Aislamiento no acuoso y enriquecimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa

Resumen

Se presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. El protocolo se basa en una extracción seca y sin tampón de tricomas utilizando solo nitrógeno líquido, hielo seco y tamices de nylon y es adecuado para la extracción de ARN y el análisis transcriptómico.

Resumen

Este documento presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. Las vías biosintéticas para el metabolismo de los cannabinoides y los terpenos volátiles se localizan principalmente en los tricomas del cannabis , y los tricomas aislados son beneficiosos para el análisis del transcriptoma. Los protocolos existentes para aislar tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica son inconvenientes y proporcionan cabezas de tricomas comprometidas y una cantidad relativamente baja de tricomas aislados. Además, dependen de aparatos costosos y medios de aislamiento que contienen inhibidores de proteínas para evitar la degradación del ARN. El presente protocolo sugiere combinar tres modificaciones individuales para obtener una gran cantidad de tricomas glandulares capitados y sésiles aislados de inflorescencias femeninas maduras de C. sativa y hojas de abanico, respectivamente. La primera modificación consiste en sustituir el nitrógeno líquido por el medio de aislamiento convencional para facilitar el paso de tricomas a través de los microtamices. La segunda modificación consiste en usar hielo seco para separar los tricomas de la fuente vegetal. La tercera modificación consiste en pasar el material vegetal consecutivamente a través de cinco micro-tamices de tamaños de poro decrecientes. Las imágenes microscópicas demostraron la efectividad de la técnica de aislamiento para ambos tipos de tricomas. Además, la calidad del ARN extraído de los tricomas aislados fue apropiada para el análisis transcriptómico posterior.

Introducción

Los tricomas glandulares son estructuras similares a pelos presentes en las plantas que contienen muchos metabolitos secundarios¹ y representan un valioso banco de nuevos genes biosintéticos y enzimas². En el cannabis, la biosíntesis de los metabolitos secundarios importantes, los cannabinoides³ y los terpenos⁴, se localiza en los tricomas. Teniendo en cuenta el papel de los tricomas en la determinación de la calidad del cannabis tanto para usos medicinales como recreativos, el estudio de la expresión génica de tricomas es de interés. Para caracterizar la expresión de genes específicos de tricomas, primero se deben aislar los tricomas de interés. Los protocolos de aislamiento de tricomas se describieron por primera vez ya en 1992⁵, y sus últimos desarrollos han sido revisados recientemente². En general, los protocolos para extraer tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica se pueden dividir en dos pasos secuenciales distintos. El primer paso implica una separación física completa de los tricomas del tejido vegetal. Este paso se puede realizar utilizando hielo seco⁵, perlas de vidrio con un aparato comercial ^6,7, moliendo el material vegetal contra un tamiz de malla^8, o vórtice del tejido vegetal en un tampón de aislamiento⁹. El segundo paso implica una separación más refinada de los tricomas de interés del residuo microscópico de la planta y / u otros tipos de tricomas. Este paso se puede ejecutar utilizando centrifugación por gradiente de densidad ^8,10 o tamices de varios tamaños ^7,9. Debido a la extrema sensibilidad del ARN en los tejidos procesados a los agentes degradantes, estos dos pasos secuenciales generalmente se realizan en el medio de aislamiento helado, a menudo en presencia de inhibidores de proteínas⁴.

Los protocolos convencionales de aislamiento de tricomas requieren, además de las temperaturas heladas, grandes cantidades de medio de aislamiento para garantizar un procedimiento de extracción eficiente. La combinación de estos componentes da como resultado un proceso de aislamiento arduo y lento que dificulta el alto rendimiento. Por lo tanto, es probable que la presentación de un protocolo alternativo de aislamiento de tricomas sencillo y fácil de usar sea beneficioso para varios aspectos asociados con la caracterización de tricomas. El presente trabajo tiene como objetivo ofrecer un protocolo alternativo para aislar tricomas capitados glandulares tallados y sésiles de Cannabis sativa mediante la combinación e integración de varios elementos de los protocolos convencionales. Estos elementos incluyen el hielo seco⁵, el paso de los tricomas a través de varios microtamices con tamaños de poro decrecientes^7,9, y la sustitución del nitrógeno líquido (LN) por el medio de aislamiento⁸.

La novedad del actual protocolo de aislamiento de tricomas, en comparación con los protocolos convencionales, se presenta de varias maneras. Este protocolo es conveniente, ya que no requiere componentes peligrosos. El procedimiento se puede realizar en el laboratorio con precauciones mínimas y facilita un alto rendimiento. La sustitución del medio de aislamiento líquido estándar por LN garantiza la integridad de los tricomas durante todo el proceso de aislamiento, lo que permite un posterior análisis transcriptómico. Tras la sublimación del LN y el hielo seco, los tricomas aislados quedan libres de residuos dañinos. Además, la propensión de LN a sublimar a temperatura ambiente permite su uso generoso en todo el protocolo. Por el contrario, el uso de grandes volúmenes de medio de aislamiento convencional genera dificultades prácticas en su manejo. Finalmente, el protocolo disminuye la separación de la célula del disco de la frágil estructura de la cabeza restante del tricoma glandular, lo que permite la retención del contenido del espacio de cabeza.

Este protocolo se presenta de manera detallada paso a paso diseñado para ayudar a la práctica técnica de aislar tricomas capitales glandulares de C. sativa. El protocolo proporciona un flujo de trabajo manejable que da como resultado tricomas aislados con una alta concentración y pureza que son apropiados para el análisis molecular posterior.

Protocolo

NOTA: El material vegetal utilizado en este estudio consistió en cuatro cepas de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 y CS-14) que se cultivaron en el Centro Volcani, Israel, como se describe en otra parte¹¹. Los tricomas glandulares capitados tallados se aislaron de inflorescencias de floración maduras, y los tricomas sésiles capitados glandulares se aislaron de grandes hojas de abanico de plantas madre maduras sin flores. Todo el material vegetal fue recogido e inmediatamente almacenado a -80 °C.

PRECAUCIÓN: El hielo seco y LN se utilizan en todo el protocolo. Estas sustancias son extremadamente peligrosas. Los tricomas aislados pueden contener partículas de hielo seco que pueden crear una presión de gas peligrosa cuando se insertan en tubos sellados; Por lo tanto, todas las tapas deben perforarse con agujas. Se recomienda encarecidamente el uso de gafas protectoras, ropa de laboratorio adecuada y guantes para el manejo a temperaturas extremadamente bajas.

1. Configuración para la separación inicial de tricomas del material vegetal

1. Aplaste un bloque de hielo seco en pequeñas escamas finas con un martillo y un objeto plano duro en un recipiente de plástico de 5 L.
2. Tamizar los copos finos de hielo seco (menores de 5 mm) del hielo seco no triturado con un colador grande (a través de poros menores de 5 mm) en otro recipiente de plástico de 5 L. Vierta aproximadamente 200 cm³ (marca de 200 ml) de los copos de hielo seco en un vaso de precipitados de vidrio vertical de 1 L.
3. Agregue hasta 10 g de inflorescencias congeladas de C. sativa (en adelante denominadas material vegetal) sobre la primera capa de hielo seco picado y cubra con una capa adicional de 200^cm3 de hielo seco finamente triturado.
4. Cubra la abertura del vaso de precipitados de vidrio de 1 L con dos o tres capas de mosquitero de puerta de 1 mm y asegúrelo a los lados exteriores de la taza de vidrio con bandas de goma (Figura 1).
5. Vierta LN en un recipiente grande de acero inoxidable de fondo redondo (consulte la Tabla de materiales), donde se recogerán los tricomas aislados.
6. Inserte una malla de 350 μm en un colador tamizador/tamiz de harina para cubrir la malla tamiz de harina desde abajo (Figura 2). Si hay disponible un tamiz de harina con un anillo de plástico desmontable, inserte la malla de 350 μm para que quede asegurada debajo de la malla del tamiz de harina. De lo contrario, asegure la malla de 350 μm a la circunferencia del tamiz de harina con bandas elásticas.
7. Coloque el tamiz de harina sobre el recipiente grande de acero inoxidable de fondo redondo lleno de LN (Figura 3). Asegúrese de que el ancho del recipiente exceda el del tamiz de harina para minimizar la pérdida de la masa tamizada fuera del recipiente de acero inoxidable de fondo redondo.

2. Separación de tricomas del material vegetal

1. Agite el vaso de 1 L con su abertura apuntando hacia abajo hacia el tamiz de harina como si usara un salero grande (Figura 4).
2. Deje a un lado el vaso de precipitados de vidrio de 1 L cada 2-3 minutos para permitir el tamizado del hielo seco triturado y el material vegetal acumulado en el tamiz de harina.
3. Tamizar el tamiz de harina horizontalmente para facilitar el paso del material vegetal al LN en el recipiente de acero inoxidable de fondo redondo que se encuentra debajo.
4. Agregue LN al recipiente de acero inoxidable y hielo seco picado al vaso de precipitados de vidrio de 1 L cuando sus niveles sean bajos. Reponga el material vegetal usado en el vaso de precipitados de vidrio con 10 g adicionales de material vegetal fresco cuando el material vegetal en el tamiz de harina se agote. La reposición generalmente no tiene que repetirse más de dos veces.
5. Repita los pasos 2.1-2.4 hasta que se haya recogido una cantidad suficiente de tricomas enriquecidos en el recipiente de acero inoxidable de fondo redondo. En general, 20 g de material vegetal fresco es suficiente para la extracción de ARN y el análisis del transcriptoma.
6. Verifique que haya una sustancia blanca similar al polvo (que consiste en restos de plantas, tricomas glandulares y hielo seco triturado) en el fondo del recipiente de acero inoxidable sumergido en el LN. Una observación microscópica ayudará a determinar si se ha recolectado una cantidad suficiente de tricomas; Sin embargo, este paso podría obstruir el flujo del protocolo. Por lo general, 10-20 g de material vegetal inicial son suficientes para la mayoría de los aislamientos; Sin embargo, puede haber diferencias en la densidad de tricomas de las plantas.
   NOTA: A partir de este punto, el experimento se puede pausar y reiniciar más tarde. Si se detiene por un corto tiempo, se deben agregar cantidades adecuadas de LN para que los tricomas permanezcan sumergidos. Alternativamente, los tricomas se pueden recolectar y almacenar a -80 ° C durante un máximo de 3 meses para su uso posterior, como se describe en el paso 5.

3. Separación de tricomas capitados glandulares (tallados y sésiles) de otros tipos de tricomas, como tricomas bulbosos y cistolíticos, y desechos

1. Agregue una pequeña cantidad de LN a un recipiente limpio y pequeño de acero inoxidable de fondo redondo.
2. Doblar dos veces un microtamiz de 40 cm x 40 cm con un tamaño de malla de 150 μm para obtener un pliegue de 20 cm x 20 cm y abrirlo. Asegúrese de que se asemeje a una forma de cono (Figura 5).
3. Asegure el cono de malla al borde del contenedor de acero inoxidable de fondo redondo con una o dos pinzas para la ropa de modo que la parte abierta del cono quede en posición vertical y su parte puntiaguda esté parcialmente sumergida en el LN.
4. Vierta suavemente el LN y la sustancia blanca en polvo del paso 2.6 en el cono del microtamiz.
5. Aplique suavemente un cepillo ancho para recoger y transferir cualquier material vegetal restante del primer recipiente al cono de malla de 150 μm.
6. Agregue más LN al primer recipiente y repita el movimiento de cepillado hasta que todo el material vegetal se transfiera al cono de microtamiz.
7. Separe con cuidado la pinza de la tapa del recipiente y abra el cono de microtamiz para que los tricomas se ubiquen en el centro del microtamiz abierto. Mantenga las cuatro esquinas del microtamiz juntas para que la parte media que contiene los tricomas permanezca sumergida en el LN (Figura 6).
8. Mientras sostiene las cuatro esquinas del microtamiz, sumerja y agite suavemente el microtamiz en el LN en el recipiente de acero como si estuviera infundiendo una bolsa de té. Continúe con este movimiento de inmersión/agitación (vertical y horizontal) durante 1 minuto. Hay una compensación entre la calidad y la cantidad de aislamiento. Los movimientos de inmersión más largos pueden resultar en mayores cantidades de tricomas, pero su grado de aislamiento puede ser más pobre. En general, se recomienda 1 minuto como adecuado tanto para la calidad como para la cantidad.
   NOTA: Este movimiento de tamizado es la parte más crítica del protocolo y debe ejecutarse en consecuencia.
9. Opcional: Recoger los restos vegetales no tamizados y los tricomas más grandes (aún sumergidos en el LN) que se envuelven en el centro del microtamiz en un tubo de ensayo de 13 ml o 50 ml, y almacenar a -80 °C para su uso futuro.
   PRECAUCIÓN: Para evitar la acumulación de gas a presión (del hielo seco y residuos de LN), perfore un orificio en la tapa del tubo de ensayo con una aguja esterilizada. La tapa se puede reemplazar una vez que la presión se ha reducido, que generalmente es después de 24 h.

4. Pasar tricomas a través de micro-tamices de tamaño de poro decreciente

1. Transfiera los tricomas tamizados sumergidos en el LN en el fondo del pequeño recipiente de acero inoxidable de fondo redondo secuencialmente a través de microtamices con tamaños de poro decrecientes (105 μm, 80 μm, 65 μm y 50 μm), de la misma manera que se presenta en el paso 3.

5. Recogida de los tricomas deseados

1. Retire los tricomas deseados sumergidos en el LN y envueltos en el microtamiz de 50 μm con una cuchara preenfriada (en LN). Colócalos en un plato limpio.
   NOTA: En esta etapa final de aislamiento, los tricomas deseados se recogen del tamiz.
2. Transfiera rápidamente los tricomas en polvo a un tubo de 1,5 ml preenfriado etiquetado a través de una espátula preenfriada o una cuchara insertada en el tubo (Figura 7). Conservar los tubos inmediatamente a -80 °C para estudios adicionales.
   NOTA: En la figura 8 se proporciona un gráfico de flujo de trabajo esquemático que representa todo el protocolo de aislamiento.

6. Observación y análisis de los tricomas purificados

1. Coloque una pequeña cantidad (10 mg) de tricomas aislados en un portaobjetos de microscopio utilizando una espátula preenfriada (a través de LN). Agregue una gota de agua y observe directamente en un microscopio óptico sin manchas. Evalúe el grado general de aislamiento y contaminación utilizando aumentos bajos (10x) y altos (40x). El enriquecimiento se estima visualmente por la cantidad relativa de tricomas con respecto al tejido no tricomático, como se muestra en la Figura 9.
2. Realizar extracción de ARN y análisis de calidad a partir de 50 mg de tricomas aislados de tallo y sésil habitante glandular de C. sativa.
   NOTA: Para la extracción de ARN se utilizó un kit de extracción comercial (ver Tabla de materiales) que empleaba una estrategia basada en poli-A de purificación de ARNm.
   1. Resuspender 50 mg de los tricomas aislados en la solución de lisis, vórtice durante 30 s, sonicar en una unidad de limpieza ultrasónica helada a 35 kHz durante 5 min, y extraer el ARNm de las muestras de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de materiales).
   2. Para estimar la integridad del ARN extraído de los tricomas, determine la concentración de ARN, la cantidad total y los valores del número de integridad del ARN (RIN) utilizando un sistema de laboratorio en un chip (consulte la Tabla de materiales).
   3. Realizar análisis RNAseq de las fracciones de tricomas (opcional). El análisis de RNAseq y los análisis bioinformáticos de lecturas secuenciadas pueden realizarse mediante servicios de externalización estándar

Resultados

La principal modificación incluida en este protocolo en comparación con los protocolos convencionales de aislamiento de tricomas es sustituir el medio de aislamiento estándar por LN. El uso de LN como medio de aislamiento permite un flujo de trabajo relajado, porque mientras las muestras estén sumergidas en LN, no es probable que ocurra degradación metabólica. Además, como el protocolo evita los componentes peligrosos (es decir, ácido aurintricarboxílico y β-mercaptoetanol) utilizados en el medio tradicional de...

Discusión

En comparación con los protocolos de aislamiento de tricomas actualmente disponibles, en el presente protocolo se describen dos modificaciones principales. Estos incluyen el desprendimiento de los tricomas del material vegetal utilizando hielo seco en el paso inicial y la sustitución de LN por el medio tampón líquido comúnmente utilizado. La primera modificación para la purificación de tricomas de C. sativa se basa en un protocolo anterior que introdujo el uso de hielo seco picado para separar los tricoma...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush