Nicht-wässrige Isolierung und Anreicherung von glandulären, gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Das Protokoll basiert auf einer trockenen, nicht pufferartigen Extraktion von Trichomen, bei der nur flüssiger Stickstoff, Trockeneis und Nylonsiebe verwendet werden, und eignet sich für die RNA-Extraktion und transkriptomische Analyse.

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Die Biosynthesewege für den Cannabinoid- und flüchtigen Terpenstoffwechsel sind hauptsächlich in den Cannabis-Trichomen lokalisiert, und isolierte Trichome sind für die Transkriptomanalyse von Vorteil. Die bestehenden Protokolle zur Isolierung von Drüsentrichomen für die transkriptomische Charakterisierung sind unpraktisch und liefern kompromittierte Trichomköpfe und eine relativ geringe Menge an isolierten Trichomen. Darüber hinaus sind sie auf teure Apparaturen und Isolationsmedien angewiesen, die Proteininhibitoren enthalten, um den RNA-Abbau zu vermeiden. Das vorliegende Protokoll schlägt vor, drei einzelne Modifikationen zu kombinieren, um eine große Menge an isolierten Drüsen-, Kopf-, Stiel- und sitzenden Trichomen aus reifen weiblichen Blütenständen bzw. Fächerblättern von C. sativa zu erhalten. Die erste Modifikation besteht darin, das herkömmliche Isolationsmedium durch flüssigen Stickstoff zu ersetzen, um den Durchgang der Trichome durch die Mikrosiebe zu erleichtern. Die zweite Modifikation beinhaltet die Verwendung von Trockeneis, um die Trichome von der Pflanzenquelle zu lösen. Bei der dritten Modifikation wird das Pflanzenmaterial nacheinander durch fünf Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße geleitet. Die mikroskopische Bildgebung zeigte die Wirksamkeit der Isolationstechnik für beide Trichomtypen. Darüber hinaus war die Qualität der RNA, die aus den isolierten Trichomen extrahiert wurde, für die nachgelagerte transkriptomische Analyse geeignet.

Einleitung

Drüsen-Trichome sind haarähnliche Strukturen, die in Pflanzen vorkommen und viele sekundäre Metaboliten^{enthalten 1} und eine wertvolle Bank neuer biosynthetischer Gene und Enzyme^{darstellen 2}. Bei Cannabis ist die Biosynthese der wichtigen Sekundärmetaboliten, Cannabinoide³ und Terpene⁴, in den Trichomen lokalisiert. In Anbetracht der Rolle der Trichome bei der Bestimmung der Qualität von Cannabis sowohl für medizinische als auch für Freizeitzwecke ist die Untersuchung der Trichom-Genexpression von Interesse. Um die Expression von trichomspezifischen Genen zu charakterisieren, müssen zunächst die interessierenden Trichome isoliert werden. Trichom-Isolationsprotokolle wurden erstmals 1992 beschrieben⁵, und ihre neuesten Entwicklungen wurden kürzlich überprüft². Im Allgemeinen können Protokolle zur Extraktion von Drüsentrichomen zur transkriptomischen Charakterisierung in zwei verschiedene aufeinanderfolgende Schritte unterteilt werden. Der erste Schritt beinhaltet eine gründliche physikalische Trennung der Trichome vom Pflanzengewebe. Dieser Schritt kann durch die Verwendung von Trockeneis⁵, Glasperlen mit einer handelsüblichen Vorrichtung^6,7, das Mahlen des Pflanzenmaterials gegen ein Maschensieb⁸ oder das Vortexen des Pflanzengewebes in einem Isolationspuffer⁹ durchgeführt werden. Der zweite Schritt beinhaltet eine verfeinerte Trennung der interessierenden Trichome von den mikroskopisch kleinen Pflanzenresten und/oder anderen Trichomtypen. Dieser Schritt kann mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation ^8,10 oder Sieben verschiedener Größen ^7,9 durchgeführt werden. Aufgrund der extremen Empfindlichkeit der RNA in prozessierten Geweben gegenüber Abbaustoffen werden diese beiden aufeinanderfolgenden Schritte in der Regel im eiskalten Isolationsmedium durchgeführt, oft in Gegenwart von Proteininhibitoren⁴.

Herkömmliche Trichom-Isolationsprotokolle erfordern neben den eiskalten Temperaturen auch große Mengen an Isolationsmedium, um ein effizientes Extraktionsverfahren zu gewährleisten. Die Kombination dieser Komponenten führt zu einem mühsamen, zeitaufwändigen Isolationsprozess, der einen hohen Durchsatz verhindert. Die Präsentation eines einfachen, benutzerfreundlichen alternativen Protokolls zur Isolierung von Trichomen ist daher wahrscheinlich für verschiedene Aspekte im Zusammenhang mit der Trichomcharakterisierung von Vorteil. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, ein alternatives Protokoll zur Isolierung von gestielten und sitzenden Drüsen-Kopftrichomen aus Cannabis sativa anzubieten, indem mehrere Elemente aus den konventionellen Protokollen kombiniert und integriert werden. Zu diesen Elementen gehören Trockeneis⁵, das Durchlaufen der Trichome durch mehrere Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße ^7,9 und die Substitution des Isolationsmediums⁸ durch flüssigen Stickstoff (LN).

Die Neuartigkeit des vorliegenden Trichom-Isolationsprotokolls im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen zeigt sich in vielerlei Hinsicht. Dieses Protokoll ist praktisch, da es keine gefährlichen Komponenten benötigt. Das Verfahren kann mit minimalen Vorsichtsmaßnahmen im Labor durchgeführt werden und ermöglicht einen hohen Durchsatz. Durch den Ersatz des flüssigen Standard-Isolationsmediums durch LN wird die Integrität der Trichome während des gesamten Isolationsprozesses sichergestellt und eine anschließende transkriptomische Analyse ermöglicht. Nach der Sublimation des LN und des Trockeneises bleiben die isolierten Trichome frei von schädlichen Rückständen. Darüber hinaus ermöglicht die Neigung von LN, bei Raumtemperatur zu sublimieren, seine großzügige Verwendung im gesamten Protokoll. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung großer Mengen herkömmlicher Isolationsmedien zu praktischen Schwierigkeiten bei der Handhabung. Schließlich verringert das Protokoll die Trennung der Bandscheibenzelle von der verbleibenden zerbrechlichen Kopfstruktur des Drüsentrichoms und ermöglicht so die Beibehaltung des Kopfrauminhalts.

Dieses Protokoll wird in einer detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitung vorgestellt, um die technische Praxis der Isolierung von C. sativa-Drüsen-Kopftrichomen zu unterstützen . Das Protokoll bietet einen überschaubaren Arbeitsablauf, der zu isolierten Trichomen mit einer hohen Konzentration und Reinheit führt, die für die nachgelagerte molekulare Analyse geeignet sind.

Protokoll

HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Pflanzenmaterial bestand aus vier C. sativa-ARO-Volcani-Stämmen (CS-11, CS-12, CS-13 und CS-14 ), die im Volcani Center, Israel, angebaut wurden, wie an anderer Stelle beschrieben¹¹. Drüsige Trichome mit Stielstielen wurden aus reifen Blütenständen isoliert, und drüsige sitzende Trichome wurden aus großen Fächerblättern von reifen, nicht blühenden Mutterpflanzen isoliert. Sämtliches Pflanzenmaterial wurde frisch gepflückt und sofort bei −80 °C gelagert.

ACHTUNG: Trockeneis und LN werden im gesamten Protokoll verwendet. Diese Stoffe sind äußerst gefährlich. Die isolierten Trichome können Trockeneispartikel enthalten, die gefährlichen Gasdruck erzeugen können, wenn sie in versiegelte Röhrchen eingeführt werden. Daher sollten alle Kappen mit Nadel punktiert werden. Die Verwendung einer Schutzbrille, geeigneter Laborkleidung und Handschuhen für die Handhabung bei extrem niedrigen Temperaturen wird dringend empfohlen.

1. Aufbau für die anfängliche Trennung der Trichome vom Pflanzenmaterial

1. Zerkleinern Sie einen Trockeneisblock mit einem Hammer und einem harten, flachen Gegenstand in einem 5-Liter-Kunststoffbehälter in kleine feine Flocken.
2. Die feinen Trockeneisflocken (kleiner als 5 mm) mit einem großen Sieb (über Poren kleiner als 5 mm) aus dem nicht zerkleinerten Trockeneis in einen weiteren 5-Liter-Kunststoffbehälter sieben. Gießen Sie ca. 200^cm3 (200-ml-Markierung) der Trockeneisflocken in einen aufrechten 1-Liter-Glasbecher.
3. Geben Sie bis zu 10 g gefrorene C. sativa-Blütenstände (im Folgenden als Pflanzenmaterial bezeichnet) auf die erste Schicht zerkleinertes Trockeneis und bedecken Sie sie mit einer zusätzlichen Schicht von 200^cm3 fein zerkleinertem Trockeneis.
4. Decken Sie die Öffnung des 1-Liter-Glasbechers mit zwei bis drei Schichten eines 1-mm-Moskitonetzes für die Fliegengittertür ab und befestigen Sie es mit Gummibändern an den Außenseiten des Glasbechers (Abbildung 1).
5. Gießen Sie LN in einen großen Edelstahlbehälter mit rundem Boden (siehe Materialtabelle), in dem die isolierten Trichome gesammelt werden.
6. Setzen Sie ein 350 μm großes Sieb in ein Mehlsieb ein, um das Mehlsiebgewebe von unten abzudecken (Abbildung 2). Wenn ein Mehlsieb mit abnehmbarem Kunststoffring vorhanden ist, setzen Sie das 350 μm große Sieb so ein, dass es unter dem Sieb des Mehlsiebs befestigt ist. Wenn nicht, befestigen Sie die 350 μm Maschenweite mit Gummibändern am Umfang des Mehlsiebs.
7. Stellen Sie das Mehlsieb über den großen, mit LN gefüllten Edelstahlbehälter mit rundem Boden (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die Breite des Behälters die des Mehlsiebs überschreitet, um den Verlust der gesiebten Masse außerhalb des Edelstahlbehälters mit rundem Boden zu minimieren.

2. Abtrennung der Trichome vom Pflanzenmaterial

1. Schütteln Sie das 1-Liter-Glas mit der Öffnung nach unten zum Mehlsieb wie mit einem großen Salzstreuer (Abbildung 4).
2. Stellen Sie den 1-Liter-Glasbecher alle 2-3 Minuten beiseite, damit das zerkleinerte Trockeneis und das Pflanzenmaterial, das sich auf dem Mehlsieb angesammelt hat, gesiebt werden können.
3. Sieben Sie das Mehlsieb horizontal, um den Durchgang des Pflanzenmaterials in das LN im Edelstahlbehälter mit rundem Boden zu erleichtern.
4. LN in den Edelstahlbehälter geben und zerkleinertes Trockeneis in den 1-Liter-Glasbecher geben, wenn der Füllstand zur Neige geht. Füllen Sie das verbrauchte Pflanzenmaterial im Glasbecher mit zusätzlichen 10 g frischem Pflanzenmaterial auf, wenn das Pflanzenmaterial auf dem Mehlsieb aufgebraucht ist. Der Nachschub muss in der Regel nicht mehr als zweimal wiederholt werden.
5. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4, bis eine ausreichende Menge angereicherter Trichome im Edelstahlbehälter mit rundem Boden gesammelt wurde. In der Regel sind 20 g frisches Pflanzenmaterial für die RNA-Extraktion und Transkriptomanalyse ausreichend.
6. Vergewissern Sie sich, dass sich am Boden des Edelstahlbehälters, der in das LN getaucht ist, eine weiße, pulverartige Substanz (bestehend aus Pflanzenresten, Drüsentrichomen und zerkleinertem Trockeneis) befindet. Eine mikroskopische Beobachtung hilft festzustellen, ob eine ausreichende Menge an Trichomen gesammelt wurde. Dieser Schritt kann jedoch den Ablauf des Protokolls behindern. In der Regel reichen 10-20 g anfängliches Pflanzenmaterial für die meisten Isolierungen aus; Es kann jedoch Unterschiede in der Trichomdichte der Pflanzen geben.
   HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt kann das Experiment angehalten und später erneut gestartet werden. Bei einer kurzen Pause sollten ausreichende Mengen LN hinzugefügt werden, damit die Trichome unter Wasser bleiben. Alternativ können die Trichome gesammelt und bis zu 3 Monate bei −80 °C für die spätere Verwendung gelagert werden, wie in Schritt 5 beschrieben.

3. Trennung von drüsigen Kopftrichomen (gestielt und sitzend) von anderen Trichomtypen, wie z. B. bauchigen und zystolithischen Trichomen und Trümmern

1. Geben Sie eine kleine Menge LN in einen sauberen kleinen Edelstahlbehälter mit rundem Boden.
2. Falten Sie ein 40 cm x 40 cm großes Mikrosieb mit einer Maschenweite von 150 μm zweimal, um einen Falz von 20 cm x 20 cm zu erhalten, und öffnen Sie es. Stellen Sie sicher, dass es einer kegelförmigen Form ähnelt (Abbildung 5).
3. Befestigen Sie den Maschenkegel mit einer oder zwei Wäscheklammern am Rand des Edelstahlbehälters mit rundem Boden, so dass der geöffnete Teil des Kegels aufrecht steht und sein spitzer Teil teilweise in das LN eingetaucht ist.
4. Gießen Sie das LN und die weiße, pulverförmige Substanz aus Schritt 2.6 vorsichtig in den Mikrosiebkegel.
5. Tragen Sie vorsichtig einen breiten Pinsel auf, um das restliche Pflanzenmaterial aus dem ersten Behälter zu sammeln und in den 150 μm großen Maschenkegel zu übertragen.
6. Geben Sie mehr LN in den ersten Behälter und wiederholen Sie die Bürstbewegung, bis das gesamte Pflanzenmaterial in den Mikrosiebkegel übergegangen ist.
7. Löse die Wäscheklammer vorsichtig vom Deckel des Behälters und öffne den Mikrosiebkegel, so dass sich die Trichome in der Mitte des geöffneten Mikrosiebs befinden. Halten Sie alle vier Ecken des Mikrosiebs zusammen, so dass der mittlere Teil, der die Trichome enthält, im LN eingetaucht bleibt (Abbildung 6).
8. Während Sie alle vier Ecken des Mikrosiebs festhalten, tauchen und schütteln Sie das Mikrosieb vorsichtig in das LN im Stahlbehälter, als ob Sie einen Teebeutel aufgießen würden. Setzen Sie diese Tauch-/Schüttelbewegung (vertikal und horizontal) 1 Minute lang fort. Es gibt einen Kompromiss zwischen der Qualität und der Quantität der Isolierung. Längere Tauchbewegungen können zu größeren Mengen an Trichomen führen, aber ihr Isolationsgrad kann schlechter sein. Insgesamt wird 1 Minute sowohl für die Qualität als auch für die Quantität als ausreichend empfohlen.
   HINWEIS: Diese Siebbewegung ist der kritischste Teil des Protokolls und sollte entsprechend ausgeführt werden.
9. Optional: Schaufeln Sie die nicht gesiebten Pflanzenreste und größeren Trichome (die noch in das LN getaucht sind), die in der Mitte des Mikrosiebs eingewickelt sind, in ein 13-ml- oder 50-ml-Reagenzglas und lagern Sie sie bei −80 °C für die zukünftige Verwendung.
   VORSICHT: Um die Ansammlung von Druckgas (aus Trockeneis und LN-Rückständen) zu vermeiden, stechen Sie mit einer sterilisierten Nadel ein Loch in die Kappe des Reagenzglases. Die Kappe kann ausgetauscht werden, sobald der Druck nachgelassen hat, was in der Regel nach 24 Stunden der Fall ist.

4. Passieren von Trichomen durch Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße

1. Übertragen Sie die gesiebten Trichomen, die in das LN am Boden des kleinen Edelstahlbehälters mit rundem Boden getaucht sind, nacheinander durch Mikrosiebe mit abnehmenden Porengrößen (105 μm, 80 μm, 65 μm und 50 μm), auf die gleiche Weise wie in Schritt 3 dargestellt.

5. Entnahme der gewünschten Trichome

1. Entfernen Sie die gewünschten Trichome, die in das LN getaucht und mit einem vorgekühlten (in LN) Löffel in das 50-μm-Mikrosieb eingewickelt sind. Legen Sie sie auf einen sauberen Teller.
   Anmerkungen: In dieser letzten Isolationsphase werden die gewünschten Trichome aus dem Sieb entnommen.
2. Übertragen Sie die pulverförmigen Trichome schnell in ein markiertes, vorgekühltes 1,5-ml-Röhrchen über einen vorgekühlten Spatel oder eine in das Röhrchen eingeführte Scoopula (Abbildung 7). Lagern Sie die Röhrchen sofort bei −80 °C für weitere Untersuchungen.
   HINWEIS: Ein schematisches Arbeitsablaufdiagramm, das das gesamte Isolationsprotokoll darstellt, ist in Abbildung 8 dargestellt.

6. Beobachtung und Analyse der gereinigten Trichome

1. Geben Sie eine kleine Menge (10 mg) isolierter Trichome mit einem vorgekühlten (über LN) Spatel auf einen Objektträger. Fügen Sie einen Tropfen Wasser hinzu und beobachten Sie direkt auf einem Lichtmikroskop, ohne zu verfärben. Bewerten Sie den Gesamtisolations- und Kontaminationsgrad mit niedrigen (10x) und hohen (40x) Vergrößerungen. Die Anreicherung wird visuell anhand der relativen Menge an Trichomen in Bezug auf Nicht-Trichomgewebe geschätzt, wie in Abbildung 9 dargestellt.
2. Führen Sie eine RNA-Extraktion und Qualitätsanalyse von 50 mg isolierten C. sativa-Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen durch.
   HINWEIS: Für die RNA-Extraktion wurde ein kommerzielles Extraktionskit (siehe Materialtabelle) verwendet, das eine Poly-A-basierte Strategie der mRNA-Aufreinigung verwendet.
   1. 50 mg der isolierten Trichome in der Lyselösung resuspendieren, 30 s lang wirbeln, 5 min lang in einem eiskalten Ultraschallreinigungsgerät bei 35 kHz beschallen und die mRNA gemäß dem Protokoll des Herstellers aus den Proben extrahieren (siehe Materialtabelle).
   2. Um die Integrität der aus den Trichomen extrahierten RNA abzuschätzen, bestimmen Sie die RNA-Konzentration, die Gesamtmenge und die RNA-Integritätszahl (RIN) mit einem Lab-on-a-Chip-System (siehe Materialtabelle).
   3. Führen Sie eine RNAseq-Analyse der Trichomfraktionen durch (optional). RNAseq-Analysen und bioinformatische Analysen von sequenzierten Reads können mit Standard-Outsourcing-Diensten durchgeführt werden

Ergebnisse

Die wichtigste Änderung, die in diesem Protokoll im Vergleich zu herkömmlichen Trichom-Isolationsprotokollen enthalten ist, besteht darin, das Standard-Isolationsmedium durch LN zu ersetzen. Die Verwendung von LN als Isolationsmedium ermöglicht einen entspannten Arbeitsablauf, denn solange die Proben in LN eingetaucht sind, ist kein metabolischer Abbau wahrscheinlich. Da das Protokoll außerdem die gefährlichen Komponenten (d. h. Aurintricarbonsäure und β-Mercaptoethanol) vermeidet, die in herkömmlichen Trichom-Is...

Diskussion

Im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Trichom-Isolationsprotokollen werden im vorliegenden Protokoll zwei wesentliche Modifikationen beschrieben. Dazu gehört das Ablösen der Trichome vom Pflanzenmaterial mit Hilfe von Trockeneis im ersten Schritt und das Ersetzen des üblicherweise verwendeten flüssigen Puffermediums durch LN. Die erste Modifikation für die Reinigung von C. sativa-Trichomen basiert auf einem früheren Protokoll, das die Verwendung von zerkleinertem Trockeneis zur Ablösung der Trichome vo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush