العزل غير المائي وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة واللاطئة من القنب ساتيفا

Summary

يتم تقديم بروتوكول للعزل المريح وعالي الإنتاجية وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة و trichomes اللاطئة من Cannabis sativa. يعتمد البروتوكول على استخراج جاف وغير عازل للترايكهومات باستخدام النيتروجين السائل والثلج الجاف والمناخل المصنوعة من النايلون فقط وهو مناسب لاستخراج الحمض النووي الريبي والتحليل النسخي.

Abstract

تقدم هذه الورقة بروتوكولا للعزل المريح وعالي الإنتاجية وإثراء الرؤوس الغدية المطاردة والثلاثية اللاطئة من Cannabis sativa. يتم تحديد مسارات التخليق الحيوي للقنب واستقلاب التربين المتطاير بشكل أساسي في trichomes القنب ، و trichomes المعزولة مفيدة لتحليل النسخ. البروتوكولات الحالية لعزل trichomes الغدية للتوصيف النسخي غير مريحة وتوفر رؤوس trichome للخطر وكمية منخفضة نسبيا من trichomes معزولة. علاوة على ذلك ، يعتمدون على أجهزة باهظة الثمن ووسائط عزل تحتوي على مثبطات البروتين لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. يقترح البروتوكول الحالي الجمع بين ثلاثة تعديلات فردية للحصول على كمية كبيرة من التريكومات الغدية المعزولة والمطاردة اللاطئة من النورات الأنثوية الناضجة C. sativa وأوراق المروحة ، على التوالي. يتضمن التعديل الأول استبدال النيتروجين السائل بوسط العزل التقليدي لتسهيل مرور الترايكهوم عبر المناخل الدقيقة. يتضمن التعديل الثاني استخدام الثلج الجاف لفصل trichomes عن مصدر النبات. يتضمن التعديل الثالث تمرير المادة النباتية على التوالي من خلال خمسة غرابيل دقيقة ذات أحجام مسام متناقصة. أظهر التصوير المجهري فعالية تقنية العزل لكلا النوعين من الترايشوم. بالإضافة إلى ذلك ، كانت جودة الحمض النووي الريبي المستخرج من trichomes المعزولة مناسبة لتحليل النسخ النهائي.

Introduction

trichomes الغدية هي هياكل تشبه الشعر موجودة في النباتات التي تحتوي على العديد من المستقلبات الثانوية¹ وتمثل بنكا قيما لجينات وإنزيمات التخليق الحيوي الجديدة². في القنب ، يتم توطين التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية الهامة ، القنب ³ والتربين⁴ ، في trichomes. بالنظر إلى دور trichomes في تحديد جودة القنب للاستخدامات الطبية والترفيهية على حد سواء ، فإن دراسة التعبير الجيني trichome ذات أهمية. لتوصيف التعبير عن الجينات الخاصة بالتريشومي ، يجب أولا عزل trichomes ذات الأهمية. تم وصف بروتوكولات عزل Trichome لأول مرة في وقت مبكر من عام 1992⁵ ، وقد تمت مراجعة أحدث تطوراتها مؤخرا². بشكل عام ، يمكن تقسيم بروتوكولات استخراج trichomes الغدية للتوصيف النسخي إلى خطوتين متسلسلتين متميزتين. تتضمن الخطوة الأولى فصلا ماديا شاملا للترايكهوم عن الأنسجة النباتية. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام الثلج الجاف⁵ ، أو الخرز الزجاجي بجهاز تجاري ^6,7 ، أو طحن المادة النباتية مقابل غربال شبكي⁸ ، أو دوامة الأنسجة النباتية في مخزن عازل^{للعزل 9}. تتضمن الخطوة الثانية فصلا أكثر دقة للترايكهومات ذات الأهمية عن بقايا النباتات المجهرية و / أو أنواع trichome الأخرى. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة ^8,10 أو المناخل بأحجام مختلفة ^7,9. نظرا للحساسية الشديدة للحمض النووي الريبي في الأنسجة المصنعة للعوامل المهينة ، عادة ما يتم إجراء هاتين الخطوتين المتتابعتين في وسط عزل الجليد البارد ، غالبا في وجود مثبطات البروتين⁴.

تتطلب بروتوكولات عزل trichome التقليدية ، بالإضافة إلى درجات الحرارة الباردة الجليدية ، كميات كبيرة من وسط العزل لضمان إجراء استخراج فعال. ينتج عن الجمع بين هذه المكونات عملية عزل شاقة وتستغرق وقتا طويلا وتعيق الإنتاجية العالية. لذلك ، من المحتمل أن يكون تقديم بروتوكول عزل ثلاثي الرؤوس بديل مباشر وسهل الاستخدام مفيدا لمختلف الجوانب المرتبطة بتوصيف trichome. تهدف هذه الورقة إلى تقديم بروتوكول بديل لعزل trichomes المسكرة والغدد اللاطئة من القنب ساتيفا من خلال الجمع بين عدة عناصر من البروتوكولات التقليدية ودمجها. تشمل هذه العناصر الثلج الجاف⁵ ، ومرور trichomes عبر العديد من المناخل الدقيقة ذات أحجام المسام المتناقصة ^7,9 ، واستبدال النيتروجين السائل (LN) بوسط العزل⁸.

إن حداثة بروتوكول عزل trichome الحالي ، مقارنة بالبروتوكولات التقليدية ، تقدم بعدة طرق. هذا البروتوكول مناسب ، لأنه لا يتطلب مكونات خطرة. يمكن إجراء العملية في المختبر بأقل قدر من الاحتياطات وتسهل الإنتاجية العالية. يضمن استبدال LN بوسط عزل السائل القياسي سلامة trichomes طوال عملية العزل ، مما يتيح التحليل النسخي اللاحق. عند تسامي LN والثلج الجاف ، تترك trichomes المعزولة خالية من المخلفات الضارة. علاوة على ذلك ، فإن ميل LN إلى التسامي في درجة حرارة الغرفة يسمح باستخدامه السخي في جميع أنحاء البروتوكول. في المقابل ، فإن استخدام كميات كبيرة من وسيط العزل التقليدي يولد صعوبات عملية في التعامل معها. أخيرا ، يقلل البروتوكول من فصل خلية القرص عن بنية الرأس الهشة المتبقية للثلاثي الغدي ، مما يتيح الاحتفاظ بمحتوى مساحة الرأس.

يتم تقديم هذا البروتوكول بطريقة مفصلة خطوة بخطوة مصممة للمساعدة في الممارسة الفنية لعزل C. sativa غدية trichomes. يوفر البروتوكول سير عمل يمكن التحكم فيه ينتج عنه ترايكهومات معزولة ذات تركيز عال ونقاء مناسبين للتحليل الجزيئي النهائي.

Protocol

ملاحظة: تألفت المادة النباتية المستخدمة في هذه الدراسة من أربع سلالات C. sativa ARO-Volcani (CS-11 و CS-12 و CS-13 و CS-14) التي نمت في مركز البركان ، إسرائيل ، كما هو موضح في مكان آخر¹¹. تم عزل trichomes المطاردة الغدي من النورات المزهرة الناضجة ، وتم عزل trichomes اللاطئة الغدية من أوراق المروحة الكبيرة من النباتات الأم الناضجة غير المزهرة. تم اختيار جميع المواد النباتية حديثا وتخزينها على الفور عند -80 درجة مئوية.

تنبيه: يتم استخدام الثلج الجاف و LN في جميع أنحاء البروتوكول. هذه المواد خطرة للغاية. يمكن أن تحتوي trichomes المعزولة على جزيئات ثلج جاف يمكن أن تخلق ضغطا خطيرا للغاز عند إدخالها في أنابيب محكمة الغلق ؛ لذلك ، يجب ثقب جميع القبعات بالإبرة. ينصح بشدة باستخدام نظارات واقية وملابس معملية مناسبة وقفازات للتعامل مع درجات حرارة منخفضة للغاية.

1. الإعداد للفصل الأولي للترايكهومات من المواد النباتية

1. سحق كتلة ثلج جاف إلى رقائق صغيرة ناعمة باستخدام مطرقة وجسم مسطح صلب في حاوية بلاستيكية سعة 5 لتر.
2. غربلة رقائق الثلج الجاف الناعم (أصغر من 5 مم) من الثلج الجاف غير المسحوق بمصفاة كبيرة (عبر مسام أصغر من 5 مم) في حاوية بلاستيكية أخرى سعة 5 لتر. صب ما يقرب من 200 سم³ (علامة 200 مل) من رقائق الثلج الجاف في دورق زجاجي مستقيم سعة 1 لتر.
3. أضف ما يصل إلى 10 جم من نورات C. sativa المجمدة (من الآن فصاعدا يشار إليها باسم المواد النباتية) على الطبقة الأولى من الثلج الجاف المسحوق ، وقم بتغطيتها بطبقة إضافية من 200 سم³ من الثلج الجاف المسحوق ناعما.
4. قم بتغطية فتحة الدورق الزجاجي سعة 1 لتر بطبقتين إلى ثلاث طبقات من ناموسية باب الشاشة 1 مم ، وقم بتثبيتها على الجوانب الخارجية للكوب الزجاجي بأشرطة مطاطية (الشكل 1).
5. صب LN في حاوية كبيرة مستديرة القاع من الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد) ، حيث سيتم جمع trichomes المعزولة.
6. أدخل شبكة 350 ميكرومتر في مصفاة غربال / غربال الدقيق لتغطية شبكة غربال الدقيق من الأسفل (الشكل 2). في حالة توفر منخل دقيق بحلقة بلاستيكية قابلة للفصل ، أدخل شبكة 350 ميكرومتر بحيث يتم تثبيتها أسفل شبكة غربال الدقيق. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتأمين شبكة 350 ميكرومتر في محيط منخل الدقيق باستخدام الأربطة المطاطية.
7. ضع منخل الدقيق فوق الحاوية الكبيرة المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المملوءة ب LN (الشكل 3). تأكد من أن عرض الحاوية يتجاوز عرض غربال الدقيق لتقليل فقد الكتلة المنخل خارج الحاوية المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ.

2. فصل trichomes عن المواد النباتية

1. رج الكوب سعة 1 لتر مع توجيه فتحته لأسفل نحو غربال الدقيق كما لو كنت تستخدم شاكر ملح كبير (الشكل 4).
2. ضع الدورق الزجاجي سعة 1 لتر جانبا كل 2-3 دقائق للسماح بغربلة الثلج الجاف المسحوق والمواد النباتية المتراكمة على منخل الدقيق.
3. نخل منخل الدقيق أفقيا لتسهيل مرور المادة النباتية إلى LN في حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ ذات القاع المستدير أدناه.
4. أضف LN إلى حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ والثلج الجاف المسحوق إلى الدورق الزجاجي سعة 1 لتر عندما تنخفض مستوياته. قم بتجديد المواد النباتية المستخدمة في الدورق الزجاجي ب 10 جم إضافية من المواد النباتية الطازجة عند استنفاد المواد النباتية الموجودة في غربال الدقيق. عادة لا يلزم تكرار التجديد أكثر من مرتين.
5. كرر الخطوات 2.1-2.4 حتى يتم جمع كمية كافية من trichomes المخصبة في حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ ذات القاع المستدير. بشكل عام ، 20 جم من المواد النباتية الطازجة كافية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليل النسخ.
6. تحقق من وجود مادة تشبه المسحوق الأبيض (تتكون من بقايا النبات ، و trichomes الغدية ، والثلج الجاف المجروش) في قاع حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ المغمورة في LN. ستساعد الملاحظة المجهرية في تحديد ما إذا كان قد تم جمع كمية كافية من trichomes ؛ ومع ذلك ، قد تعيق هذه الخطوة تدفق البروتوكول. عادة ، يكفي 10-20 جم من المواد النباتية الأولية لمعظم العزلات ؛ ومع ذلك ، قد تكون هناك اختلافات في كثافة trichome للنباتات.
   ملاحظة: من هذه النقطة، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا وإعادة تشغيلها لاحقا. إذا تم إيقافه مؤقتا لفترة قصيرة ، فيجب إضافة كميات كافية من LN بحيث تظل trichomes مغمورة. بدلا من ذلك ، يمكن جمع trichomes وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر لاستخدامها لاحقا ، كما هو موضح في الخطوة 5.

3. فصل trichomes الرأسية الغدية (المطاردة واللاطئة) عن أنواع trichome الأخرى ، مثل trichomes منتفخة و cystolithic ، والحطام

1. أضف كمية صغيرة من LN إلى وعاء صغير نظيف من الفولاذ المقاوم للصدأ مستدير القاع.
2. قم بطي غربال دقيق 40 سم × 40 سم بحجم شبكة 150 ميكرومتر مرتين للحصول على طية 20 سم × 20 سم ، وافتحه. تأكد من أنه يشبه الشكل المخروطي (الشكل 5).
3. ثبت مخروط الشبكة على حافة الحاوية المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام واحد أو اثنين من مشابك الغسيل بحيث يكون الجزء المفتوح من المخروط في وضع مستقيم ويتم غمر الجزء المدبب جزئيا في LN.
4. صب برفق LN والمواد الشبيهة بالمسحوق الأبيض من الخطوة 2.6 في مخروط الغربال الدقيق.
5. ضع فرشاة عريضة برفق لجمع ونقل أي مادة نباتية متبقية من الحاوية الأولى إلى مخروط شبكي 150 ميكرومتر.
6. أضف المزيد من LN إلى الحاوية الأولى ، وكرر حركة التنظيف بالفرشاة حتى يتم نقل جميع المواد النباتية إلى مخروط الغربال الدقيق.
7. افصل مشابك الغسيل بعناية عن غطاء الحاوية ، وافتح مخروط الغربال الصغير بحيث توجد trichomes في منتصف الغربال الصغير المفتوح. امسك جميع الزوايا الأربع للغربال الصغير معا بحيث يظل الجزء الأوسط الذي يحتوي على trichomes مغمورا في LN (الشكل 6).
8. أثناء إمساك جميع الزوايا الأربع للمنخل الصغير ، اغمس المنخل الصغير برفق وهزه في LN في الحاوية الفولاذية كما لو كنت تغرس كيس الشاي. استمر في حركة الغمس / الاهتزاز (الرأسية والأفقية) لمدة 1 دقيقة. هناك مقايضة بين جودة العزلة والكمية. قد تؤدي حركات الغمس الأطول إلى كميات أكبر من trichomes ، ولكن قد تكون درجة عزلها أسوأ. بشكل عام ، يوصى باستخدام 1 دقيقة على أنها كافية لكل من الجودة والكمية.
   ملاحظة: حركة الغربلة هذه هي الجزء الأكثر أهمية في البروتوكول ويجب تنفيذها وفقا لذلك.
9. اختياري: اغرف حطام النبات غير المنخل و trichomes الأكبر (لا يزال مغمورا في LN) التي يتم لفها في وسط الغربال الصغير في أنبوب اختبار 13 مل أو 50 مل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
   تنبيه: لتجنب تراكم الغاز المضغوط (من الثلج الجاف وبقايا LN) ، قم بثقب ثقب في غطاء أنبوب الاختبار بإبرة معقمة. يمكن استبدال الغطاء بمجرد انخفاض الضغط ، والذي عادة ما يكون بعد 24 ساعة.

4. تمرير trichomes من خلال المناخل الدقيقة من تناقص حجم المسام

1. قم بنقل trichomes المنخل المغمور في LN في الجزء السفلي من حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ الصغيرة ذات القاع المستدير بالتتابع من خلال المناخل الدقيقة ذات أحجام المسام المتناقصة (105 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، 65 ميكرومتر ، و 50 ميكرومتر) ، بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 3.

5. مجموعة من trichomes المطلوبة

1. قم بإزالة trichomes المرغوبة المغمورة في LN وملفوفة في غربال دقيق 50 ميكرومتر باستخدام ملعقة مبردة مسبقا (في LN). ضعها على طبق نظيف.
   ملاحظة: في مرحلة العزل النهائية هذه ، يتم جمع trichomes المطلوبة من الغربال.
2. انقل بسرعة trichomes الشبيهة بالمسحوق إلى أنبوب 1.5 مل مبرد مسبقا عبر ملعقة مبردة مسبقا أو مغرفة يتم إدخالها في الأنبوب (الشكل 7). قم بتخزين الأنابيب على الفور عند -80 درجة مئوية لمزيد من الدراسات.
   ملاحظة: يرد مخطط سير عمل تخطيطي يصور بروتوكول العزل بالكامل في الشكل 8.

6. مراقبة وتحليل trichomes المنقى

1. ضع كمية صغيرة (10 ملغ) من trichomes المعزولة على شريحة مجهرية باستخدام ملعقة مبردة مسبقا (عبر LN). أضف قطرة ماء ، وراقب مباشرة على المجهر الضوئي دون تلطيخ. قم بتقييم درجة العزل والتلوث الإجمالية باستخدام تكبيرات منخفضة (10x) وعالية (40x). يتم تقدير التخصيب بصريا من خلال الكمية النسبية من trichomes فيما يتعلق بالأنسجة غير trichome ، كما هو موضح في الشكل 9.
2. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل الجودة من 50 ملغ من C. ساتيفا غدية معزولة تطارد trichomes و trichomes.
   ملاحظة: تم استخدام مجموعة استخراج تجارية (انظر جدول المواد) تستخدم استراتيجية قائمة على poly-A لتنقية mRNA لاستخراج الحمض النووي الريبي.
   1. أعد تعليق 50 مجم من trichomes المعزولة في محلول التحلل ، دوامة لمدة 30 ثانية ، صوتنة في وحدة تنظيف بالموجات فوق الصوتية الباردة عند 35 كيلو هرتز لمدة 5 دقائق ، واستخراج mRNA من العينات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   2. لتقدير سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج من trichomes ، حدد تركيز الحمض النووي الريبي ، والكمية الإجمالية ، وقيم رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) باستخدام نظام مختبر على رقاقة (انظر جدول المواد).
   3. إجراء تحليل RNAseq لكسور trichome (اختياري). يمكن إجراء تحليل RNAseq وتحليلات المعلوماتية الحيوية للقراءات المتسلسلة من خلال خدمات الاستعانة بمصادر خارجية القياسية

النتائج

التعديل الرئيسي المتضمن في هذا البروتوكول مقارنة ببروتوكولات العزل التقليدية trichome هو استبدال وسيط العزل القياسي ب LN. يسمح استخدام LN كوسيط عزل بسير عمل مريح ، لأنه طالما أن العينات مغمورة في LN ، فمن غير المحتمل أن يحدث تدهور أيضي. علاوة على ذلك ، نظرا لأن البروتوكول يتجنب المكونات الخطرة (م?...

Discussion

مقارنة ببروتوكولات عزل trichome المتاحة حاليا ، تم وصف تعديلين رئيسيين في البروتوكول الحالي. وتشمل هذه انفصال trichomes عن المواد النباتية باستخدام الثلج الجاف في الخطوة الأولية واستبدال LN للوسط العازل السائل شائع الاستخدام. يعتمد التعديل الأول لتنقية C. sativa trichome على بروتوكول سابق أدخل استخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush