Zellspezifische paarweise Abfrage des Ovarialepigenoms und des Transkriptoms der Maus

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wurden die translatierende Ribosomenaffinitätsreinigungsmethode (TRAP) und die Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert wurden (INTACT), für die paarweise Abfrage des zellspezifischen ovariellen Transkriptoms und Epigenoms unter Verwendung des NuTRAP-Mausmodells, das mit einer Cyp17a1-Cre-Mauslinie gekreuzt wurde, optimiert.

Zusammenfassung

Die Beurteilung zelltypspezifischer epigenomischer und transkriptomischer Veränderungen ist der Schlüssel zum Verständnis der Ovarialalterung. Zu diesem Zweck wurde die Optimierung der translatierenden Ribosomenaffinitätsreinigungsmethode (TRAP) und die Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind (INTACT), für die anschließende paarweise Abfrage des zellspezifischen ovariellen Transkriptoms und Epigenoms unter Verwendung eines neuartigen transgenen NuTRAP-Mausmodells durchgeführt. Die Expression des NuTRAP-Allels wird von einer gefloxten STOP-Kassette kontrolliert und kann mit Hilfe von Promotor-spezifischen Cre-Linien auf bestimmte ovarielle Zelltypen ausgerichtet werden. Da neuere Studien darauf hindeuten, dass ovarielle Stromazellen für die Entstehung vorzeitiger Alterungsphänotypen verantwortlich sind, wurde das NuTRAP-Expressionssystem mit einem Cyp17a1-Cre-Treiber auf Stromazellen ausgerichtet. Die Induktion des NuTRAP-Konstrukts war spezifisch für ovarielle stromale Fibroblasten, und es wurden ausreichend DNA und RNA für Sequenzierungsstudien aus einem einzigen Eierstock gewonnen. Das hier vorgestellte NuTRAP-Modell und die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um jeden ovariellen Zelltyp mit einer verfügbaren Cre-Linie zu untersuchen.

Einleitung

Die Eierstöcke spielen eine wichtige Rolle beim somatischen Altern¹, wobei bestimmte Zellpopulationen unterschiedliche Beiträge leisten. Die zelluläre Heterogenität des Eierstocks macht es schwierig, molekulare Ergebnisse aus Bulk-Tests für den gesamten Eierstock zu interpretieren. Das Verständnis der Rolle bestimmter Zellpopulationen bei der Alterung der Eierstöcke ist der Schlüssel zur Identifizierung der molekularen Treiber, die für die Fruchtbarkeit und den Gesundheitsverlust bei älteren Frauen verantwortlich sind. Traditionell wurde die Multi-Omics-Bewertung spezifischer Ovarialzelltypen durch Techniken wie Lasermikrodissektion², Einzelzellansätze³ oder Zellsortierung⁴ erreicht. Die Mikrodissektion kann jedoch teuer und schwierig durchzuführen sein, und die Zellsortierung kann zelluläre phänotypische Profile verändern⁵.

Ein neuartiger Ansatz zur Bewertung von ovariellen Zelltyp-spezifischen epigenomischen und transkriptomischen Profilen verwendet das NuTRAP-Mausmodell (NuTRAP) zur Markierung und Translation der Ribosomenaffinitätsreinigung. Das NuTRAP-Modell ermöglicht die Isolierung von zelltypspezifischen Nukleinsäuren, ohne dass eine Zellsortierung erforderlich ist, indem die Methoden der Affinitätsreinigung verwendet werden: Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP) und Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind (INTACT)⁶. Die Expression des NuTRAP-Allels wird von einer gefloxten STOP-Kassette kontrolliert und kann mit Hilfe von Promotor-spezifischen Cre-Linien auf bestimmte ovarielle Zelltypen ausgerichtet werden. Durch die Kreuzung der NuTRAP-Maus mit einer zelltypspezifischen Cre-Linie bewirkt die Entfernung der STOP-Kassette eine eGFP-Markierung des ribosomalen Komplexes und eine Biotin/mCherry-Markierung des Zellkerns in Cre-abhängiger Weise⁶. Die TRAP- und INTACT-Techniken können dann verwendet werden, um mRNA und Kern-DNA aus dem interessierenden Zelltyp zu isolieren und zu transkriptomischen und epigenomischen Analysen überzugehen.

Das NuTRAP-Modell wurde in verschiedenen Geweben wie Fettgewebe⁶, Hirngewebe ^7,8,9 und der Netzhaut¹⁰ verwendet, um zelltypspezifische epigenomische und transkriptomische Veränderungen aufzudecken^, die in Ganzgewebehomogenaten möglicherweise nicht nachgewiesen werden können. Zu den Vorteilen des NuTRAP-Ansatzes gegenüber herkömmlichen Zellsortiertechniken gehören die folgenden: 1) die Vermeidung von Ex-vivo-Aktivierungsartefakten ⁸, 2) der minimierte Bedarf an spezialisierten Geräten (z. B. Zellsortierern) und 3) der erhöhte Durchsatz und die geringeren Kosten für zelltypspezifische Analysen. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, zelltypspezifische DNA und RNA aus einer einzigen Maus zu isolieren, paarweise Analysen, die die statistische Aussagekraft erhöhen. Da neuere Studien gezeigt haben, dass ovarielle Stromazellen für die vorzeitige Alterung der Phänotypen^11,12,13 verantwortlich sind^, haben wir das NuTRAP-Expressionssystem mit einem Cyp17a1-Cre-Treiber auf Stroma- und Thekazellen ausgerichtet. In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Induktion des NuTRAP-Konstrukts spezifisch für ovarielle Stroma- und Thekazellen ist und dass genügend DNA und RNA für Sequenzierungsstudien aus einem einzigen Eierstock gewonnen werden. Das NuTRAP-Modell und die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um jeden ovariellen Zelltyp mit jeder verfügbaren Cre-Linie zu untersuchen.

Für die Generierung einer zelltypspezifischen ovariellen NuTRAP-Mauslinie verfügt das NuTRAP-Allel über ein floxiertes STOP-Codon, das die Expression von BirA, Biotin-Ligase-Erkennungspeptid (BLRP)-markiertem mCherry/mRANGAP1 und eGFP/L10a kontrolliert. Bei Kreuzung mit einer zelltypspezifischen Cre-Linie markiert die Expression der NuTRAP-Kassette das nukleäre Protein mRANGAP1 mit Biotin/mCherry und das ribosomale Protein L10a mit eGFP in Cre-abhängiger Weise. Dies ermöglicht die Isolierung von Zellkernen und mRNA aus bestimmten Zelltypen, ohne dass eine Zellsortierung erforderlich ist. Um dies zu beurteilen, kann der^{NuTRAP flox/flox} mit einem zelltypspezifischen Cre gepaart werden, das für ovarielle Zelltypen relevant ist.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF) genehmigt. Elternmäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) gekauft und unter SPF-Bedingungen in einer HEPA-Barriereumgebung in einem 14 h/10 h Hell/Dunkel-Zyklus (Licht an um 6:00 Uhr morgens) im OMRF gezüchtet und untergebracht.

HINWEIS: In dieser Demonstration verwenden wir einen Cyp17iCre^+/−(Stamm # 028547, The Jackson Laboratory) männlich gepaart mit einem NuTRAP-Weibchen (Stamm # 029899, The Jackson Laboratory). Die gewünschten Cyp17-NuTRAP-Nachkommen (Cyp17iCre^+/−; NuTRAP^flox/WT) wird das NuTRAP-Allel unter der Kontrolle des Cyp17a1-Promotors in ovariellen Stromazellen exprimieren. Für diese Manuskriptvorbereitung verwendeten wir 4 Monate alte weibliche Cyp17-NuTRAP-Mäuse (n = 4). DNA wurde aus Ohrstanzproben von Mäusen extrahiert, um die Genotypisierung zu bestätigen, um die Vererbung der Cyp17iCre- und NuTRAP-Transgene zu bestätigen, und für den PCR-Nachweis von 1) generischem Cre, 2) Cyp17iCre und 3) NuTRAP floxed unter Verwendung der in der Materialtabelle aufgeführten Primer, wie zuvor beschrieben ^7,8.

1. Ovarialdissektion der Maus

1. Führen Sie die Euthanasie der Maus gemäß den Tierpflegerichtlinien und der Genehmigung der Einrichtung durch, gefolgt von der Entnahme der Eierstöcke.
2. Präparieren Sie die Eierstöcke, um Fettgewebe oder Teile der Eileiter zu entfernen, die mit dem Eierstockgewebe verbunden sein könnten, bevor Sie die Eierstöcke in Eileiter mit Puffer legen. Fahren Sie sofort mit TRAP- oder INTACT-Techniken fort.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde nicht für die Verwendung mit gefrorenem Gewebe optimiert. Die Verwendung eines Eierstocks derselben Maus für jede Technik wird für zukünftige statistische Analysen empfohlen.

2. Isolierung von Zellkernen aus bestimmten Ovarialzelltypen

1. Vorbereitung des Puffers
   1. Kernreinigungspuffer (NPB): Zur Herstellung von 100 ml NPB werden 2 ml 1 M HEPES (Endkonzentration: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA) kombiniert. und 92,2 ml nukleasefreies Wasser. Supplementierung mit 1x Proteasehemmer am Tag der Zellkernisolierung.
      HINWEIS: NPB kann ohne den Proteasehemmer im Voraus hergestellt werden und ist bei 4 °C bis zu 3 Wochen haltbar.
   2. Kernlysepuffer (komplett): Ergänzen Sie den Kernlysepuffer mit 1x Proteasehemmer am Tag der Zellkernisolierung.
2. Herstellung der Kernsuspension
   Anmerkungen: Die Proben sollten immer auf Eis aufbewahrt werden, sofern nicht anders angegeben.
   1. Entnahme eines Eierstocks von einer Cyp17-NuTRAP-Maus (oder einem anderen relevanten Cre-NuTRAP) in 500 μl Zellkernlysepuffer (vollständig). Hacken Sie den Eierstock innerhalb des Puffers mit einer selbstöffnenden Mikroschere in acht Teile.
   2. Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breitem Bohrungsdurchmesser, um den gehackten Eierstock und 500 μl Lysepuffer in einen Dounce-Homogenisator aus Glas auf Eis zu überführen. Homogenisieren Sie den Eierstock 10x-20x mit dem losen Stößel A. Geben Sie 400 μl Lysepuffer in den Dounce-Homogenisator und waschen Sie den Stößel A.
   3. Homogenisieren Sie den Fruchtknoten mit dem festen Stößel B 10x-20x. Fügen Sie 1.000 μl Lysepuffer hinzu und waschen Sie den Stößel B. Übertragen Sie das Homogenat (1,9 ml) in ein 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden.
   4. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 1,5 min bei 4 °C, um nicht dissoziiertes Gewebe und Blutgefäße zu entfernen¹⁴. Der Überstand enthält die Kerne; Verwerfen Sie das Pellet aus nicht dissoziiertem Gewebe.
   5. Nach dem Vorbenetzen wird ein 30 μm Zellsieb mit 100 μl Lysepuffer benetzt und der Überstand durch das Zellsieb in ein 15 mL konisches Röhrchen filtriert. Übertragen Sie dann das kernhaltige Gemisch in ein 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden.
   6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 5 min bei 4 °C und verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet enthält Kerne.
   7. Resuspendieren Sie das Kernpellet in 250 μl eiskaltem Lysepuffer, indem Sie es kurz bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit vortexen. Erhöhen Sie das Volumen auf 1,75 ml, indem Sie 1,5 ml Lysepuffer hinzufügen. Vorsichtig mischen und die Kernsuspension 5 Minuten auf Eis ruhen lassen.
   8. Die Zellkerne werden durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Kernpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl eiskaltem Lagerpuffer und wirbeln Sie kurz, um das Kernpellet vollständig zu resuspendieren.
   9. Reservieren Sie 10 % des resuspendierten Pellets (20 μl) als Eingangskernprobe für nachgeschaltete Analysen.
   10. Nehmen Sie das resuspendierte Zellkernpellet und füllen Sie das Volumen mit eiskaltem NPB auf 2,0 ml. Fahren Sie mit der Isolierung der markierten Kerne mit der affinitätsbasierten Aufreinigungsmethode INTACT fort.
3. Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind (INTACT)
   1. Wirbeln Sie die Streptavidin-Kügelchen 30 s lang bei mittlerer Geschwindigkeit in die Durchstechflasche, um sicherzustellen, dass sie vollständig resuspendiert sind. Geben Sie 30 μl resuspendierte Beads für jede Probe in ein 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden (Beads für bis zu 10 Proben können in einem einzigen Röhrchen gewaschen werden), fügen Sie 1 mL NPB hinzu und resuspendieren Sie sie durch Pipettieren.
   2. Legen Sie das Röhrchen für 1 Minute auf das Magnetgestell, um die Perlen zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten. Resuspendieren Sie die gewaschenen magnetischen Beads in 1 ml NPB.
   3. Wiederholen Sie den Waschschritt für insgesamt drei Wäschen. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Beads im ursprünglichen NPB-Volumen (30 μl pro Probe).
   4. Geben Sie 30 μl der gewaschenen Kügelchen in die 2-ml-Kernsuspension aus Schritt 2.2.10. Resuspendieren Sie das Perlen-Kern-Gemisch gut, indem Sie das Röhrchen pipettieren und vorsichtig invertieren.
   5. Legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit auf einen rotierenden Mischer in einem Kühlraum oder Kühlschrank. Inkubieren Sie die Eingangsproben ohne Beads unter den gleichen Bedingungen.
   6. Legen Sie die Röhrchen mit der Kernsuspension und den Kügelchen auf den Magneten und trennen Sie die biotinylierten Kerne, die an Streptavidin-Kügelchen (positive Fraktion) gebunden sind, von der negativen Fraktion der Kerne. Lassen Sie die Perlen 3 Minuten lang auf dem Magneten trennen.
   7. Entfernen Sie den Überstand, geben Sie die negative Fraktion in ein frisches 2,0-ml-Röhrchen und bewahren Sie sie auf Eis auf. Entfernen Sie für jedes Röhrchen mit positiver Fraktion das Röhrchen vom Magneten und resuspendieren Sie den Inhalt in 1 ml NPB.
   8. Setzen Sie das Röhrchen für 1 Minute auf den Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten und resuspendieren Sie das gewaschene Perlen-Kern-Gemisch in 1 ml NPB.
   9. Wiederholen Sie Schritt 2.3.8 für insgesamt drei Wäschen. Nach Abschluss von drei Waschgängen wird das Bead-Kern-Gemisch mit positiver Fraktion in 30 μl NPB resuspendiert.
   10. Für jedes Röhrchen mit negativer Fraktion wird die Kernsuspension aus Schritt 2.3.7 bei 500 x g für 7 min bei 4 °C zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn. Resuspendieren Sie das Kernpellet mit negativer Fraktion in 30 μl NPB.
   11. Die Kerne aus der Eingabe (Schritt 2.2.9), der negativen Fraktion (Schritt 2.3.10) und der positiven Fraktion (Schritt 2.3.9) werden in einem Gefrierschrank bei −80 °C gelagert, bis sie für die Isolierung der Kern-DNA oder RNA bereit sind.
       HINWEIS: Die Zellkerne sollten nicht für Protokolle eingefroren werden, die intakte Kerne als Eingabe erfordern (z. B. Assay für Transposase-zugängliches Chromatin, Chromatin-Immunpräzipitation).

3. Isolierung von mRNA aus bestimmten Ovarialzelltypen

1. Vorbereiten der Puffer
   1. TRAP-Pufferbasis: Bereiten Sie 100 ml TRAP-Pufferbasis vor, indem Sie 78,8 ml RNase-freies Wasser, 5 ml 1 M Tris-HCl (Endkonzentration: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 ml 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 ml 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl₂) und 10 ml 10 % NP-40 (1 % NP-40) kombinieren. Bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
   2. Pufferbasis mit hohem Salzgehalt: Bereiten Sie 100 ml Pufferbasis mit hohem Salzgehalt vor, indem Sie 68,8 ml RNase-freies Wasser, 5 ml 1 M Tris-HCl (Endkonzentration: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl₂) und 10 ml 10 % NP-40 (1 % NP-40) kombinieren. Bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
   3. TRAP-Homogenisierungspuffer (komplett): Bereiten Sie am Tag der Gewebeentnahme 1,5 ml pro Probe vor. 10 ml TRAP-Homogenisierungspuffer werden hergestellt, indem 10 ml TRAP-Pufferbasis (aus Schritt 3.1.1) mit 10 μl 100 mg/ml Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml Cycloheximid), 10 mg Natriumheparin (1 mg/ml Natriumheparin), 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μl 40 U/μl RNase-Inhibitor (200 U/ml RNase-Inhibitor) kombiniert werden. 200 μL 0,1 M Spermidin (2 mM Spermidin) und eine EDTA-freie Protease-Inhibitor-Tablette (1x).
   4. Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt (vollständig): Stellen Sie am Tag der Gewebeentnahme 1,5 ml pro Probe her. Um 10 ml salzarmen Waschpuffer herzustellen, werden 10 ml TRAP-Pufferbasis (aus Schritt 3.1.1) mit 10 μl 100 mg/ml Cycloheximid (100 μg/ml Cycloheximid) und 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT) kombiniert.
   5. Waschpuffer mit hohem Salzgehalt (vollständig): Stellen Sie am zweiten Tag der TRAP-Isolierung 1,5 ml pro Probe her. Um 10 ml Waschpuffer mit hohem Salzgehalt herzustellen, werden 10 ml Pufferbasis mit hohem Salzgehalt (aus Schritt 3.1.2) mit 10 μl 100 mg/ml Cycloheximid und 20 μl 0,5 M DTT kombiniert.
2. Durchführen einer translatierenden Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP)
   1. Entnehmen Sie den anderen Eierstock von einer Cyp17-NuTRAP-Maus (oder einem anderen relevanten Cre-NuTRAP) und legen Sie ihn in ein 1,5-ml-RNase-freies Röhrchen mit 100 μl eiskaltem TRAP-Homogenisierungspuffer (aus Schritt 3.1.3). Hacken Sie den Eierstock innerhalb des Puffers mit einer selbstöffnenden Mikroschere in acht Teile.
   2. Verwenden Sie Spitzen mit breitem Durchgang, um den Eierstock und 100 μl Homogenisierungspuffer in einen Dounce-Homogenisator aus Glas zu geben. Homogenisieren Sie 10x-20x mit dem losen Stößel A. Fügen Sie 400 μl TRAP-Homogenisierungspuffer hinzu und waschen Sie Stößel A.
   3. Übertragen Sie das Homogenat in ein 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden. Waschen Sie den Dounce-Homogenisator mit zusätzlich 1 ml TRAP-Homogenisierungspuffer und füllen Sie das gewaschene Volumen in das 2-ml-Rundbodenröhrchen.
   4. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie den gereinigten Überstand in ein frisches 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden. Entsorgen Sie das Pellet.
   5. 100 μl des geklärten Homogenats werden in ein frisches 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden umgefüllt und als Input auf Eis aufbewahrt.
   6. Der Rest des geklärten Homogenats (ab Schritt 3.2.4) wird mit einem Anti-GFP-Antikörper (5 μg/ml) 1 h lang bei 4 °C inkubiert, während das Ende über das Ende gedreht wird. Inkubieren Sie die Eingangsprobe unter den gleichen Bedingungen.
   7. In den letzten 15 Minuten der Inkubation werden die magnetischen Protein-G-Kügelchen im salzarmen Waschpuffer mit den folgenden Schritten (3.2.8-3.2.11) gewaschen.
   8. Wirbeln Sie das Fläschchen mit den magnetischen Protein-G-Kügelchen für 30 s vor, um es vollständig zu resuspendieren. Übertragen Sie 50 μl der magnetischen Beads des Proteins G für jede Probe (bis zu 10 Proben können in einem Röhrchen gewaschen werden) in ein 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden.
   9. Fügen Sie den Kügelchen 500 μl Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt hinzu und pipettieren Sie sie vorsichtig, um sie zu mischen. Legen Sie die Röhre für 1 Minute in einen magnetischen Ständer, um die Perlen an der Seite der Röhre zu sammeln. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
   10. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer und geben Sie 1 ml salzarmen Waschpuffer in das Röhrchen. Zum Mischen vorsichtig pipettieren. Legen Sie die Röhre für 1 Minute in einen magnetischen Ständer, um die Perlen an der Seite der Röhre zu sammeln. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
   11. Wiederholen Sie Schritt 3.2.10 für insgesamt drei Wäschen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche das Röhrchen aus dem Magnetgestell und resuspendieren Sie die Beads im ursprünglichen Volumen des salzarmen Waschpuffers (50 μl pro Probe).
   12. Die resuspendierten gewaschenen Kügelchen (50 μl) werden in das Antigenproben-/Antikörpergemisch überführt und über Nacht bei 4 °C inkubiert, während sie in einem End-to-End-Mischer rotieren. Inkubieren Sie die Eingangsproben über Nacht bei 4 °C, um gleichwertige Bedingungen aufrechtzuerhalten.
   13. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht die Röhrchen aus dem Rotator und trennen Sie die magnetischen Beads mit den Zielribosomen/RNA (positive Fraktion) mit dem Magnetständer für 2,5-3 Minuten vom Überstand (negative Fraktion). Saugen Sie die negative Fraktion an, geben Sie sie in ein frisches 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden und legen Sie sie auf Eis beiseite, während Sie die positive Fraktion verarbeiten.
   14. 500 μl Waschpuffer mit hohem Salzgehalt (ab Schritt 3.1.5) in das Röhrchen mit der positiven Fraktion geben und vorsichtig pipettieren, um zu mischen. Legen Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer, der 1 Minute lang auf Eis gehalten wird, um die Perlen zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten.
   15. Wiederholen Sie Schritt 3.2.14 für insgesamt drei Wäschen. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Beads in 350 μl RNA-Lysepuffer, ergänzt mit 3,5 μl 2-Mercaptoethanol (BME). Inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur und mischen Sie sie 10 Minuten lang bei 900 U/min in einem digitalen Shaker.
   16. Trennen Sie die Kügelchen von der Lösung, die nun die Zielribosomen/RNA enthält, mit einem magnetischen Ständer für 1 Minute bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die eluierte positive Fraktion (Überstand) in einem frischen 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 350 μl 100%iges Ethanol hinzu. Zum Mischen umkehren. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort.
   17. Optional: Um RNA aus der Eingangsprobe (Schritt 3.2.5) und der negativen Fraktion (Schritt 3.2.13) zu isolieren, werden 100 μl der Eingangs- und negativen Fraktion in frische 1,5-ml-Röhrchen umgefüllt. Geben Sie 350 μl RNA-Lysepuffer, ergänzt mit 3,5 μl BME, zu jeder Probe. Zum Mischen umkehren. Geben Sie 250 μl 100%iges Ethanol in jedes Röhrchen und drehen Sie es um, um es zu mischen. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort.
3. RNA-Isolierung
   1. Übertragen Sie 700 μL der positiven Fraktion und optional der Eingangs- und/oder negativen Fraktion in eine RNA-Spinsäule. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um RNA aus der Spinsäule zu isolieren.

Ergebnisse

Eine schematische Darstellung der Protokolle TRAP und INTACT ist in Abbildung 1 dargestellt. In dieser Arbeit wird die Spezifität des Cyp17-NuTRAP-Mausmodells für ovarielle Stroma/Theca-Zellen mittels Immunfluoreszenzbildgebung und RNA-Seq aus TRAP-isolierter RNA demonstriert. Zunächst wurde eine Immunfluoreszenzbildgebung des eGFP-Signals im Ovar und die Lokalisation des eGFP-Signals in den Theka- und Stromazellen durchgeführt. Kurz gesagt wurden 5 μm Schnitte mit einem Xylol- und Etha...

Diskussion

Das NuTRAP-Mausmodell⁶ ist ein leistungsfähiger transgener Markierungsansatz für die paarweise Abfrage des Transkriptoms und des Epigenoms von spezifischen Zelltypen, die mit einem verfügbaren Cre-Treiber an jeden Zelltyp angepasst werden können. In dieser Arbeit demonstrieren wir die Spezifität des Cyp17-NuTRAP-Mausmodells bei der Ausrichtung auf Ovarial-, Theka- und Stromazellen. Das Cyp17-NuTRAP-Modell kann verwendet werden, um die theka- und stromazellspezifischen epigenetischen Mechanism...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Spermidine	Sigma-Aldrich	05292-1ML-F
1 M MgCl2	Thermo Scientific	AM9530G
10% NP-40	Thermo Scientific	85124
100 mg/mL Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C4859-1ML
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
30 µm cell strainer	Miltenyi Biotec	130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
anti-GFP antibody	Abcam	Ab290	For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLT	Qiagen	79216	RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet	Roche	11836170001	For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse model	The Jackson Laboratory	28547	B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	12321D
Genotyping Primers	IDT	Custom	Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
			Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
			NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X)	Thermo Scientific	1861278	For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads	Invitrogen	11205D	2.8 µm bead diameter
MixMate	Eppendorf	5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	Nuc101	Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPES	Gibco	15630-080
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9760G
2M KCl	Thermo Scientific	AM9640G
0.5 M EDTA	Thermo Scientific	AM9260G
0.5 M EGTA	Fisher Scientific	50-255-956
NuTRAP mouse model	The Jackson Laboratory	29899	B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh Format	Thermo Scientific	A39255
Protein G Dynabeads	ThermoFisher	10004D	For TRAP
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
Sodium Heparin	Fisher Scientific	BP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5	Invitrogen	15567-027
VWR Tube Rotator	Fisher Scientific	NC9854190