Неводная изоляция и обогащение железистых головчатых черешковых и сидячих трихом из Cannabis sativa

Резюме

Представлен протокол для удобной и высокопроизводительной изоляции и обогащения железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом из Cannabis sativa. Протокол основан на сухой, небуферной экстракции трихом с использованием только жидкого азота, сухого льда и нейлоновых сит и подходит для экстракции РНК и транскриптомного анализа.

Аннотация

В этой статье представлен протокол для удобной и высокопроизводительной изоляции и обогащения железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом из Cannabis sativa. Пути биосинтеза метаболизма каннабиноидов и летучих терпенов локализованы в основном в трихомах каннабиса , а изолированные трихомы полезны для анализа транскриптома. Существующие протоколы выделения железистых трихом для транскриптомной характеристики неудобны и обеспечивают скомпрометированные трихомные головки и относительно небольшое количество изолированных трихом. Кроме того, они полагаются на дорогостоящие аппараты и изолирующие среды, содержащие ингибиторы белка, чтобы избежать деградации РНК. Настоящий протокол предлагает объединить три отдельные модификации для получения большого количества изолированных железистых головчатых черешковых и сидячих трихом из зрелых женских соцветий и веерных листьев C. sativa соответственно. Первая модификация включает в себя замену жидкого азота на обычную изолирующую среду для облегчения прохождения трихом через микросита. Вторая модификация включает в себя использование сухого льда для отделения трихом от растительного источника. Третья модификация включает в себя последовательное прохождение растительного материала через пять микросит с уменьшающимися размерами пор. Микроскопическая визуализация продемонстрировала эффективность метода изоляции для обоих типов трихом. Кроме того, качество РНК, выделенной из изолированных трихом, соответствовало последующему транскриптомному анализу.

Введение

Железистые трихомы представляют собой волосовидные структуры, присутствующие в растениях, которые содержат много вторичных метаболитов¹ и представляют собой ценный банк новых биосинтетических генов и ферментов². В каннабисе биосинтез важных вторичных метаболитов, каннабиноидов³ и терпенов⁴, локализуется в трихомах. Учитывая роль трихом в определении качества каннабиса как для медицинского, так и для рекреационного использования, представляет интерес изучение экспрессии генов трихом. Чтобы охарактеризовать экспрессию трихом-специфических генов, сначала необходимо выделить интересующие трихомы. Протоколы изоляции трихом были впервые описаны еще в 1992 году⁵, а их последние разработки были недавно пересмотрены². В целом, протоколы экстракции железистых трихом для транскриптомной характеристики можно разделить на два отдельных последовательных этапа. Первый шаг включает в себя тщательное физическое отделение трихом от растительной ткани. Этот этап может быть выполнен с использованием сухого льда⁵, стеклянных шариков с помощью коммерческого устройства^6,7, измельчения растительного материала против сетчатого сита⁸ или вихривания растительной ткани в изолирующем буфере⁹. Вторая стадия включает в себя более тонкое отделение интересующих трихом от микроскопических растительных остатков и/или других типов трихом. Этот этап может быть выполнен с помощью центрифугирования с градиентом^{плотности 8,10} или сит различных размеров ^7,9. Из-за чрезвычайной чувствительности РНК в обработанных тканях к разлагающим агентам эти два последовательных этапа обычно проводят в ледяной изолирующей среде, часто в присутствии ингибиторов белка⁴.

Обычные протоколы изоляции трихом требуют, в дополнение к ледяным температурам, большого количества изолирующей среды для обеспечения эффективной процедуры экстракции. Сочетание этих компонентов приводит к трудному и длительному процессу изоляции, который препятствует высокой пропускной способности. Таким образом, представление простого, удобного для пользователя альтернативного протокола изоляции трихомы, вероятно, будет полезно для различных аспектов, связанных с характеристикой трихомы. Цель настоящей статьи состоит в том, чтобы предложить альтернативный протокол выделения черешковых и сидячих железистых головчатых трихом из Cannabis sativa путем объединения и интеграции нескольких элементов из обычных протоколов. Эти элементы включают сухой лед⁵, пропускание трихом через несколько микросит с уменьшением размера пор ^7,9 и замену изолирующей среды⁸ жидким азотом (LN).

Новизна настоящего протокола изоляции трихом, по сравнению с традиционными протоколами, проявляется в ряде аспектов. Этот протокол удобен тем, что не требует опасных компонентов. Процедура может проводиться в лаборатории с минимальными мерами предосторожности и обеспечивает высокую пропускную способность. Замена LN на стандартную жидкую изолирующую среду обеспечивает целостность трихом на протяжении всего процесса изоляции, что позволяет проводить последующий транскриптомный анализ. После сублимации LN и сухого льда изолированные трихомы остаются свободными от вредных остатков. Кроме того, склонность LN к сублимации при комнатной температуре позволяет широко использовать его во всем протоколе. Напротив, использование больших объемов обычной изоляционной среды создает практические трудности при обращении с ней. Наконец, протокол уменьшает отделение клетки диска от оставшейся хрупкой структуры головки железистой трихомы, что позволяет сохранить содержимое свободного пространства.

Этот протокол представлен в подробном пошаговом виде, предназначенном для оказания технической помощи в выделении железистых головчатых трихом C. sativa. Протокол обеспечивает управляемый рабочий процесс, в результате которого получаются изолированные трихомы с высокой концентрацией и чистотой, подходящие для последующего молекулярного анализа.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Растительный материал, использованный в этом исследовании, состоял из четырех штаммов C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 и CS-14), которые были выращены в Центре Вулкани, Израиль, как описано в другом месте¹¹. Железистые головчатые черешковые трихомы были выделены из зрелых цветущих соцветий, а железистые головчатые сидячие трихомы были выделены из крупных веерных листьев зрелых нецветущих материнских растений. Все растительное сырье было свежесобрано и сразу же хранилось при температуре -80 °C.

ВНИМАНИЕ: Сухой лед и LN используются во всем протоколе. Эти вещества чрезвычайно опасны. Изолированные трихомы могут содержать частицы сухого льда, которые могут создавать опасное давление газа при введении в герметичные трубки; Поэтому все колпачки должны быть проколоты иглой. Настоятельно рекомендуется использовать защитные очки, соответствующую лабораторную одежду и перчатки для работы при экстремально низких температурах.

1. Установка для первичного отделения трихом от растительного материала

1. Измельчите блок сухого льда на мелкие мелкие хлопья с помощью молотка и твердого плоского предмета в пластиковом контейнере объемом 5 л.
2. Просейте мелкие хлопья сухого льда (менее 5 мм) из неизмельченного сухого льда с помощью большого ситечка (через поры менее 5 мм) в другой пластиковый контейнер объемом 5 л. Насыпьте примерно 200 см³ (отметка 200 мл) хлопьев сухого льда в вертикальный стеклянный стакан объемом 1 л.
3. На первый слой измельченного сухого льда добавьте до 10 г замороженных соцветий C. sativa (отныне именуемых растительным материалом) и накройте дополнительным слоем 200 см³ мелко измельченного сухого льда.
4. Закройте отверстие стеклянного стакана объемом 1 л двумя-тремя слоями москитной сетки с экраном диаметром 1 мм и закрепите его на внешних сторонах стеклянной чашки резиновыми лентами (рис. 1).
5. Налейте LN в большой контейнер из нержавеющей стали с круглым дном (см. Таблицу материалов), где будут собираться изолированные трихомы.
6. Вставьте ячейку размером 350 мкм в просеиватель/ситечко для муки, чтобы покрыть сетку просеивателя муки снизу (рис. 2). Если имеется просеиватель муки со съемным пластиковым кольцом, вставьте ячейку размером 350 мкм так, чтобы она была закреплена под сеткой просеивателя муки. Если нет, закрепите сетку 350 мкм по окружности просеивателя муки с помощью резинок.
7. Поместите просеиватель муки над большим контейнером из нержавеющей стали с круглым дном, наполненным LN (рис. 3). Убедитесь, что ширина контейнера превышает ширину просеивателя муки, чтобы свести к минимуму потери просеянной массы за пределами контейнера из нержавеющей стали с круглым дном.

2. Отделение трихом от растительного материала

1. Встряхните стакан объемом 1 л так, чтобы его отверстие было направлено вниз к просеивателю муки, как если бы вы использовали большую солонку (рис. 4).
2. Откладывайте стакан объемом 1 л каждые 2-3 минуты, чтобы можно было просеять измельченный сухой лед и растительный материал, скопившийся на мучном сите.
3. Просейте сито для муки горизонтально, чтобы облегчить прохождение растительного материала в LN в контейнере из нержавеющей стали с круглым дном, расположенном ниже.
4. Добавьте LN в контейнер из нержавеющей стали и измельченный сухой лед в стеклянный стакан объемом 1 л, когда их уровень иссякнет. Пополните использованный растительный материал в стеклянном стакане дополнительными 10 г свежего растительного материала, когда растительный материал на мучном сите истощится. Пополнение обычно не приходится повторять более двух раз.
5. Повторяйте шаги 2.1-2.4 до тех пор, пока в контейнере из нержавеющей стали с круглым дном не будет собрано достаточное количество обогащенных трихом. Как правило, 20 г свежего растительного материала достаточно для выделения РНК и анализа транскриптома.
6. Убедитесь, что на дне контейнера из нержавеющей стали, погруженного в LN, есть белое порошкообразное вещество (состоящее из растительных остатков, железистых трихом и измельченного сухого льда). Микроскопическое наблюдение поможет определить, было ли собрано достаточное количество трихом; Однако этот шаг может затруднить поток протокола. Обычно для большинства выделений достаточно 10-20 г исходного растительного материала; Однако могут быть различия в плотности трихомы растений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента эксперимент можно приостановить и возобновить позже. При кратковременной паузе следует добавить достаточное количество LN, чтобы трихомы оставались погруженными в воду. Альтернативно, трихомы можно собирать и хранить при -80 °С до 3 месяцев для последующего использования, как описано на шаге 5.

3. Отделение железистых головчатых трихом (черешковых и сидячих) от других типов трихом, таких как луковичные и цистолитические трихомы и мусор

1. Добавьте небольшое количество LN в чистый небольшой контейнер из нержавеющей стали с круглым дном.
2. Сложите микросито размером 40 см x 40 см с размером ячеек 150 мкм дважды, чтобы получить сгиб 20 см x 20 см, и откройте его. Убедитесь, что он напоминает конусообразную форму (рис. 5).
3. Прикрепите сетчатый конус к краю контейнера из нержавеющей стали с круглым дном с помощью одной или двух прищепок так, чтобы открытая часть конуса находилась в вертикальном положении, а его заостренная часть была частично погружена в LN.
4. Аккуратно вылейте LN и белое порошкообразное вещество из шага 2.6 в конус микросита.
5. Аккуратно нанесите широкую кисть, чтобы собрать и перенести оставшийся растительный материал из первого контейнера в ячеистый конус размером 150 мкм.
6. Добавьте больше LN в первый контейнер и повторяйте чистящие движения, пока весь растительный материал не будет перенесен в конус микросита.
7. Аккуратно отсоедините прищепку от крышки контейнера, и откройте конус микросита так, чтобы трихомы располагались посередине открытого микросита. Держите все четыре угла микросита вместе так, чтобы средняя часть, содержащая трихомы, оставалась погруженной в LN (рис. 6).
8. Держась за все четыре угла микросита, аккуратно окуните и встряхните микросито в LN в стальном контейнере, как если бы вы настаивали чайный пакетик. Продолжайте это погружение/встряхивание (вертикальное и горизонтальное) движение в течение 1 минуты. Существует компромисс между качеством изоляции и количеством. Более длительные движения погружения могут привести к большему количеству трихом, но степень их изоляции может быть хуже. В целом, 1 минута рекомендуется как достаточная как для качества, так и для количества.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это просеивающее движение является наиболее важной частью протокола и должно выполняться соответствующим образом.
9. Дополнительно: Зачерпните непросеянные растительные остатки и более крупные трихомы (все еще погруженные в LN), которые завернуты в центр микросита, в пробирку объемом 13 мл или 50 мл и храните при температуре -80 ° C для использования в будущем.
   ВНИМАНИЕ: Во избежание накопления газа под давлением (из сухого льда и остатков LN) проколите отверстие в колпачке пробирки стерилизованной иглой. Колпачок можно заменить после снижения давления, что обычно происходит через 24 часа.

4. Прохождение трихом через микросита с уменьшением размера пор

1. Просеянные трихомы, погруженные в LN на дне небольшого контейнера из нержавеющей стали с круглым дном, последовательно перемещают через микросита с уменьшающимися размерами пор (105 мкм, 80 мкм, 65 мкм и 50 мкм) таким же образом, как показано на шаге 3.

5. Сбор желаемых трихом

1. Удалите нужные трихомы, погруженные в LN и завернутые в микросито 50 мкм, с помощью предварительно охлажденной (в LN) ложки. Выложите их на чистую тарелку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом заключительном этапе изоляции желаемые трихомы собирают из сита.
2. Быстро перенесите порошкообразные трихомы в маркированную предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл с помощью предварительно охлажденного шпателя или совка, вставленного в пробирку (рис. 7). Немедленно храните пробирки при температуре -80 °C для дальнейших исследований.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая схема рабочего процесса, изображающая весь протокол изоляции, показана на рисунке 8.

6. Наблюдение и анализ очищенных трихом

1. Поместите небольшое количество (10 мг) изолированных трихом на предметное стекло микроскопа с помощью предварительно охлажденного (через LN) шпателя. Добавьте каплю воды и наблюдайте прямо на световом микроскопе, не окрашивая. Оцените общую изоляцию и степень загрязнения, используя низкое (10-кратное) и большое (40-кратное) увеличение. Обогащение визуально оценивается по относительному количеству трихом по отношению к нетрихомной ткани, как показано на рисунке 9.
2. Проведите экстракцию РНК и анализ качества из 50 мг изолированных железистых головчатых стеблевых и сидячих трихом C. sativa.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции РНК использовался коммерческий набор для экстракции (см. Таблицу материалов), использующий стратегию очистки мРНК на основе поли-А.
   1. Ресуспендируют 50 мг изолированных трихом в лизирующем растворе, вихревом в течение 30 с, обрабатывают ультразвуком в установке ультразвуковой очистки с ледяной частотой 35 кГц в течение 5 мин и извлекают мРНК из образцов в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
   2. Чтобы оценить целостность РНК, выделенной из трихом, определите концентрацию РНК, общее количество и значения числа целостности РНК (RIN) с помощью системы «лаборатория-на-чипе» (см. Таблицу материалов).
   3. Проведите анализ RNAseq фракций трихомы (опционально). Анализ RNAseq и биоинформатический анализ секвенированных считываний могут выполняться стандартными аутсорсинговыми службами

Результаты

Основной модификацией, включенной в этот протокол по сравнению с обычными протоколами изоляции трихомы, является замена стандартной изолирующей среды на LN. Использование LN в качестве изолирующей среды обеспечивает расслабленный рабочий процесс, поскольку до тех пор, пока образцы пог?...

Обсуждение

По сравнению с имеющимися в настоящее время протоколами изоляции трихом, в настоящем протоколе описаны две основные модификации. К ним относятся отделение трихом от растительного материала с использованием сухого льда на начальном этапе и замена LN обычно используемой жидкой буферной...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip	Agilent, Germany	Reorder number 5067-1513	Lab-on-a-chip system
Transsonic-310	Elma, Germany	D-78224	Ultrasonic cleaning unit
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2	Illumina, USA	RS-122-2001	Sample preperation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit	SIGMA-ALDRICH, USA	STRN50-1KT	Plant Total RNA Kit
Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter)	Sinun Tech, Israel	r0350n350210	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0150n360465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0105n320718	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0065n340715	Nylon screen aperture
Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm)	Sinun Tech, Israel	r0080n370465	Nylon screen aperture
Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen)
Suitable gloves for handling low temperatures
Safety goggles
1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm)
Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm
1 L glass beaker
1 block of dry ice (0.5-1 kg)
Hammer and hard flat object
Two 5 L plastic containers
Rubber bands
Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference
Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container
Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula
Clean plate
Several clothespins
Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle
Two containers of liquid nitrogen
1 cm wide painting brush