Interrogação pareada célula-específica do epigenoma e transcriptoma ovariano de camundongos

Resumo

Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.

Resumo

A avaliação das alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular é fundamental para a compreensão do envelhecimento ovariano. Para este fim, a otimização do método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram realizados para a subsequente interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando um novo modelo transgênico de camundongo NuTRAP. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Uma vez que estudos recentes implicaram células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce, o sistema de expressão NuTRAP foi direcionado para células estromais usando um driver Cyp17a1-Cre. A indução da construção NuTRAP foi específica para fibroblastos estromais ovarianos, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento foram obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com uma linha Cre disponível.

Introdução

Os ovários são os principais atores no envelhecimento somático¹, com contribuições distintas de populações celulares específicas. A heterogeneidade celular do ovário dificulta a interpretação dos resultados moleculares de ensaios volumosos de ovário inteiro. Compreender o papel de populações celulares específicas no envelhecimento ovariano é fundamental para identificar os fatores moleculares responsáveis pelo declínio da fertilidade e da saúde em mulheres idosas. Tradicionalmente, a avaliação multi-ômica de tipos específicos de células ovarianas era realizada por técnicas como microdissecção a laser²

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Camundongos progenitores foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e criados e alojados sob condições de FPS em um ambiente de barreira HEPA em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (luzes acesas às 6:00 horas) na OMRF.

NOTA: Nesta demonstração, usamos um macho Cyp17iCre^+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) emparelhado com uma fêmea NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). A progênie desejada Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre^+/−; NuTRAP^flox/WT

Resultados

Um esquema dos protocolos TRAP e INTACT é mostrado na Figura 1. Aqui, a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP para células estromais/tecais ovarianas é demonstrada por imagem imunofluorescente e RNA-Seq a partir de RNA isolado por TRAP. Primeiramente, foram realizadas imagens de imunofluorescência do sinal da eGFP no ovário e localização do sinal da eGFP para as células da teca e do estromal. Resumidamente, cortes de 5 μm foram desparafinizados com gradiente de xileno .......

Discussão

O modelo de camundongo NuTRAP⁶ é uma poderosa abordagem de marcação transgênica para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma de tipos celulares específicos que podem ser adaptados a qualquer tipo de célula com um driver Cre disponível. Aqui, demonstramos a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP em atingir tecas ovarianas e células estromais. O modelo Cyp17-NuTRAP pode ser usado para elucidar ainda mais os mecanismos epigenéticos específicos da teca e da célula.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Spermidine	Sigma-Aldrich	05292-1ML-F
1 M MgCl2	Thermo Scientific	AM9530G
10% NP-40	Thermo Scientific	85124
100 mg/mL Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C4859-1ML
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
30 µm cell strainer	Miltenyi Biotec	130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
anti-GFP antibody	Abcam	Ab290	For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLT	Qiagen	79216	RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet	Roche	11836170001	For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse model	The Jackson Laboratory	28547	B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	12321D
Genotyping Primers	IDT	Custom	Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
			Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
			NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X)	Thermo Scientific	1861278	For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads	Invitrogen	11205D	2.8 µm bead diameter
MixMate	Eppendorf	5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	Nuc101	Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPES	Gibco	15630-080
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9760G
2M KCl	Thermo Scientific	AM9640G
0.5 M EDTA	Thermo Scientific	AM9260G
0.5 M EGTA	Fisher Scientific	50-255-956
NuTRAP mouse model	The Jackson Laboratory	29899	B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh Format	Thermo Scientific	A39255
Protein G Dynabeads	ThermoFisher	10004D	For TRAP
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
Sodium Heparin	Fisher Scientific	BP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5	Invitrogen	15567-027
VWR Tube Rotator	Fisher Scientific	NC9854190