Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.

Özet

Hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik değişikliklerin değerlendirilmesi, yumurtalık yaşlanmasını anlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, çeviri ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yönteminin optimizasyonu ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, yeni bir transgenik NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomu ve epigenomunun daha sonra eşleştirilmiş sorgulaması için gerçekleştirilmiştir. NuTRAP alelinin ekspresyonu, flokslu bir STOP kasetinin kontrolü altındadır ve promotöre özgü Cre hatları kullanılarak spesifik yumurtalık hücre tiplerine hedeflenebilir. Son çalışmalar, erken yaşlanma fenotiplerinin sürülmesinde yumurtalık stromal hücrelerini içerdiğinden, NuTRAP ekspresyon sistemi bir Cyp17a1-Cre sürücüsü kullanılarak stromal hücrelere hedeflenmiştir. NuTRAP yapısının indüksiyonu yumurtalık stromal fibroblastlarına özgüydü ve dizileme çalışmaları için yeterli DNA ve RNA tek bir yumurtalıktan elde edildi. Burada sunulan NuTRAP modeli ve yöntemleri, mevcut bir Cre çizgisine sahip herhangi bir yumurtalık hücre tipini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Yumurtalıklar, spesifik hücre popülasyonlarından farklı katkılarla somatik yaşlanma1'de önemli oyunculardır. Yumurtalığın hücresel heterojenliği, toplu, tüm yumurtalık tahlillerinden moleküler sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Yumurtalık yaşlanmasında spesifik hücre popülasyonlarının rolünü anlamak, yaşlı kadınlarda doğurganlık ve sağlık düşüşünden sorumlu moleküler sürücüleri tanımlamanın anahtarıdır. Geleneksel olarak, spesifik over hücre tiplerinin multi-omik değerlendirmesi, lazer mikrodiseksiyon2, tek hücreli yaklaşımlar3 veya hücre sıralama4 gibi tekniklerle elde edilmiştir. Bununla birlikte, mikrodiseksiyonun gerçekleştirilmesi pahalı ve zor olabilir ve hücre sıralaması hücresel fenotipik profilleri değiştirebilir5.

Yumurtalık hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik profilleri değerlendirmek için yeni bir yaklaşım, nükleer etiketleme ve çeviri ribozom afinite saflaştırma (NuTRAP) fare modelini kullanır. NuTRAP modeli, afinite saflaştırma yöntemlerini kullanarak hücre sıralamasına gerek kalmadan hücre tipine özgü nükleik asitlerin izolasyonuna izin verir: ribozom afinite saflaştırmasının (TRAP) çevrilmesi ve belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT)6. NuTRAP alelinin ekspresyonu, flokslu bir STOP kasetinin kontrolü altındadır ve promotöre özgü Cre hatları kullanılarak spesifik yumurtalık hücre tiplerine hedeflenebilir. NuTRAP fareyi hücre tipine özgü bir Cre çizgisiyle geçerek, STOP kasetinin çıkarılması, ribozomal kompleksin eGFP etiketlemesine ve çekirdeğin Cre'ye bağımlı bir şekilde biyotin / mCherry etiketlemesine neden olur6. TRAP ve INTACT teknikleri daha sonra mRNA ve nükleer DNA'yı ilgilenilen hücre tipinden izole etmek ve transkriptomik ve epigenomik analizlere devam etmek için kullanılabilir.

NuTRAP modeli, yağ dokusu6, beyin dokusu 7,8,9 ve retina 10 gibi farklı dokularda, tüm doku homojenatında tespit edilemeyen hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik değişiklikleri ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. NuTRAP yaklaşımının geleneksel hücre sıralama tekniklerine göre faydaları şunlardır: 1) ex vivo aktivasyonel artefaktların önlenmesi8, 2) özel ekipmana (yani hücre ayıklayıcılara) olan ihtiyacın en aza indirilmesi ve 3) hücre tipine özgü analizlerin artan verimi ve azalan maliyeti. Ek olarak, hücre tipine özgü DNA ve RNA'yı tek bir fareden izole etme yeteneği, istatistiksel gücü artıran eşleştirilmiş analizlere izin verir. Son çalışmalar, erken yaşlanma fenotipleri 11,12,13'ün sürülmesinde yumurtalık stromal hücrelerini içerdiğinden, NuTRAP ekspresyon sistemini bir Cyp17a1-Cre sürücüsü kullanarak stromal ve teka hücrelerine hedefledik. Burada, NuTRAP yapısının indüksiyonunun yumurtalık stromal ve teka hücrelerine özgü olduğunu ve dizileme çalışmaları için yeterli DNA ve RNA'nın tek bir yumurtalıktan elde edildiğini gösteriyoruz. Burada sunulan NuTRAP modeli ve yöntemleri, mevcut herhangi bir Cre çizgisine sahip herhangi bir yumurtalık hücre tipini incelemek için kullanılabilir.

Hücre tipine özgü yumurtalık NuTRAP fare hattının oluşturulması için, nükleer etiketleme ve çevirme ribozom afinite saflaştırma (NuTRAP) aleli, BirA, biyotin ligaz tanıma peptidi (BLRP) etiketli mCherry / mRANGAP1 ve eGFP / L10a'nın ekspresyonunu kontrol eden flokslu bir STOP kodonuna sahiptir. Hücre tipine özgü bir Cre çizgisi ile çaprazlandığında, NuTRAP kasetinin ifadesi, nükleer protein mRANGAP1'i biotin / mCherry ile ve ribozomal protein L10a'yı eGFP ile Cre'ye bağımlı bir şekilde etiketler. Bu, hücre sıralamaya gerek kalmadan çekirdeklerin ve mRNA'nın spesifik hücre tiplerinden izole edilmesine izin verir. NuTRAP floks/ floks , bunu değerlendirmek için yumurtalık hücre tipleriyle ilgili hücre tipine özgü bir Cre ile eşleştirilebilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Tıbbi Araştırma Vakfı'ndaki (OMRF) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ebeveyn fareler Jackson Laboratuvarı'ndan (Bar Harbor, ME) satın alındı ve OMRF'de 14 saat / 10 saatlik bir ışık / karanlık döngüsünde (ışıklar sabah 6: 00'da yanıyor) bir HEPA bariyer ortamında SPF koşulları altında yetiştirildi ve barındırıldı.

NOT: Bu gösterimde, NuTRAP dişi (Suş # 029899, Jackson Laboratuvarı) ile eşleştirilmiş bir Cyp17iCre+/−(Suş # 028547, Jackson Laboratuvarı) erkek kullanıyoruz. İstenilen Cyp17-NuTRAP soyu (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox / WT), yumurtalık stromal hücrelerinde Cyp17a1 promotörünün kontrolü altındaki NuTRAP alelini eksprese edecektir. Bu makale hazırlığı için 4 aylık dişi Cyp17-NuTRAP fareleri (n = 4) kullandık. DNA, Cyp17iCre ve NuTRAP transgenlerinin kalıtımını doğrulamak için genotipleme için fare kulağı delme örneklerinden çıkarıldı ve daha öncetarif edildiği gibi 7,8 Malzeme Tablosunda listelenen primerler kullanılarak 1) jenerik Cre, 2) Cyp17iCre ve 3) NuTRAP'ın PCR tespiti için flokslandı.

1. Fare yumurtalık diseksiyonu

  1. Hayvan bakım kurallarına ve kurumun onayına göre fare ötenazisi yapın, ardından yumurtalık toplanması.
  2. Yumurtalıkları tamponlu tüplere yerleştirmeden önce yumurtalık dokusuna bağlanabilecek herhangi bir yağ dokusunu veya yumurta kanallarının parçalarını çıkarmak için yumurtalıkları diseke edin. Hemen TRAP veya INTACT tekniklerine geçin.
    NOT: Bu protokol dondurulmuş doku ile kullanım için optimize edilmemiştir. Her teknik için aynı fareden bir yumurtalık kullanılması gelecekteki istatistiksel analizler için önerilir.

2. Çekirdeklerin spesifik yumurtalık hücre tiplerinden izolasyonu

  1. Tampon hazırlama
    1. Nükleer saflaştırma tamponu (NPB): 100 mL NPB hazırlamak için, 2 mL 1 M HEPES (nihai konsantrasyon: 20 mM HEPES), 0,8 mL 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), ve 92.2 mL nükleaz içermeyen su. Çekirdek izolasyonu gününde 1x proteaz inhibitörü ile takviye edin.
      NOT: NPB, proteaz inhibitörü olmadan önceden hazırlanabilir ve 4 ° C'de 3 haftaya kadar sürer.
    2. Çekirdek lizis tamponu (eksiksiz): Çekirdek izolasyonu gününde 1x proteaz inhibitörü ile takviye edilen çekirdek lizis tamponu.
  2. Çekirdek süspansiyonunun oluşturulması
    NOT: Aksi belirtilmedikçe numuneler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.
    1. Bir Cyp17-NuTRAP fareden (veya diğer ilgili Cre-NuTRAP) 500 μL çekirdek lizis tamponunda (eksiksiz) bir yumurtalık toplayın. Kendiliğinden açılan mikro makas kullanarak yumurtalıkları tampon içinde sekiz parçaya bölün.
    2. Kıyılmış yumurtalık ve 500 μL lizis tamponunu buz üzerinde bir cam Dounce homojenizatöre aktarmak için geniş delikli pipet uçları kullanın. Yumurtalık 10x-20x'i gevşek havaneli A ile homojenize edin.
    3. Yumurtalıkları sıkı havaneli B 10x-20x ile homojenize edin. 1.000 μL lizis tamponu ekleyin, havane B'yi yıkayın Homojenatı (1.9 mL) 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    4. Ayrışmamış doku ve kan damarlarını çıkarmak için 4 ° C'de 1,5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjyapın 14. Süpernatant çekirdekleri içerir; ayrışmamış dokunun topağını atın.
    5. 100 μL lizis tamponu ile 30 μm'lik bir hücre süzgecini önceden ıslattıktan sonra ve süpernatantı hücre süzgecinden 15 mL'lik bir konik tüpe filtreleyin. Daha sonra, çekirdek içeren karışımı 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    6. Numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. Pelet çekirdek içerir.
    7. Nükleer peleti 250 μL buz gibi soğuk lizis tamponunda, orta ila yüksek hızda kısa bir süre vorteks yaparak yeniden askıya alın. 1,5 mL lizis tamponu ekleyerek hacmi 1,75 mL'ye getirin. Yavaşça karıştırın ve nükleer süspansiyonu 5 dakika boyunca buz üzerinde dinlendirin.
    8. Çekirdekleri 500 x g'de santrifüjleme ile 4 °C'de 5 dakika boyunca pelet yapın. Nükleer peletleri rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Peletin 200 μL buz gibi soğuk depolama tamponunda yeniden askıya alınması ve nükleer peletin tamamen yeniden askıya alınması için kısa bir süre vorteks yapın.
    9. Askıya alınmış peletin (20 μL) %10'unu aşağı akış analizleri için giriş çekirdeği numunesi olarak ayırın.
    10. Yeniden askıya alınmış çekirdek topağını alın ve buz gibi soğuk NPB ile hacmi 2.0 mL'ye yükseltin. INTACT afinite tabanlı saflaştırma yöntemini kullanarak etiketli çekirdekleri izole etmeye devam edin.
  3. Belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT)
    1. Tamamen askıya alınmalarını sağlamak için streptavidin boncuklarını şişede 30 s boyunca orta hızda vorteks. Her numune için 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe 30 μL yeniden askıya alınmış boncuk ekleyin (10 numuneye kadar boncuklar tek bir tüpte yıkanabilir), 1 mL NPB ekleyin ve pipetleme ile iyice askıya alın.
    2. Boncukları ayırmak için tüpü manyetik rafa 1 dakika boyunca yerleştirin. Supernatan'ı atın ve tüpü mıknatıstan çıkarın. Yıkanmış manyetik boncukları 1 mL NPB'de tekrar askıya alın.
    3. Toplam üç yıkama için yıkama adımını tekrarlayın. Son yıkamayı takiben, boncukları NPB'nin ilk hacminde (numune başına 30 μL) tekrar askıya alın.
    4. Adım 2.2.10'dan itibaren 2 mL nükleer süspansiyona yıkanmış boncukların 30 μL'sini ekleyin. Boncuk çekirdeği karışımını pipetleyerek ve tüpü nazikçe ters çevirerek iyice askıya alın.
    5. Tüpleri soğuk bir odada veya buzdolabında dönen bir karıştırıcıya düşük hızda 30 dakika boyunca yerleştirin. Giriş örneklerini boncuksuz olarak aynı koşullarda inkübe edin.
    6. Tüpleri mıknatısın üzerine nükleer süspansiyon ve boncuklarla yerleştirin ve streptavidin boncuklarına (pozitif fraksiyon) bağlı biyotinile çekirdekleri çekirdeğin negatif fraksiyonundan ayırın. Boncukların mıknatıs üzerinde 3 dakika boyunca ayrılmasına izin verin.
    7. Süpernatanı çıkarın, negatif fraksiyonu taze bir 2.0 mL tüpe geçirin ve buz üzerinde saklayın. Her pozitif fraksiyon tüpü için, tüpü mıknatıstan çıkarın ve içeriği 1 mL NPB'de yeniden askıya alın.
    8. Tüpü mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve süpernatanı atın. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış boncuk-çekirdek karışımını 1 mL NPB'de yeniden askıya alın.
    9. Toplam üç yıkama için adım 2.3.8'i tekrarlayın. Üç yıkamanın tamamlanmasından sonra, pozitif fraksiyon boncuk-çekirdek karışımını 30 μL NPB'de yeniden askıya alın.
    10. Her negatif fraksiyon tüpü için, nükleer süspansiyonu adım 2.3.7'den 500 x g'de 4 ° C'de 7 dakika boyunca santrifüj edin. Supernatan'ı dikkatlice aspire edin ve atın. Negatif fraksiyon çekirdeği peletini 30 μL NPB'de yeniden askıya alın.
    11. Çekirdekleri girdiden (adım 2.2.9), negatif fraksiyondan (adım 2.3.10) ve pozitif fraksiyondan (adım 2.3.9) nükleer DNA veya RNA izolasyonuna hazır olana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
      NOT: Çekirdekler, girdi olarak sağlam çekirdekler gerektiren protokoller için dondurulmamalıdır (yani, transpozaz erişilebilir kromatin, kromatin immünopresipitasyonu için tahlil).

3. mRNA'nın spesifik yumurtalık hücre tiplerinden izolasyonu

  1. Arabelleklerin hazırlanması
    1. TRAP tampon tabanı: 78,8 mL RNaz içermeyen su, 5 mL 1 M Tris-HCl (nihai konsantrasyon: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 mL 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 mL 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) ve 10 mL %10 NP-40 (%1 NP-40) birleştirerek 100 mL TRAP tampon tabanı hazırlayın. 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
    2. Yüksek tuz tampon bazı: 68,8 mL RNaz içermeyen su, 5 mL 1 M Tris-HCl (nihai konsantrasyon: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 mL 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 mL 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) ve 10 mL %10 NP-40 (%1 NP-40) birleştirerek 100 mL yüksek tuz tamponu baz hazırlayın. 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
    3. TRAP homojenizasyon tamponu (eksiksiz): Doku toplama gününde numune başına 1,5 mL hazırlayın. 10 μL 100 mg/mL sikloheksimid (nihai konsantrasyon: 100 μg/mL sikloheksimid), 10 mg sodyum heparin (1 mg/mL sodyum heparin), 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL 40 U/μL RNaz inhibitörü (200 U/mL RNaz inhibitörü) ile birleştirerek 10 mL TRAP homojenizasyon tamponu hazırlayın, 200 μL 0.1 M spermidin (2 mM spermidin) ve bir EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tablet (1x).
    4. Düşük tuzlu yıkama tamponu (eksiksiz): Doku toplama gününde numune başına 1,5 mL yapın. 10 mL düşük tuzlu yıkama tamponu yapmak için, 10 mL TRAP tampon bazını (adım 3.1.1'den itibaren) 10 μL 100 mg/mL sikloheksimid (100 μg/mL sikloheksimid) ve 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT) ile birleştirin.
    5. Yüksek tuzlu yıkama tamponu (eksiksiz): TRAP izolasyonunun ikinci gününde numune başına 1,5 mL yapın. 10 mL yüksek tuzlu yıkama tamponu yapmak için, 10 mL yüksek tuz tamponu bazını (adım 3.1.2'den itibaren) 10 μL 100 mg / mL sikloheksimid ve 20 μL 0.5 M DTT ile birleştirin.
  2. Ribozom afinite saflaştırmasının (TRAP) çevirisinin gerçekleştirilmesi
    1. Diğer yumurtalıkları bir Cyp17-NuTRAP fareden (veya diğer ilgili Cre-NuTRAP) toplayın ve 100 μL buz gibi soğuk TRAP homojenizasyon tamponu içeren 1,5 mL RNaz içermeyen bir tüpe yerleştirin (adım 3.1.3'ten itibaren). Kendiliğinden açılan mikro makas kullanarak yumurtalıkları tampon içinde sekiz parçaya bölün.
    2. Yumurtalık ve 100 μL homojenizasyon tamponunu bir cam Dounce homojenizatöre aktarmak için geniş delikli uçlar kullanın. Gevşek havaneli A ile 10x-20x'i homojenize edin. 400 μL TRAP homojenizasyon tamponu ekleyin, havane A'yı yıkayın.
    3. Homojenatı 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Dounce homojenizatörünü ilave 1 mL TRAP homojenizasyon tamponu ile yıkayın ve yıkanan hacmi 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe aktarın.
    4. Homojenatı 12.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Temizlenmiş süpernatantı taze 2 mL yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Pelet atın.
    5. Temizlenmiş homojenatın 100 μL'sini yeni bir 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve buz üzerinde girdi olarak ayırın.
    6. Temizlenmiş homojenatın geri kalanını (adım 3.2.4'ten itibaren) bir anti-GFP antikoru (5 μg / mL) ile 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin ve uçtan uca döndürün. Giriş örneğini aynı koşullarda inkübe edin.
    7. İnkübasyonun son 15 dakikasında, aşağıdaki adımları (3.2.8-3.2.11) kullanarak protein G manyetik boncuklarını düşük tuzlu yıkama tamponunda yıkayın.
    8. Vorteks protein şişesi G manyetik boncukları 30 s boyunca tamamen askıya almak için. Her numune için 50 μL protein G manyetik boncuk (bir tüpte 10 numuneye kadar yıkanabilir) 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    9. Boncuklara 500 μL düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Boncukları tüpün yan tarafına doğru toplamak için tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Supernatan'ı çıkarın ve atın.
    10. Tüpü manyetik standdan çıkarın ve tüpe 1 mL düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Boncukları tüpün yan tarafına doğru toplamak için tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Supernatan'ı çıkarın ve atın.
    11. Toplam üç yıkama için adım 3.2.10'u tekrarlayın. Son yıkamayı takiben, tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları düşük tuzlu yıkama tamponunun ilk hacminde (numune başına 50 μL) yeniden askıya alın.
    12. Yeniden askıya alınmış yıkanmış boncukları (50 μL) antijen numunesine/antikor karışımına aktarın ve uçtan uca mikserde dönerken gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Eşdeğer koşulları korumak için giriş numunelerini gece boyunca 4 °C'de uçtan uca dönen inkübe edin.
    13. Gece inkübasyonundan sonra, tüpleri rotatörden çıkarın ve manyetik boncukları hedef ribozomlar / RNA (pozitif fraksiyon) ile süpernatanttan (negatif fraksiyon) 2.5-3 dakika boyunca ayırın. Negatif fraksiyonu aspire edin, taze bir 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe yerleştirin ve pozitif fraksiyonu işlerken buz üzerinde bir kenara koyun.
    14. Pozitif fraksiyonlu tüpe 500 μL yüksek tuzlu yıkama tamponu (adım 3.1.5'ten itibaren) ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin. Boncukları ayırmak için tüpü 1 dakika boyunca buz üzerinde tutulan manyetik bir standın üzerine yerleştirin. Supernatan'ı atın ve tüpü mıknatıstan çıkarın.
    15. Toplam üç yıkama için adım 3.2.14'ü tekrarlayın. Son yıkamayı takiben, boncukları 3.5 μL 2-merkaptoetanol (BME) ile desteklenmiş 350 μL RNA lizis tamponunda yeniden askıya alın. Dijital bir çalkalayıcıda 900 rpm'de 10 dakika karıştırırken tüpleri oda sıcaklığında inkübe edin.
    16. Boncukları, şimdi hedef ribozomları / RNA'yı içeren çözeltiden, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca manyetik bir stand ile ayırın. Salınan pozitif fraksiyonu (süpernatan) taze bir 1.5 mL tüpte toplayın ve 350 μL% 100 etanol ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin. RNA izolasyonuna geçin.
    17. İsteğe bağlı: RNA'yı giriş örneğinden (adım 3.2.5) ve negatif fraksiyondan (adım 3.2.13) izole etmek için, girişin 100 μL'sini ve negatif fraksiyonları taze 1.5 mL tüplere aktarın. Her numuneye 3,5 μL BME ile desteklenmiş 350 μL RNA lizis tamponu ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin. Her tüpe 250 μL% 100 etanol ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. RNA izolasyonuna geçin.
  3. RNA izolasyonu
    1. Pozitif fraksiyonun 700 μL'sini ve isteğe bağlı olarak giriş ve/veya negatif fraksiyonu bir RNA spin sütununa aktarın. RNA'yı spin sütunundan izole etmek için üreticinin talimatlarını izleyin.

Sonuçlar

TRAP ve INTACT protokollerinin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada, Cyp17-NuTRAP fare modelinin yumurtalık stromal / teka hücrelerine özgüllüğü, immünofloresan görüntüleme ve TRAP ile izole RNA'dan RNA-Seq ile gösterilmiştir. İlk olarak yumurtalıkta eGFP sinyalinin immünofloresan görüntülemesi ve eGFP sinyalinin teka ve stromal hücrelere lokalizasyonu yapıldı. Kısaca, 5 μm kesitler bir ksilen ve etanol gradyanı ile deparafinize edildi. Daha iyi eGFP sin...

Tartışmalar

NuTRAP fare modeli6, mevcut bir Cre sürücüsü ile herhangi bir hücre tipine uyarlanabilen belirli hücre tiplerinden transkriptom ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için güçlü bir transgenik etiketleme yaklaşımıdır. Burada, Cyp17-NuTRAP fare modelinin yumurtalık teka ve stromal hücreleri hedeflemedeki özgüllüğünü gösteriyoruz. Cyp17-NuTRAP modeli, yumurtalık yaşlanması, kanser ve hastalıkta rol oynayan teka ve stromal hücreye özgü epigenetik mekanizmaları daha...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Vakfı (M2020207) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen MERIT ödülü I01BX003906 ve Amerika Birleşik Devletleri'nden (ABD) Paylaşılan Ekipman Değerlendirme Programı (ShEEP) ödülü ISIBX004797 tarafından da desteklenmiştir. Gazi İşleri Daire Başkanlığı, Biyomedikal Laboratuvarı Araştırma ve Geliştirme Servisi. Yazarlar ayrıca yardım ve cihaz kullanımı için Klinik Genomik Merkezi (OMRF) ve Görüntüleme Çekirdeği Tesisi'ne (OMRF) teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M SpermidineSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CycloheximideSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
30 µm cell strainer Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
anti-GFP antibodyAbcamAb290For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLTQiagen79216RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tabletRoche11836170001For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse modelThe Jackson Laboratory28547B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnetInvitrogen12321D
Genotyping PrimersIDTCustomGeneric Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
      Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
      NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X)Thermo Scientific1861278For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 µm bead diameter
MixMateEppendorf5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0.5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0.5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP mouse modelThe Jackson Laboratory29899B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh FormatThermo ScientificA39255
Protein G DynabeadsThermoFisher10004DFor TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Sodium HeparinFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
VWR Tube RotatorFisher ScientificNC9854190

Referanslar

  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır