É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
* Estes autores contribuíram igualmente
Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.
A avaliação das alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular é fundamental para a compreensão do envelhecimento ovariano. Para este fim, a otimização do método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram realizados para a subsequente interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando um novo modelo transgênico de camundongo NuTRAP. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Uma vez que estudos recentes implicaram células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce, o sistema de expressão NuTRAP foi direcionado para células estromais usando um driver Cyp17a1-Cre. A indução da construção NuTRAP foi específica para fibroblastos estromais ovarianos, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento foram obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com uma linha Cre disponível.
Os ovários são os principais atores no envelhecimento somático1, com contribuições distintas de populações celulares específicas. A heterogeneidade celular do ovário dificulta a interpretação dos resultados moleculares de ensaios volumosos de ovário inteiro. Compreender o papel de populações celulares específicas no envelhecimento ovariano é fundamental para identificar os fatores moleculares responsáveis pelo declínio da fertilidade e da saúde em mulheres idosas. Tradicionalmente, a avaliação multi-ômica de tipos específicos de células ovarianas era realizada por técnicas como microdissecção a laser2, abordagens unicelulares3 ou triagem celular4. No entanto, a microdissecção pode ser cara e de difícil execução, e a triagem celular pode alterar o perfil fenotípicocelular5.
Uma nova abordagem para avaliar perfis epigenômicos e transcriptômicos específicos de células ovarianas usa o modelo de camundongo de purificação de afinidade de ribossomo nuclear (NuTRAP). O modelo NuTRAP permite o isolamento de ácidos nucléicos específicos do tipo celular sem a necessidade de triagem celular usando os métodos de purificação por afinidade: tradução da purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT)6. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Ao cruzar o camundongo NuTRAP com uma linha Cre específica do tipo celular, a remoção do STOP causa marcação eGFP do complexo ribossomal e marcação biotina/mCherry do núcleo de maneira dependentede Cre 6. As técnicas TRAP e INTACT podem então ser usadas para isolar o RNAm e o DNA nuclear do tipo celular de interesse e proceder a análises transcriptômicas e epigenômicas.
O modelo NuTRAP tem sido utilizado em diferentes tecidos, como tecido adiposo6, tecido cerebral 7,8,9 e retina10, para revelar alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular que podem não ser detectadas no homogeneizado de tecido total. Os benefícios da abordagem NuTRAP sobre as técnicas tradicionais de classificação celular incluem o seguinte: 1) a prevenção de artefatos de ativação ex vivo 8, 2) a necessidade minimizada de equipamentos especializados (i.e., classificadores celulares) e 3) o aumento do rendimento e a diminuição do custo das análises específicas do tipo celular. Além disso, a capacidade de isolar DNA e RNA específicos do tipo celular de um único camundongo permite análises pareadas que aumentam o poder estatístico. Uma vez que estudos recentes têm implicado células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce 11,12,13, direcionamos o sistema de expressão NuTRAP para células estromais e tecais usando um driver Cyp17a1-Cre. Aqui, demonstramos que a indução da construção NuTRAP é específica para células do estroma ovariano e teca, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento são obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com qualquer linha Cre disponível.
Para a geração de uma linhagem de camundongos NuTRAP ovarianos específicos do tipo celular, o alelo nuclear de marcação e purificação de afinidade do ribossomo (NuTRAP) tem um códon STOP floxado que controla a expressão de BirA, peptídeo de reconhecimento de biotina ligase (BLRP) marcado com mCherry/mRANGAP1 e eGFP/L10a. Quando cruzada com uma linha Cre específica do tipo celular, a expressão do NuTRAP rotula a proteína nuclear mRANGAP1 com biotina/mCherry e a proteína ribossomal L10a com eGFP de maneira Cre-dependente. Isso permite o isolamento de núcleos e RNAm de tipos celulares específicos sem a necessidade de classificação celular. Oflox/flox NuTRAP pode ser emparelhado com um Cre específico para o tipo de célula relevante para os tipos de células ovarianas para avaliar isso.
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Camundongos progenitores foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e criados e alojados sob condições de FPS em um ambiente de barreira HEPA em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (luzes acesas às 6:00 horas) na OMRF.
NOTA: Nesta demonstração, usamos um macho Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) emparelhado com uma fêmea NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). A progênie desejada Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) expressará o alelo NuTRAP sob o controle do promotor Cyp17a1 em células do estroma ovariano. Para a preparação deste manuscrito, foram utilizados camundongos fêmeas Cyp17-NuTRAP com 4 meses de idade (n = 4). DNA foi extraído de amostras de punch de orelha de camundongo para genotipagem para confirmação da herança dos transgenes Cyp17iCre e NuTRAP e para a detecção por PCR de 1) Cre genérico, 2) Cyp17iCre, e 3) floxed NuTRAP usando os primers listados na Tabela de Materiais, conforme descrito anteriormente 7,8.
1. Dissecção ovariana de camundongo
2. Isolamento de núcleos de tipos específicos de células ovarianas
3. Isolamento de RNAm de tipos específicos de células ovarianas
Um esquema dos protocolos TRAP e INTACT é mostrado na Figura 1. Aqui, a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP para células estromais/tecais ovarianas é demonstrada por imagem imunofluorescente e RNA-Seq a partir de RNA isolado por TRAP. Primeiramente, foram realizadas imagens de imunofluorescência do sinal da eGFP no ovário e localização do sinal da eGFP para as células da teca e do estromal. Resumidamente, cortes de 5 μm foram desparafinizados com gradiente de xileno ...
O modelo de camundongo NuTRAP6 é uma poderosa abordagem de marcação transgênica para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma de tipos celulares específicos que podem ser adaptados a qualquer tipo de célula com um driver Cre disponível. Aqui, demonstramos a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP em atingir tecas ovarianas e células estromais. O modelo Cyp17-NuTRAP pode ser usado para elucidar ainda mais os mecanismos epigenéticos específicos da teca e da célula...
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) e Presbyterian Health Foundation. Este trabalho também foi apoiado em parte pelo prêmio MERIT I01BX003906 e um prêmio do Programa de Avaliação de Equipamentos Compartilhados (ShEEP) ISIBX004797 dos Estados Unidos (EUA). Departamento de Assuntos de Veteranos, Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento de Laboratórios Biomédicos. Os autores também gostariam de agradecer ao Clinical Genomics Center (OMRF) e ao Imaging Core Facility (OMRF) pela assistência e uso do instrumento.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoExplore Mais Artigos
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados