JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول ، تم تحسين طريقة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) وعزل النوى الموسومة في أنواع معينة من الخلايا (INTACT) للاستجواب المزدوج لنسخة المبيض الخاصة بالخلية و epigenome باستخدام نموذج الماوس NuTRAP الذي تم عبوره إلى خط الماوس Cyp17a1-Cre.

Abstract

يعد تقييم التغيرات فوق الجينية والترانسبية الخاصة بنوع الخلية أمرا أساسيا لفهم شيخوخة المبيض. تحقيقا لهذه الغاية ، تم إجراء تحسين طريقة تنقية تقارب الريبوسوم المترجم (TRAP) وعزل النوى الموسومة بطريقة أنواع معينة من الخلايا (INTACT) للاستجواب المزدوج اللاحق لنسخة المبيض الخاصة بالخلية و epigenome باستخدام نموذج فأر NuTRAP جديد معدل وراثيا. يخضع تعبير أليل NuTRAP لسيطرة شريط STOP المتخبط ويمكن استهدافه لأنواع معينة من خلايا المبيض باستخدام خطوط Cre الخاصة بالمروج. نظرا لأن الدراسات الحديثة قد ورطت خلايا انسجة المبيض في قيادة الأنماط الظاهرية للشيخوخة المبكرة ، فقد استهدف نظام التعبير NuTRAP الخلايا اللحمية باستخدام برنامج تشغيل Cyp17a1-Cre. كان تحريض بنية NuTRAP خاصا بالخلايا الليفية اللحمية المبيضية ، وتم الحصول على ما يكفي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لدراسات التسلسل من مبيض واحد. يمكن استخدام نموذج NuTRAP والطرق المعروضة هنا لدراسة أي نوع من خلايا المبيض مع خط Cre متاح.

Introduction

المبيضان لاعبان رئيسيان في الشيخوخة الجسدية1 ، مع مساهمات مميزة من مجموعات خلايا معينة. يجعل عدم التجانس الخلوي للمبيض من الصعب تفسير النتائج الجزيئية من فحوصات المبيض الكامل السائبة. يعد فهم دور مجموعات خلايا معينة في شيخوخة المبيض أمرا أساسيا لتحديد الدوافع الجزيئية المسؤولة عن الخصوبة والتدهور الصحي لدى النساء المسنات. تقليديا ، تم تحقيق التقييم متعدد الأوميكس لأنواع معينة من خلايا المبيض من خلال تقنيات مثل التشريح المجهريبالليزر 2 ، أو نهج الخليةالمفردة 3 ، أو فرز الخلايا4. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التشريح المجهري مكلفا ويصعب تنفيذه ، ويمكن أن يغير فرز الخلايا ملامح النمط الظاهري الخلوي5.

يستخدم نهج جديد لتقييم الملامح اللاجينومية والنسخ الخاصة بنوع خلايا المبيض نموذج الماوس النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP). يسمح نموذج NuTRAP بعزل الأحماض النووية الخاصة بنوع الخلية دون الحاجة إلى فرز الخلايا باستخدام طرق تنقية التقارب: ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) وعزل النوى الموسومة في أنواع معينة من الخلايا (INTACT)6. يخضع تعبير أليل NuTRAP لسيطرة شريط STOP المتخبط ويمكن استهدافه لأنواع معينة من خلايا المبيض باستخدام خطوط Cre الخاصة بالمروج. من خلال عبور ماوس NuTRAP بخط Cre خاص بنوع الخلية ، تؤدي إزالة شريط STOP إلى وضع علامات eGFP على مركب الريبوسوم ووضع علامات على البيوتين / mCherry للنواة بطريقة تعتمد على Cre6. يمكن بعد ذلك استخدام تقنيات TRAP و INTACT لعزل mRNA والحمض النووي النووي من نوع الخلية محل الاهتمام والمضي قدما في التحليلات النسخية وفوق الجينومية.

تم استخدام نموذج NuTRAP في أنسجة مختلفة ، مثل الأنسجة الدهنية6 ، وأنسجة المخ7،8،9 ، وشبكية العين10 ، للكشف عن التغيرات فوق الجينية والنسخ الخاصة بنوع الخلية والتي قد لا يتم اكتشافها في تجانس الأنسجة الكاملة. تشمل فوائد نهج NuTRAP على تقنيات فرز الخلايا التقليدية ما يلي: 1) منع القطع الأثرية التنشيطية خارج الجسم الحي 8 ، 2) تقليل الحاجة إلى المعدات المتخصصة (أي فارزات الخلايا) ، و 3) زيادة الإنتاجية وانخفاض تكلفة التحليلات الخاصة بنوع الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القدرة على عزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من فأر واحد تسمح بإجراء تحليلات مزدوجة تزيد من القوة الإحصائية. نظرا لأن الدراسات الحديثة قد ورطت خلايا انسجة المبيض في قيادة الأنماط الظاهرية للشيخوخة المبكرة 11،12،13 ، فقد استهدفنا نظام تعبير NuTRAP للخلايا اللحمية والخلايا الثيكا باستخدام برنامج تشغيل Cyp17a1-Cre. هنا ، نوضح أن تحريض بنية NuTRAP خاص بخلايا انسجة المبيض وخلايا الثيكا ، ويتم الحصول على ما يكفي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لدراسات التسلسل من مبيض واحد. يمكن استخدام نموذج NuTRAP والطرق المعروضة هنا لدراسة أي نوع من خلايا المبيض مع أي خط Cre متاح.

لتوليد خط فأر NuTRAP المبيض الخاص بنوع الخلية ، يحتوي أليل الوسم النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) على كودون STOP متخبط يتحكم في التعبير عن BirA ، وببتيد التعرف على البيوتين ليجاز (BLRP) الموسوم mCherry / mRANGAP1 ، و eGFP / L10a. عند عبوره بخط Cre خاص بنوع الخلية ، فإن تعبير كاسيت NuTRAP يسمي البروتين النووي mRANGAP1 مع البيوتين / mCherry والبروتين الريبوسومي L10a مع eGFP بطريقة تعتمد على Cre. هذا يسمح بعزل النوى و mRNA من أنواع معينة من الخلايا دون الحاجة إلى فرز الخلايا. يمكن إقران NuTRAP flox/ flox مع Cre خاص بنوع الخلية ذي الصلة بأنواع خلايا المبيض لتقييم ذلك.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مؤسسة أوكلاهوما للأبحاث الطبية (OMRF). تم شراء الفئران الأم من مختبر جاكسون (بار هاربور ، ميشيغان) وتم تربيتها وإيواؤها في ظل ظروف SPF في بيئة حاجز HEPA في دورة ضوء / مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات (تضيء الأضواء في الساعة 6:00 صباحا) في OMRF.

ملاحظة: في هذا العرض التوضيحي ، نستخدم ذكر Cyp17iCre +/− (سلالة # 028547 ، مختبر جاكسون) مقترنا بأنثى NuTRAP (سلالة # 029899 ، مختبر جاكسون). ذرية Cyp17-NuTRAP المطلوبة (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox / WT) سوف يعبر عن أليل NuTRAP تحت سيطرة مروج Cyp17a1 في خلايا انسجة المبيض. لإعداد هذه المخطوطة ، استخدمنا إناث الفئران Cyp17-NuTRAP البالغة من العمر 4 أشهر (ن = 4). تم استخراج الحمض النووي من عينات لكمة أذن الفأر للتنميط الجيني لتأكيد وراثة جينات التحوير Cyp17iCre و NuTRAP وللكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل ل 1) Cre العام ، 2) Cyp17iCre ، و 3) تخبط NuTRAP باستخدام البادئات المدرجة في جدول المواد ، كما هو موضح سابقا 7,8.

1. تشريح المبيض الماوس

  1. أداء القتل الرحيم للفأر وفقا لإرشادات رعاية الحيوان وموافقة المؤسسة ، تليها جمع المبيض.
  2. تشريح المبيضين لإزالة أي نسيج دهني أو أجزاء من قناة البيض التي قد تكون متصلة بأنسجة المبيض قبل وضع المبيضين في أنابيب ذات عازلة. انتقل على الفور إلى تقنيات TRAP أو INTACT.
    ملاحظة: لم يتم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع الأنسجة المجمدة. يوصى باستخدام مبيض واحد من نفس الماوس لكل تقنية للتحليل الإحصائي في المستقبل.

2. عزل النوى من أنواع خلايا المبيض المحددة

  1. إعداد العازلة
    1. المخزن المؤقت للتنقية النووية (NPB): لتحضير 100 مل من NPB ، امزج 2 مل من 1 M HEPES (التركيز النهائي: 20 mM HEPES) ، 0.8 mL من 5 M NaCl (40 mM NaCl) ، 4.5 mL من 2 M KCl (90 mM KCl) ، 0.4 mL من 0.5 M EDTA (2 mM EDTA) ، 0.1 mL من 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA) ، و 92.2 مل من الماء الخالي من النيوكلياز. تكملة مع 1x مثبطات الأنزيم البروتيني في يوم عزل النوى.
      ملاحظة: يمكن تحضير NPB بدون مثبط الأنزيم البروتيني مسبقا ويستمر لمدة تصل إلى 3 أسابيع عند 4 درجات مئوية.
    2. المخزن المؤقت لتحلل النوى (كامل): مكمل محلول تحلل النوى بمثبط الأنزيم البروتيني 1x في يوم عزل النوى.
  2. إنشاء تعليق النوى
    ملاحظة: يجب حفظ العينات على الثلج في جميع الأوقات ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. اجمع مبيضا واحدا من فأر Cyp17-NuTRAP (أو غيره من Cre-NuTRAP ذي الصلة) في 500 ميكرولتر من محلول تحلل النوى (كامل). اقطع المبيض إلى ثمانية أجزاء داخل المخزن المؤقت باستخدام مقص صغير ذاتي الفتح.
    2. استخدم أطراف ماصة عريضة التجويف لنقل المبيض المفروم و 500 ميكرولتر من محلول التحلل إلى خالط دانس زجاجي على الجليد. تجانس المبيض 10x-20x مع المدقة السائبة A. أضف 400 ميكرولتر من محلول التحلل إلى الخالط Dounce ، مدقة الغسيل A.
    3. تجانس المبيض مع مدقة ضيقة B 10x-20x. أضف 1000 ميكرولتر من محلول التحلل ، مدقة الغسيل B. انقل التجانس (1.9 مل) إلى أنبوب مستدير القاع سعة 2 مل.
    4. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 1.5 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الأنسجة والأوعية الدموية غير المنفصلة14. يحتوي الطافي على النوى. تجاهل بيليه الأنسجة غير المنفصلة.
    5. بعد ترطيب مصفاة خلية 30 ميكرومتر مسبقا مع 100 ميكرولتر من محلول التحلل ، وقم بتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد ذلك، انقل الخليط الذي يحتوي على النوى إلى أنبوب مستدير القاع سعة 2 مل.
    6. قم بطرد العينة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. تحتوي الحبيبات على نوى.
    7. أعد تعليق الحبيبات النووية في 250 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج البارد عن طريق الدوامة لفترة وجيزة بسرعة معتدلة إلى عالية. ارفع مستوى الصوت إلى 1.75 مل بإضافة 1.5 مل من المخزن المؤقت للتحلل. تخلط برفق ، وتوضع المعلق النووي على الجليد لمدة 5 دقائق.
    8. حبيبات النوى عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات النووية. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مخزن تخزين الجليد البارد ، ودوامة لفترة وجيزة لإعادة تعليق الحبيبات النووية بالكامل.
    9. احتفظ بنسبة 10٪ من الحبيبات المعاد تعليقها (20 ميكرولتر) كعينة نوى مدخلات للتحليلات النهائية.
    10. خذ حبيبات النوى المعاد تعليقها ، وقم بتعويض الحجم إلى 2.0 مل مع NPB المثلج. تابع عزل النوى المصنفة باستخدام طريقة التنقية القائمة على التقارب INTACT.
  3. عزل النوى الموسومة في أنواع معينة من الخلايا (INTACT)
    1. دوامة حبات الستربتافيدين في القارورة لمدة 30 ثانية بسرعة متوسطة لضمان إعادة استخدامها بالكامل. أضف 30 ميكرولتر من الخرز المعاد تعليقه لكل عينة في أنبوب مستدير القاع سعة 2 مل (يمكن غسل الخرز لما يصل إلى 10 عينات في أنبوب واحد) ، وأضف 1 مل من NPB ، وأعد تعليقه جيدا عن طريق الماصة.
    2. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز. تخلص من المادة الطافية ، وأزل الأنبوب من المغناطيس. أعد تعليق الحبيبات المغناطيسية المغسولة في 1 مل من NPB.
    3. كرر خطوة الغسيل لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخرز في الحجم الأولي ل NPB (30 ميكرولتر لكل عينة).
    4. أضف 30 ميكرولتر من الخرز المغسول إلى المعلق النووي سعة 2 مل من الخطوة 2.2.10. أعد تعليق خليط نوى الخرز جيدا عن طريق سحب الأنبوب وقلبه برفق.
    5. ضع الأنابيب على خلاط دوار في غرفة باردة أو ثلاجة لمدة 30 دقيقة بسرعة منخفضة. احتضان عينات الإدخال بدون خرز في نفس الظروف.
    6. ضع الأنابيب مع التعليق النووي والخرز على المغناطيس ، وافصل النوى البيوتينيلامية المرتبطة بخرز الستربتافيدين (الجزء الموجب) عن الجزء السالب من النوى. اترك الخرزات تنفصل على المغناطيس لمدة 3 دقائق.
    7. قم بإزالة المادة الطافية ، ومرر الجزء السالب إلى أنبوب جديد سعة 2.0 مل ، واحتفظ به على الجليد. لكل أنبوب كسر موجب ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأعد تعليق المحتويات في 1 مل من NPB.
    8. ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة 1 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية. أخرج الأنبوب من المغناطيس ، وأعد تعليق خليط نوى الخرزة المغسولة في 1 مل من NPB.
    9. كرر الخطوة 2.3.8 لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الانتهاء من ثلاث غسلات ، أعد تعليق خليط نوى حبة الكسر الموجب في 30 ميكرولتر من NPB.
    10. لكل أنبوب كسر سالب ، قم بطرد مركزي التعليق النووي من الخطوة 2.3.7 عند 500 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية وتجاهل طاف . أعد تعليق حبيبات نوى الكسر السالب في 30 ميكرولتر من NPB.
    11. قم بتخزين النوى من المدخلات (الخطوة 2.2.9) ، والكسر السالب (الخطوة 2.3.10) ، والكسر الموجب (الخطوة 2.3.9) في مجمد -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لعزل الحمض النووي النووي أو الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: لا ينبغي تجميد النوى للبروتوكولات التي تتطلب نوى سليمة كمدخلات (أي مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة الترانسبوزاز ، الترسيب المناعي للكروماتين).

3. عزل mRNA من أنواع خلايا المبيض المحددة

  1. تحضير المخازن المؤقتة
    1. قاعدة عازلة TRAP: تحضير 100 مل من القاعدة العازلة TRAP من خلال الجمع بين 78.8 مل من الماء الخالي من RNase ، و 5 مل من 1 M Tris-HCl (التركيز النهائي: 50 mM Tris [pH 7.5]) ، 5 مل من 2 M KCl (100 mM KCl) ، 1.2 مل من 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) ، و 10 مل من 10٪ NP-40 (1٪ NP-40). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    2. قاعدة عازلة عالية الملح: تحضير 100 مل من قاعدة عازلة عالية الملح من خلال الجمع بين 68.8 مل من الماء الخالي من RNase ، و 5 مل من 1 M Tris-HCl (التركيز النهائي: 50 mM Tris [pH 7.5]) ، 15 مل من 2 M KCl (300 mM KCl) ، 1.2 مل من 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) ، و 10 مل من 10٪ NP-40 (1٪ NP-40). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    3. مخزن التجانس TRAP (كامل): تحضير 1.5 مل لكل عينة في يوم جمع الأنسجة. تحضير 10 مل من محلول التجانس TRAP عن طريق الجمع بين 10 مل من قاعدة عازلة TRAP (من الخطوة 3.1.1) مع 10 ميكرولتر من 100 مجم / مل سيكلوهيكسيميد (التركيز النهائي: 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد) ، 10 ملغ من هيبارين الصوديوم (1 ملغ / مل هيبارين الصوديوم) ، 20 ميكرولتر من 0.5 M DTT (1 mM DTT) ، 50 ميكرولتر من مثبط RNase 40 U / μL (مثبط RNase 200 U / mL RNase) ، 200 ميكرولتر من 0.1 M السبيرميدين (2 mM السبيرميدين) ، وقرص واحد مثبط للبروتياز خال من EDTA (1x).
    4. محلول غسيل قليل الملح (كامل): اصنع 1.5 مل لكل عينة في يوم جمع الأنسجة. لعمل 10 مل من محلول الغسيل منخفض الملح ، ادمج 10 مل من القاعدة العازلة TRAP (من الخطوة 3.1.1) مع 10 ميكرولتر من 100 مجم / مل سيكلوهيكسيميد (100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد) و 20 ميكرولتر من 0.5 متر DTT (1 مللي متر DTT).
    5. المخزن المؤقت عالي الملح (كامل): اصنع 1.5 مل لكل عينة في اليوم الثاني من عزل TRAP. لصنع 10 مل من محلول الغسيل عالي الملح ، ادمج 10 مل من القاعدة العازلة عالية الملح (من الخطوة 3.1.2) مع 10 ميكرولتر من 100 مجم / مل سيكلوهيكسيميد و 20 ميكرولتر من 0.5 متر DTT.
  2. إجراء ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP)
    1. اجمع المبيض الآخر من ماوس Cyp17-NuTRAP (أو غيره من Cre-NuTRAP ذي الصلة) وضعه في أنبوب خال من RNase سعة 1.5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من محلول تجانس TRAP البارد (من الخطوة 3.1.3). اقطع المبيض إلى ثمانية أجزاء داخل المخزن المؤقت باستخدام مقص صغير ذاتي الفتح.
    2. استخدم أطراف عريضة التجويف لنقل المبيض و 100 ميكرولتر من محلول التجانس إلى خالط Dounce الزجاجي. تجانس 10x-20x مع المدقة السائبة A. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجانس TRAP ، مدقة الغسيل A.
    3. انقل المجانس إلى أنبوب مستدير القاع سعة 2 مل. اغسل خالط Dounce ب 1 مل إضافية من محلول التجانس TRAP ، وانقل الحجم المغسول إلى الأنبوب المستدير القاع سعة 2 مل.
    4. جهاز الطرد المركزي المجانس عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية التي تم تطهيرها إلى أنبوب جديد مستدير القاع سعة 2 مل. تخلص من الحبيبات.
    5. انقل 100 ميكرولتر من التجانس الذي تم تطهيره إلى أنبوب جديد مستدير القاع سعة 2 مل ، واحتفظ به كمدخل على الجليد.
    6. احتضان ما تبقى من التجانس الذي تم تطهيره (من الخطوة 3.2.4) بجسم مضاد ل GFP (5 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية أثناء الدوران من طرف إلى طرف. احتضان عينة الإدخال في نفس الظروف.
    7. في آخر 15 دقيقة من الحضانة ، اغسل حبات البروتين G المغناطيسية في محلول الغسيل منخفض الملح باستخدام الخطوات التالية (3.2.8-3.2.11).
    8. دوامة قارورة من الخرز المغناطيسي البروتين G لمدة 30 ثانية لإنعاش تماما. انقل 50 ميكرولتر من حبات البروتين G المغناطيسية لكل عينة (يمكن غسل ما يصل إلى 10 عينات في أنبوب واحد) في أنبوب مستدير القاع سعة 2 مل.
    9. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل قليل الملح إلى الخرز ، وماصة برفق للخلط. ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة لجمع الخرز على جانب الأنبوب. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
    10. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي ، وأضف 1 مل من محلول الغسيل منخفض الملح إلى الأنبوب. ماصة بلطف لخلط. ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة لجمع الخرز على جانب الأنبوب. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
    11. كرر الخطوة 3.2.10 لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي ، وأعد تعليق الحبيبات في الحجم الأولي لمخزن الغسيل منخفض الملح (50 ميكرولتر لكل عينة).
    12. انقل الخرزات المغسولة المعاد تعليقها (50 ميكرولتر) إلى عينة المستضد / خليط الأجسام المضادة ، واحتضانها عند 4 درجات مئوية طوال الليل أثناء الدوران في خلاط طرفي. احتضان عينات الإدخال التي تدور من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية طوال الليل للحفاظ على ظروف مكافئة.
    13. بعد الحضانة الليلية ، قم بإزالة الأنابيب من الدوار ، وافصل الحبيبات المغناطيسية مع الريبوسومات المستهدفة / الحمض النووي الريبي (الجزء الموجب) من المادة الطافية (الكسر السالب) باستخدام الحامل المغناطيسي لمدة 2.5-3 دقائق. نضح الجزء السالب ، وضعه في أنبوب جديد مستدير القاع سعة 2 مل ، وضعه جانبا على الثلج أثناء معالجة الكسر الموجب.
    14. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل عالي الملح (من الخطوة 3.1.5) إلى الأنبوب مع الجزء الموجب ، وماصة برفق للخلط. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي يتم الاحتفاظ به على الثلج لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز. تخلص من المادة الطافية ، وأزل الأنبوب من المغناطيس.
    15. كرر الخطوة 3.2.14 لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي المكمل ب 3.5 ميكرولتر من 2-ميركابتوإيثانول (BME). احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة أثناء الخلط لمدة 10 دقائق عند 900 دورة في الدقيقة في شاكر رقمي.
    16. افصل الخرزات عن المحلول الذي يحتوي الآن على الريبوسومات / الحمض النووي الريبي المستهدف مع حامل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اجمع الكسر الموجب المستخلص (طاف) في أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وأضف 350 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. عكس لخلط. انتقل إلى عزل الحمض النووي الريبي.
    17. اختياري: لعزل الحمض النووي الريبي من عينة الإدخال (الخطوة 3.2.5) والكسر السالب (الخطوة 3.2.13) ، انقل 100 ميكرولتر من الكسور المدخلة والسالبة إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل. أضف 350 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي المكمل ب 3.5 ميكرولتر من BME لكل عينة. عكس لخلط. أضف 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى كل أنبوب ، واقلبه للخلط. انتقل إلى عزل الحمض النووي الريبي.
  3. عزل الحمض النووي الريبي
    1. نقل 700 ميكرولتر من الكسر الموجب ، واختياريا ، الإدخال و / أو الكسر السالب إلى عمود دوران الحمض النووي الريبي. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي من عمود الدوران.

النتائج

يظهر رسم تخطيطي لبروتوكولات TRAP و INTACT في الشكل 1. هنا يتم توضيح خصوصية نموذج الماوس Cyp17-NuTRAP لخلايا انسجة المبيض / الثيكا من خلال التصوير المناعي و RNA-Seq من الحمض النووي الريبي المعزول TRAP. أولا ، تم إجراء التصوير المناعي لإشارة eGFP في المبيض وتوطين إشارة eGFP إلى الخلايا اللحمية وا?...

Discussion

نموذج الماوس NuTRAP6 هو نهج قوي لوضع العلامات المعدلة وراثيا للاستجواب المزدوج للنسخ و epigenome من أنواع معينة من الخلايا التي يمكن تكييفها مع أي نوع من الخلايا مع برنامج تشغيل Cre متاح. هنا ، نوضح خصوصية نموذج الماوس Cyp17-NuTRAP في استهداف خلايا المبيض والخلايا اللحمية. يمكن استخدام نموذ?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01AG070035 ، R01AG069742 ، T32AG052363) ، مؤسسة BrightFocus (M2020207) ، ومؤسسة الصحة المشيخية. تم دعم هذا العمل جزئيا أيضا من خلال جائزة MERIT I01BX003906 وجائزة برنامج تقييم المعدات المشتركة (ShEEP) ISIBX004797 من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) وزارة شؤون المحاربين القدامى ، خدمة البحث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا مركز الجينوم السريري (OMRF) ومرفق التصوير الأساسي (OMRF) على المساعدة واستخدام الأدوات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M SpermidineSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CycloheximideSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
30 µm cell strainer Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
anti-GFP antibodyAbcamAb290For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLTQiagen79216RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tabletRoche11836170001For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse modelThe Jackson Laboratory28547B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnetInvitrogen12321D
Genotyping PrimersIDTCustomGeneric Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
      Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
      NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X)Thermo Scientific1861278For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 µm bead diameter
MixMateEppendorf5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP mouse modelThe Jackson Laboratory29899B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh FormatThermo ScientificA39255
Protein G DynabeadsThermoFisher10004DFor TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Sodium HeparinFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
VWR Tube RotatorFisher ScientificNC9854190

References

  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved