Aislamiento no acuoso y enriquecimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa

Resumen

Se presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. El protocolo se basa en una extracción seca y sin tampón de tricomas utilizando solo nitrógeno líquido, hielo seco y tamices de nylon y es adecuado para la extracción de ARN y el análisis transcriptómico.

Resumen

Este documento presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. Las vías biosintéticas para el metabolismo de los cannabinoides y los terpenos volátiles se localizan principalmente en los tricomas del cannabis , y los tricomas aislados son beneficiosos para el análisis del transcriptoma. Los protocolos existentes para aislar tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica son inconvenientes y proporcionan cabezas de tricomas comprometidas y una cantidad relativamente baja de tricomas aislados. Además, dependen de aparatos costosos y medios de aislamiento que contienen inhibidores de proteínas para evitar la degradación del ARN. El presente protocolo sugiere combinar tres modificaciones individuales para obtener una gran cantidad de tricomas glandulares capitados y sésiles aislados de inflorescencias femeninas maduras de C. sativa y hojas de abanico, respectivamente. La primera modificación consiste en sustituir el nitrógeno líquido por el medio de aislamiento convencional para facilitar el paso de tricomas a través de los microtamices. La segunda modificación consiste en usar hielo seco para separar los tricomas de la fuente vegetal. La tercera modificación consiste en pasar el material vegetal consecutivamente a través de cinco micro-tamices de tamaños de poro decrecientes. Las imágenes microscópicas demostraron la efectividad de la técnica de aislamiento para ambos tipos de tricomas. Además, la calidad del ARN extraído de los tricomas aislados fue apropiada para el análisis transcriptómico posterior.

Introducción

Los tricomas glandulares son estructuras similares a pelos presentes en las plantas que contienen muchos metabolitos secundarios¹ y representan un valioso banco de nuevos genes biosintéticos y enzimas². En el cannabis, la biosíntesis de los metabolitos secundarios importantes, los cannabinoides³ y los terpenos⁴, se localiza en los tricomas. Teniendo en cuenta el papel de los tricomas en la determinación de la calidad del cannabis tanto para usos medicinales como recreativos, el estudio de la expresión génica de tricomas es de interés. Para caracterizar la ....

Protocolo

NOTA: El material vegetal utilizado en este estudio consistió en cuatro cepas de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 y CS-14) que se cultivaron en el Centro Volcani, Israel, como se describe en otra parte¹¹. Los tricomas glandulares capitados tallados se aislaron de inflorescencias de floración maduras, y los tricomas sésiles capitados glandulares se aislaron de grandes hojas de abanico de plantas madre maduras sin flores. Todo el material vegetal fue recogido e inmediatamente almacenado a -80 °C.

PRECAUCIÓN: El hielo seco y LN se utilizan en todo el protocolo. Estas sustancias son extremadamente peli....

Resultados

La principal modificación incluida en este protocolo en comparación con los protocolos convencionales de aislamiento de tricomas es sustituir el medio de aislamiento estándar por LN. El uso de LN como medio de aislamiento permite un flujo de trabajo relajado, porque mientras las muestras estén sumergidas en LN, no es probable que ocurra degradación metabólica. Además, como el protocolo evita los componentes peligrosos (es decir, ácido aurintricarboxílico y β-mercaptoetanol) utilizados en el medio tradicional de.......

Discusión

En comparación con los protocolos de aislamiento de tricomas actualmente disponibles, en el presente protocolo se describen dos modificaciones principales. Estos incluyen el desprendimiento de los tricomas del material vegetal utilizando hielo seco en el paso inicial y la sustitución de LN por el medio tampón líquido comúnmente utilizado. La primera modificación para la purificación de tricomas de C. sativa se basa en un protocolo anterior que introdujo el uso de hielo seco picado para separar los tricoma.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush