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Resumo

Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.

Resumo

A avaliação das alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular é fundamental para a compreensão do envelhecimento ovariano. Para este fim, a otimização do método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram realizados para a subsequente interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando um novo modelo transgênico de camundongo NuTRAP. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Uma vez que estudos recentes implicaram células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce, o sistema de expressão NuTRAP foi direcionado para células estromais usando um driver Cyp17a1-Cre. A indução da construção NuTRAP foi específica para fibroblastos estromais ovarianos, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento foram obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com uma linha Cre disponível.

Introdução

Os ovários são os principais atores no envelhecimento somático1, com contribuições distintas de populações celulares específicas. A heterogeneidade celular do ovário dificulta a interpretação dos resultados moleculares de ensaios volumosos de ovário inteiro. Compreender o papel de populações celulares específicas no envelhecimento ovariano é fundamental para identificar os fatores moleculares responsáveis pelo declínio da fertilidade e da saúde em mulheres idosas. Tradicionalmente, a avaliação multi-ômica de tipos específicos de células ovarianas era realizada por técnicas como microdissecção a laser2

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Camundongos progenitores foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e criados e alojados sob condições de FPS em um ambiente de barreira HEPA em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (luzes acesas às 6:00 horas) na OMRF.

NOTA: Nesta demonstração, usamos um macho Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) emparelhado com uma fêmea NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). A progênie desejada Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT

Resultados

Um esquema dos protocolos TRAP e INTACT é mostrado na Figura 1. Aqui, a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP para células estromais/tecais ovarianas é demonstrada por imagem imunofluorescente e RNA-Seq a partir de RNA isolado por TRAP. Primeiramente, foram realizadas imagens de imunofluorescência do sinal da eGFP no ovário e localização do sinal da eGFP para as células da teca e do estromal. Resumidamente, cortes de 5 μm foram desparafinizados com gradiente de xileno .......

Discussão

O modelo de camundongo NuTRAP6 é uma poderosa abordagem de marcação transgênica para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma de tipos celulares específicos que podem ser adaptados a qualquer tipo de célula com um driver Cre disponível. Aqui, demonstramos a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP em atingir tecas ovarianas e células estromais. O modelo Cyp17-NuTRAP pode ser usado para elucidar ainda mais os mecanismos epigenéticos específicos da teca e da célula.......

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) e Presbyterian Health Foundation. Este trabalho também foi apoiado em parte pelo prêmio MERIT I01BX003906 e um prêmio do Programa de Avaliação de Equipamentos Compartilhados (ShEEP) ISIBX004797 dos Estados Unidos (EUA). Departamento de Assuntos de Veteranos, Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento de Laboratórios Biomédicos. Os autores também gostariam de agradecer ao Clinical Genomics Center (OMRF) e ao Imaging Core Facility (OMRF) pela assistência e uso do instrumento.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M SpermidineSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CycloheximideSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
30 µm cell strainer Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
anti-GFP antibodyAbcamAb290For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLTQiagen79216RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tabletRoche11836170001For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse modelThe Jackson Laboratory28547B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnetInvitrogen12321D
Genotyping PrimersIDTCustomGeneric Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
      Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
      NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X)Thermo Scientific1861278For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 µm bead diameter
MixMateEppendorf5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP mouse modelThe Jackson Laboratory29899B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh FormatThermo ScientificA39255
Protein G DynabeadsThermoFisher10004DFor TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Sodium HeparinFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
VWR Tube RotatorFisher ScientificNC9854190

Referências

  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdiss....

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