geçirerek dalağı mekanik olarak tek bir hücre süspansiyonuna ayırın.
4. Splenositleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de bir salınımlı rotor tezgah santrifüjü kullanarak pelet yapın.
5. Supernatant'ı dikkatlice boşaltın. Peletlenmiş splenositler 50 mL konik tüpün dibinde kalır.
6. Kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için, peletlenmiş splenositleri üreticinin talimatlarına göre 1 mL ACK lizis tamponunda 3 dakika boyunca tekrar askıya alın. İyice karıştırın.
7. ACK lizis tamponunu 15 mL cRPMI ile söndürün.
8. Lenfositleri adım 1.4'te belirtildiği gibi pelet yapın.
9. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüp içinde 5 mL cRPMI'de tekrar askıya alın. Örnekleri buzun üzerine yerleştirin.
   1. Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve Trypan mavisi çözeltisi ile 1: 1 oranında seyreltin. Ardından, bir hemositometreye veya otomatik hücre sayım sistemine aktarın.
10. Sayımdan sonra, adım 1.9'da olduğu gibi hücre süspansiyonundaki hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, Hint-1 ester boyası içeren cRMPI ortamının eklenmesine hazırlanmak için hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5 x g'de bir masa üstü santrifüjde pelet haline getirin.
11. 10-12 x 10⁶ hücre / mL elde etmek için hücrelerin yeniden süspansiyon hacmini hesaplayın. Bu, gerekli toplam hücre sayısının 2 katı konsantrasyondur.
12. Adım 1.11'de hesaplanan cRPMI hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri %5 CO₂ ile 37 °C'de, kapağı havalandırmalı 50 mL'lik bir konik tüpe veya bir doku kültürü plakasına yerleştirin.

2. Hint-1 oranmetrik boya ve floresan antikor etiketleme

1. Üreticinin talimatlarına göre, 50 μg Indo-1 içeren bir şişeye 50 μL DMSO ekleyin. Stok çözeltisinin konsantrasyonu 1 μg / μL'dir.
   NOT: DMSO, DMSO'nun oksidasyonunu önlemek için kit ile birlikte mikro şişelerde sağlanır.
2. Stok alikotunu (1 μg / μL), 2x konsantrasyon olan 6 μg / mL'lik bir konsantrasyonda cRPMI'nin uygun deneysel hacmine (1.11'de kurulan) seyreltin. Hint-1'i sulu bir çözeltide saklamayın.
   NOT: Kalsiyum eklenmiş diğer tamponlar, hücre ihtiyaçlarına bağlı olarak kullanılabilir.
3. Hint-1 ile birlikte tüm medyayı 37 ° C'de bir su banyosunda bir kenara koyun.
   NOT: Yeterli bir sinyal elde etmek için gerekli minimum Hint-1 ester konsantrasyonunu kullanın. Bunun, değişen hücre tipleri için titre edilmesi gerekir. Tipik olarak, 3-5 μM arasında bir konsantrasyon yeterlidir. Birincil T-hücreleri için, >5 μg / mL konsantrasyonda Hint-1 içeren hücrelerin yüklenmesi, spektral akış sitometrelerinde ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) 6'lık bir kütüğün üzerine çıkarır. Bu meydana gelirse, UV lazer yoğunluğunu azaltın ve Hint-1'i daha düşük bir konsantrasyona titre edin.
4. Önceden hazırlanmış hücre süspansiyonunu (adım 1.12'de), adım 2.2'de yapılan 2x Hint-1 ortamı da dahil olmak üzere cRPMI'de 1: 1'i seyreltin. Hücrelerin 5-6 x 10⁶ / mL arasında bir konsantrasyonda olduğundan emin olun.
   NOT: Lekesiz tek leke kontrolünü veya yüzey işaretleyici tek leke hücresi kontrollerini Indo-1 ile boyamayın. Tek lekeli antikor kontrollerine Hint-1 eklenmesi, tek lekeli hücrelere eklenen Hint-1 nedeniyle çok renkli bir örnek oluşturacaktır. Hint-1 (kalsiyum içermeyen) EGTA, adım 2.6'da oluşturulan numune plakasına ek kontrol ekleyin.
5. 12 delikli bir doku kültürü plakasına 1 mL hücre / kuyu / deneysel durum ekleyin.
6. Daha önce Hint-1 boya yüklü hücreleri kullanarak Indo-1 (kalsiyumsuz) numune için tek bir lekeli kontrol oluşturun ve EGTA'yı 2 mM'lik nihai konsantrasyona ekleyin. EGTA, hücre süspansiyonundaki kalsiyumu şelatlayarak daha temiz bir kontrol örneği verir.
   1. Akış sitometresindeki boya yüklü hücre süspansiyonuna 50 μM iyonomisin ekleyerek bir Hint-1 pozitif kontrol (Hint-1 kalsiyuma bağlı) oluşturun. İonomisin, kalsiyum iyonlarını bağlayan ve kalsiyum iyonlarının hücrelere transferini kolaylaştıran membran geçirgen bir kalsiyum iyonoforudur.
7. Florofor veya Hint-1 boyası içermeyen biyolojik negatif kontrol için bir kuyu oluşturun.
8. Bir akış sitometri paneli tasarımında antikor konjuge floroforları kullanarak ilgilenilen herhangi bir ek hücre popülasyonu (kullanıcı tarafından tanımlanan antikorlar) için tek leke kontrolleri için bir kuyu oluşturun. Bunlar Hint-1 oranmetrik boyasını içermeyecektir.
9. Yüzey boyama için ek florokrom-konjuge antikorlar eklemeden önce, üreticinin talimatlarına göre Fc reseptörü bloke edici antikoru (~ 2 μg / 1 x 10⁶ hücre) ekleyin.
10. Plakayı %5 CO 2 ile 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin_.
11. Her 15 dakikada bir plakaya hafifçe dokunarak hücreleri 12 delikli bir plakada tekrar askıya alın.
12. Ortamda asılı duran hücrelerin tüm hacmini 12 delikli plakadan karıştırın ve çıkarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.
13. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de bir mikrosantrifüjde peletleyin. Süpernatantı boşaltın ve 1 mL önceden ısıtılmış cRPMI ekleyerek hücreleri yıkayın. Pelet tekrar ve süpernatantı boşaltın.
    NOT: Hücrelerin yıkanması, kalan FC bloke edici antikorları ortadan kaldırır.
14. Hücreleri 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerinde 1 mL cRPMI'de yeniden askıya alın ve her bir tüpü 37 ° C'de% 5 CO_2'de 30 dakika daha inkübe edin ve gaz değişimine izin vermek için tüpün üstünü hafifçe açık bırakın. Bu, hücre içi esterlerinin tamamen deesterifikasyonuna izin verir.
15. Gerekirse, hücreleri 12 delikli bir doku kültürü plakasına geri aktarın. Ek kullanıcı tanımlı titre florokrom-konjuge antikorlar dinlenme aşamasında eklenebilir.
    NOT: Yöntemler panelinde kullanılan işaretleyiciler şunları içerir: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 ve CD1d/α-galcer tetramer. İşaretçiler, T hücresi alt kümelerini analiz etmek için seçilir.
    1. Kullanıcı tanımlı florokrom-konjuge antikorların tümünün, ilgilenilen hücre tiplerine göre, daha önce titre edilmiş bir hacimde 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ana karışımını oluşturun.
    2. Dinlenme hücrelerine titre edilmiş antikorlara bağlı olarak, hücre hacminin 1 mL'si için hesaplanmış bir ana karışım ekleyin.
       NOT: Sonraki adım 2.18 yerine adım 2.15'te boyamanın avantajı, adım 2.15'te boyamanın deney için genel kuluçka süresini azaltacak olmasıdır. Bununla birlikte, adım 2.15'te toplam 1 mL'lik bir hacimde boyanma, antikor kullanımını arttırır.
16. Dinlendikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de pelet yapın.
    NOT: 12 delikli bir doku kültürü plakasındaki hücreler, bir plaka santrifüj aksesuarı ile plaka içinde peletlenebilir. Aksi takdirde, hücreleri 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde pelet edin.
17. Peletleri 1 mL 4 °C soğuk cRPMI'de yeniden askıya alarak hücreleri yıkayın ve adım 2.16'da olduğu gibi hücreleri tekrar pelet haline getirin. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
    NOT: Yüzey boyama hücreleri ayrı ayrı yapılırsa, adım 2.18'de deesterifikasyon sonrasında, daha az antikor hacmine ihtiyaç vardır. Bu adımda yüzey boyama, soğuk akış tamponunda dinlenme aşamasından sonra (% 1 FBS eklenmiş 1x DPBS), kullanıcı tanımlı antikorlar kullanılarak, buz üzerinde 30 dakika boyunca gerçekleştirilebilir. Lekeden sonra hücreleri adım 2.17'de olduğu gibi cRPMI'de yıkayın.
    1. DPBS'de 1:7.500 seyreltilmiş canlılık lekesi Ghost540'ı üreticinin talimatlarına göre numunelere ekleyin. Isı, tek lekeli canlı / ölü kontrolü için bir ısınma bloğunda hücreleri 55 ° C'de öldürür.
       NOT: Akış sitometrik analizinde ölü hücreleri ortadan kaldırmak için canlılık fonksiyonel boya boyama FBS olmadan gerçekleştirilir. FBS, üreticinin talimatlarına göre amin boyaları ile etkileşime girebilir.
18. Kapaklı 5 mL'lik bir polistiren akış tüpü kullanarak bireysel numuneleri 500 μL cRPMI'de (fenol kırmızısız) tekrar askıya alın.
    NOT: Hücreler 4 °C'de bir saate kadar bırakılabilir.
19. Hücreleri içeren her 5 mL'lik tüpü, ayrı ayrı, akış sitometresindeki analizden önce bir boncuk banyosu kullanarak 7 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtın ve numuneler arasında tutarlı bir süre tutun. Bir zamanlayıcı kullanın.

3. Boncuk banyo tüpü: kalsiyum akısı analizi sırasında sıcaklığın korunması

1. Su eklenmeden küçük bir su banyosuna banyo boncukları ekleyin; 37 °C'ye kadar ısıtın.
2. 50 mL'lik bir konik tüpü, 25 mL işaretinde, bir tıraş bıçağı ile dikkatlice ikiye bölün; tüpün üstünü atın.
3. Yarıya indirilmiş tüpü yolun 3 / 4'ünü banyo boncuklarıyla doldurun.
4. Adım 3.2'de oluşturulan tüpü, adım 3.1'de oluşturulan boncuk banyosuna yerleştirin. Tüp ve boncukları 37 °C'ye getirin.
5. Numune analizine hazırlanırken sıcaklığı korumak için boncuk banyosunu akış sitometresinin yanındaki bir elektrik prizine takın.
6. Akış sitometresinde çalışırken tüpü yerine yerleştirmek üzere bir tüpü tutmak için 50 mL'lik konik strafor raf kesimi ekleyin. Bu, eğri analizi süresince tüpü manuel olarak tutma ihtiyacını ortadan kaldıracaktır.

4. Akış sitometrik analizi kullanarak kalsiyum akışının elde edilmesi

1. Bir akış analizöründeki akış sitometresi yazılımında oturum açın.
2. Indo-1 (kalsiyuma bağlı) ve Indo-1 (kalsiyumsuz) floresan etiketleri eklemek için Kütüphane sekmesine tıklayın. Soldaki yazılım menüsünden Floresan Etiketleri'ni seçin. Floresan etiket grupları altında UV lazeri seçin ve kütüphaneye floresan etiket adı (Indo-1 (kalsiyuma bağlı)/Indo-1 (kalsiyumsuz)) eklemek için +ekle'ye tıklayın. Lazer uyarma dalga boyunu ve emisyon dalga boyunu seçin ve ardından Kaydet'e tıklayın. Deneme kurulumuna devam edin.
   NOT: Indo-1, UV lazer tarafından 355 nm dalga boyunda uyarılır. Hint-1'in (kalsiyuma bağlı) emisyon dalga boyu 372 nm'dir. Hint-1'in (kalsiyumsuz) emisyon dalga boyu 514 nm'dir.
3. Edinme sekmesine tıklayın. Yeni bir deneme açın/oluşturun ve istediğiniz floresan etiketlerini denemeye ekleyin.
4. Deneme için Referans Grubu ve yeni bir örnek grup/gruplar oluşturun. Hem numuneleri hem de referans gruplarını gerektiği gibi etiketleyin.
5. Almalar sekmesi altında, olayları kaydedilecek en yüksek değere ayarlayın: 10.000.000.
6. Durdurma ses düzeyini maksimum ses düzeyine ayarlayın: 3.000 μL.
7. Durma süresini maksimum süreye ayarlayın: 36.000 sn.
8. Çok renkli panelde bulunan tanımlanmış konjuge antikorlar için tek boyalı kontroller edinin.
9. Indo-1 fonksiyonel boya için tek lekeli kontroller edinin.
   1. Kalsiyuma bağlı Hint-1 pozitif kontrolüne 50 μM iyonomisin ekleyin. Karıştırmak için vorteks. Akış tüpünü numune enjeksiyon portuna ekleyin ve Kaydet'e tıklayın.
   2. Akış sitometresine kalsiyumsuz Indo-1 negatif kontrolü ekleyin ve Kaydet'e tıklayın. EGTA adım 2.6'da eklenmiştir.
   3. Tek lekeli kontrollerin karışımını Karıştır düğmesine tıklayarak çıkarın.
      NOT: Tüm konjuge antikorlardan ve fonksiyonel boyalardan alınan tüm tek boyalı kontroller, numunelerin karıştırılmasından önce kaydedilmelidir. Unmix (Karıştır) düğmesinin çalışması için önce tüm referans kontrollerinin kaydedilmesi gerekir. Karıştırmanın kaldırılması, numune toplanmasından önce veya sonra yapılabilir.
10. Karıştırmayı kaldırma işlemi tamamlandıktan sonra, karıştırılmamış çalışma sayfasını kullanarak sıralı grafikler oluşturun. SSC-A'ya karşı FSC-A, numuneden döküntüleri kaldırmak, SSC-A'ya karşı SSC-H, çiftleri çıkarmak için. Bunu, ilgilenilen popülasyonlar üzerinde daha fazla geçit ile birlikte bir yaşayabilirlik temizleme kapısı izler. Kapılar oluşturmak için, Grafik'e tıklayın. Çalışma sayfasına bir grafik ekleyin ve aşağı akış kapılı bir popülasyon oluşturmak için kapının içine çift tıklayın. İlgilenilen tüm popülasyonlar hesaba katılana kadar devam edin.
11. Sıcak tek boyalı kontrol numuneleri (Hint-1 oransal boya ve floresan antikor etiketleme bölümündeki 2.6-2.9 adımlarından) sıralı analiz için 37 °C'ye kadar. Akış sitometri yazılımını kurun.
12. Akış sitometresinin akışkan stabilitesini sağlamak için sitometre üzerinde DI suyunu 2-3 dakika çalıştırın.
13. Çokgen, Dikdörtgen veya Elips kapı düğmelerini kullanarak kapılar oluşturarak karıştırılmamış çalışma sayfasında sıralı grafikler ayarlayın. İlgilenilen popülasyonu içeren kapı (yani, SSC-A ve FSC-A kullanan lenfositler [boyut / lenfosit ayrımcılığı]). Negatif popülasyonlar sıfır civarında kümelenmiş görünürken, pozitif popülasyonlar MFI'yı artırarak görselleştirilebilir. İlgilenilen popülasyonlar, biyolojik soruya dayanarak kullanıcı tarafından tanımlanacaktır.
14. Oluşturulan kapının içine çift tıklayın ve Y ekseni ve X ekseni parametrelerini SSC-A ve SSC-H (tekli ayrım) olarak değiştirin. Eksen üzerindeki kelimelere sol tıklayarak eksen parametrelerini tanımlamayı tamamlayın.
15. SSC-A ve canlılık boya sinyali (canlılık kapısı parametreleri) ile bir grafik oluşturun. Amin boya boyaması için negatif olan canlı hücreler üzerindeki kapı . Canlı ölü boyama için negatif olan canlı hücreler, hem Y hem de X eksenlerinde 0 işaretinde kümelenecektir.
16. Sadece tek hücreli canlı lenfositleri içeren yeni bir arsa oluşturmak için iç çizime çift tıklayın. Kalsiyum akışının görselleştirilmesi için X eksenindeki zamana karşı Y eksenini Hint-1 (bağlı kalsiyum) (V1) ve / veya Hint-1 (serbest kalsiyum) (V7) olarak değiştirin.
17. Isıtılmış biyolojik numuneyi makine SIT üzerine yerleştirin ve sınırlı hücre sayısı popülasyonlarında (örneğin, iNKT) kalsiyum akışının görselleştirilmesine izin vermek için numuneleri ortam üzerinde 2.500-3.000 olay / s'de çalıştırın.
    NOT: Hücreleri 1 x 10⁶/mL konsantrasyonda yeniden askıya alarak, orta akış hızında toplanan hücre olayları 2.500-3.000 olay / s'ye eşit olmalıdır. Açılır menüye tıklayarak edinme kontrolü altındaki akış hızını düşürün veya hücre süspansiyonu daha yüksek bir konsantrasyona sahipse numuneyi seyreltin. Numunelerin yüksek bir akış hızında çalıştırılması, sinyalin bir florofordan paneldeki diğer floroforlara yayılmasını artırabilir.
18. 37 ° C'ye ısıtmak için bir sonraki tüpü boncuk banyosuna ekleyin.
19. Edinme Kontrolünde, numunede bazal bir kalsiyum sinyali seviyesi elde etmek üzere ilk verileri 30 sn boyunca kaydetmek için Kaydet'e basın.
20. Edinme Kontrolünde, Durdur'a tıklayın ve tüpü Numune Enjeksiyon Portundan (SIP) çıkarın.
21. Kalsiyum akışını başlatmak için 30 μg konjuge edilmemiş anti-CD3'ü doğrudan numune tüpüne ekleyin. Tüp başına nihai konsantrasyon 60 μg / mL'dir.
    NOT: Anti-CD3 ilavesinden sonra yıkama adımı yoktur.
22. Tüpü mümkün olduğunca çabuk makine SIP'ine geri yerleştirin ve yazılımda Kaydet'e basın.
23. Örnek popülasyonlardaki kalsiyum akışının zaman seyrini gözlemlemek için yazılımdaki edinim kontrolleri altında geçen süreyi izleyerek 7 dakika boyunca veri kaydedin.
24. 7 dakika sonra, yazılımda Durdur'a basın ve 1 μg / mL iyonomisin ekleyin. İlgilenilen hücrelerde maksimum kalsiyum sinyalini elde etmek için 30 s boyunca kayıt yapın. İyonomisinin bir sonraki numuneye taşınmasını sınırlamak için, numuneler arasında cihaz üzerinde iki SIT yıkama işlemi tamamlayın.
25. Sonraki örneğe geçin ve tüm örnekler toplanana kadar iş akışını yineleyin.
26. Denemeyi kaydedin ve dışa aktarma zip dosyasına tıklayın. Karıştırılmamış dosyalar (.fsc) harici akış sitometri analiz yazılımına yüklenir.

5. Kalsiyum eğrisi analizi

1. Akış sitometrisi için bir analiz yazılımı⁶ kullanarak, Hint-1 floresan sinyallerini hızlandırılmış kalsiyum ölçümleri için bir orana dönüştürün. Doğrusal bir ölçek kullanarak Indo-1 (kalsiyuma bağlı)/Indo-1 (serbest kalsiyum) referanslarını ekleyerek araçlar sekmesi altındaki parametreleri türetin. Minimumu sıfıra ve kalsiyum oranının akışına göre, tipik olarak 10 civarında maksimuma ayarlayın. Maksimum oran, hücre tipine ve Hint-1'in MFI'sine göre değişir.
2. Seçilen parametreyi vurgulayın. Araçlar altında, Kinetik sekmesine tıklayarak parametreyi seçmek için kinetik analiz ekleyin. Y eksenini türetilmiş olarak ayarlayın.
3. Kinetik sekmesinde MFI (ortalama floresan yoğunluğu) öğesini seçin.
4. İsterseniz Gauss yumuşatma ekleyin. Gauss yumuşatma eklemek için, akış analizi yazılımındaki açılır istatistikler menüsündeki seçeneği belirleyin. Analizin kalsiyum akışı eğrisinin görselleştirilmesini yumuşatmak için Gauss yumuşatma eklenebilir.
5. Numuneler içindeki biyolojik karşılaştırmalar için kalsiyum akısı zaman seyri boyunca istatistikler için çoklu aralıklar oluşturun.
6. Örnekleri mizanpaj düzenleyicisine sürükleyin ve istatistikleri istediğiniz gibi ekleyin. İstatistiksel analiz biyolojik soruya bağlı olarak değişir. Yayın amacıyla, çoklu replikalar t-testi veya ANOVA kullanılarak analiz edilir.
7. Bir anlık zaman analizi için, kapıyı kalsiyum akısı boyunca belirli bir zamanda ayarlayın. İstenilen yüzey işaretleyicilerini inceleyin ve ilgilenilen popülasyon üzerindeki kapıyı inceleyin; daha sonra, zaman diliminde o an içinde kapılı hücreler için Hint-1'in (kalsiyumsuz) ve Hint-1'in (kalsiyum bağlı) iki boyutlu bir nokta grafiğini değerlendirin.

Sonuçlar

Çoklu yüzey lekelerine sahip bir Hint-1 oranmetrik boya kullanarak birincil murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare splenositlerini tek bir hücre süspansiyonuna topladıktan ve işledikten sonra, hücreler bir Hint-1 esteri ile boyanır ve yüzey florokroma bağlı antikorlarla boyanır. Boya yüklemesi ve antikor boyama işlemi tamamlandıktan sonra, lenfosit örnekleri biyolojik bir sıcaklığa (37 °...

Tartışmalar

Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi ^7,8 kullanarak titre edilmiş Hint-1 oranmetrik indikatör boyası ile yüklenen primer murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmış optimize edilmiş bir tahlili açıklamaktadır. Tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak kalsiyum akısı testleri yapmanın avantajı, Indo-1 floresansının değerlendirilmesi ile birlikte yüzey hücresi belirteci boyamasını çoklama yeteneğidir....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath