Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تكشف هذه الدراسة عن آلية Trichosanthes-Fritillaria thunbergii في علاج سرطان الرئة الغدي بناء على علم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي. توضح الدراسة أيضا أن مسار إشارات PI3K / AKT يلعب دورا حيويا في عمل Trichosanthes-Fritillaria thunbergii في علاج سرطان الرئة الغدي.

Abstract

كنا نهدف إلى دراسة آلية Trichosanthes-Fritillaria thunbergii في علاج سرطان الرئة الغدي (LUAD) بناء على علم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي. تم جمع المكونات الفعالة والأهداف المحتملة ل Trichosanthis و Fritillaria thunbergii من خلال تجربة عالية الإنتاجية وقاعدة بيانات موجهة بالمراجع (HERB) للطب الصيني التقليدي وقاعدة بيانات نهج مجموعة التشابه (SEA) ، وتم الاستعلام عن الأهداف المتعلقة ب LUAD بواسطة GeneCards وقواعد بيانات الميراث المندلي عبر الإنترنت (OMIM). تم إنشاء شبكة مستهدفة لمكونات الأدوية بواسطة برنامج Cytoscape. تم إجراء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) ، ووظيفة أنطولوجيا الجينات (GO) ، وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) لإثراء المسار للحصول على الأهداف الأساسية والمسارات الرئيسية. تم استخدام مستخلص مائي من خلايا Trichosanthes-Fritillaria thunbergii و A549 للتحقق التجريبي اللاحق. من خلال قاعدة بيانات HERB والبحث في الأدبيات ، تم فحص 31 مركبا فعالا و 157 جينا مستهدفا محتملا ل Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ، منها 144 هدفا تنظيميا ل Trichosanthes-Fritillaria thunbergii في علاج سرطان الرئة الغدي. أظهر تحليل الإثراء الوظيفي GO أن آلية عمل Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ضد سرطان الرئة الغدي هي أساسا فسفرة البروتين. اقترح تحليل إثراء مسار KEGG أن علاج سرطان الرئة الغدي بواسطة Trichosanthes-Fritillaria thunbergii يتضمن بشكل أساسي مسار إشارات PI3K / AKT. أظهر التحقق التجريبي أن المستخلص المائي من Trichosanthes-Fritillaria thunbergii يمكن أن يمنع تكاثر خلايا A549 وفسفرة AKT. من خلال علم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي ، تم التحقق من أن مسار إشارات PI3K / AKT يلعب دورا حيويا في عمل Trichosanthes-Fritillaria thunbergii في علاج سرطان الرئة الغدي.

Introduction

يشير سرطان الرئة إلى الأورام الخبيثة الناشئة من الغشاء المخاطي القصبي في الرئة ، بما في ذلك سرطان الخلايا الحرشفية والسرطان الغدي وسرطان الخلايا الكبيرة وسرطان الخلايا الصغيرة1. سرطان الرئة الغدي (LUAD) هو النوع الأكثر شيوعا من سرطان الرئة ، وهو ما يمثل حوالي 40 ٪ من إجمالي حالات سرطان الرئة2. يتم تشخيص معظم المرضى في مرحلة متقدمة أو لديهم ورم خبيث عن بعد ، وبالتالي يفقدون فرصة الجراحة3. في العلاج السريري الحالي ، يعد العلاج الكيميائي الإشعاعي المتزامن هو الإستراتيجية الأكثر شيوعا لعلاج LUAD ، لكن تطبيقه محدود بسبب ردود الفعل السلبية الخطيرة4.

يمكن للطب الصيني التقليدي (TCM) أن يخفف بشكل فعال من الأعراض السريرية لمرضى LUAD ويقلل من ردود الفعل السلبية الناجمة عن العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، وبالتالي أصبح نقطة ساخنة للبحث5،6،7. في الطب الصيني التقليدي ، ينتمي سرطان الرئة إلى فئة "تراكم الرئة" و "الصخري الرئوي". نقص Qi وتفاعل البلغم والركود والسم مهمان في التسبب في سرطان الرئة. لذلك ، فإن التنغيم Qi والقضاء على البلغم وركود الدم هما العلاج السريري الرئيسي8 طرق لسرطان الرئة وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي9. تريكوسانتيس كيريلوي يمثل مكسيم (Gualou) و Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) زوجا شائعا من الأدوية في علاج سرطان الرئة ، وهذا المزيج له آثار إزالة الحرارة وتقليل البلغم10،11،12. ومع ذلك ، لا تزال آلية عملها غير واضحة ، وهناك حاجة إلى إجراء مزيد من البحوث.

علم الأدوية الشبكي هو طريقة شاملة تعتمد على نظرية بيولوجيا الأنظمة وعلم الأدوية متعدد الاتجاهات الذي يهدف إلى الكشف عن علاقات الشبكة المعقدة بين الأدوية والأمراض المتعددة13. تتميز الوصفات الصينية التقليدية بخصائص كونها متعددة المكونات ومتعددة الأهداف ، مما يعني أنها مناسبة جدا لدراسة علم الصيدلة الشبكي14,15. في الآونة الأخيرة ، برز علم الصيدلة الشبكي كنهج قوي في دراسة صيغ الطب الصيني التقليدي وأصبح نقطة ساخنة للبحث16,17.

ومع ذلك ، على حد علمنا ، يتم تقديم جميع الأبحاث حول علم الأدوية الشبكي كنص. سيؤدي تقديم هذه التقنية من خلال الفيديو إلى تقليل عتبة التعلم بشكل كبير وتسهيل الترويج لهذه التكنولوجيا ، وهي إحدى مزايا هذه المقالة. في هذه الدراسة ، أخذنا Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ضد سرطان الرئة الغدي كمثال لتنفيذ التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من الصحة التجريبية.

Protocol

تم تنفيذ جميع إجراءات علم الأدوية الشبكي وفقا للمبادئ التوجيهية لطرق تقييم علم الأدوية الشبكي18. تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للوائح إدارة المختبرات بجامعة بكين للطب الصيني.

1. التنبؤ الدوائي للشبكة

  1. اختيار المكونات النشطة
    1. افتح قاعدة بيانات HERB (http://herb.ac.cn)19 ، واستخدم "Gualou" (الاسم الصيني ل Trichosanthes kirilowii Maxim) و "Zhebeimu" (الاسم الصيني ل Bulbus Fritillariae thunbergii) ككلمات رئيسية للحصول على مكونات الدواءين. قم بتنزيل القائمة وهياكل SMILES المتعارف عليها للمكونات ذات الصلة من الدواءين.
    2. تحديد ما إذا كان المكون الذي تم الحصول عليه هو المكون النشط.
      1. قم بتضمين المكونات النشطة تلك التي لها قيم التوافر البيولوجي عن طريق الفم (OB) والقيم الشبيهة بالأدوية (DL) في قاعدة بيانات مجموعة HERB (أي المكونات التي تحتوي على OB ≥ 30٪ و DL ≥ 0.18)20,21.
      2. إذا لم يكن للمكون قيم OB وDL ، فقم بإدخال المكون في قاعدة بيانات ADME السويسرية (http://www.swissadme.ch/index.php)22 للحصول على معلومات حول كل مكون. قم بتضمين مكونات ذات امتصاص GI "عالي" وقيمتين على الأقل "نعم" DL كمكونات نشطة.
  2. التنبؤ المستهدف للمكونات النشطة
    1. افتح قاعدة بيانات HERB (http://herb.ac.cn). ابحث وانسخ هياكل SMILES الأساسية للمكونات النشطة.
    2. افتح قاعدة بيانات SEA (نهج مجموعة التشابه ، http://sea.bkslab.org)23. الصق هياكل SMILES الأساسية للمكونات النشطة في مربع البحث ، وانقر فوق Try SEA للحصول على مفتاح الهدف واسم الهدف والقيمة P و MaxTC لكل مكون نشط.
    3. انسخ البيانات إلى جدول بيانات ، واستخدم وظيفة التصفية لملف جدول البيانات لتصفية أهداف المكونات النشطة حسب مفتاح الهدف (الإنسان ، P < 0.05 ، و MaxTC > 0.5).
    4. انسخ جميع الأهداف إلى جدول بيانات ، وقم بإزالة التكرارات للحصول على أهداف الدواء.
  3. التنبؤ بأهداف المرض
    1. افتح قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org)24 وقاعدة بيانات الوراثة المندلية في الإنسان عبر الإنترنت (OMIM، https://www.omim.org)25 واستخدم سرطان الرئة الغدي ككلمة رئيسية للحصول على أهداف المرض للسرطان الغدي الرئوي.
    2. قم بتنزيل جداول البيانات الخاصة بأهداف المرض. حذف الأهداف المتكررة للحصول على أهداف LUAD.
  4. بناء شبكة مستهدفة من مكونات الأدوية والأمراض
    1. انسخ الأهداف المتعلقة ب LUAD وأهداف المخدرات في نفس العمود في جدول بيانات جديد. استخدم دالة البيانات - تحديد التكرارات في شريط الأدوات للحصول على أهداف التقاطع للأهداف ذات الصلة ب LUAD والأهداف ذات الصلة بالمكون النشط Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
    2. افتح Cytoscape 3.8.0. انقر فوق ملف في شريط القائمة ، ثم حدد استيراد شبكة > من ملف لاستيراد ملف جدول البيانات. قم بتحسين حجم ولون عقد الشبكة من خلال شريط الأنماط في لوحة التحكم اليسرى.
    3. استخدم الدالة تحليل الشبكة لتحليل طبولوجيا الشبكة . انقر فوق أدوات في شريط القائمة ، ثم حدد تحليل الشبكة. في لوحة الجدول ، انقر فوق الدرجة في شريط العنوان لترتيب المكونات حسب الدرجة بترتيب تنازلي. خذ المكونات والأهداف العشرة الأولى كمكونات نشطة رئيسية وأهداف أساسية.
  5. بناء شبكة PPI وفحص البروتينات الأساسية
    1. افتح قاعدة بيانات STRING (https://cn.string-db.org/)26. الصق قائمة تنسيق النص للأهداف المحتملة ل Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ضد LUAD في مربع الحوار قائمة الأسماء . حدد الإنسان العاقل في الكائنات الحية ، وانقر على أزرار البحث > متابعة .
    2. عندما تكون النتائج متاحة ، انقر فوق الإعدادات ، وحدد ثقة عالية (0.700) في الإعدادات الأساسية > الحد الأدنى المطلوب من نقاط التفاعل. حدد إخفاء العقد غير المتصلة في الشبكة في الإعدادات المتقدمة ، ثم انقر فوق الزر تحديث.
    3. انقر فوق الصادرات في شريط العنوان ، وقم بتنزيل النص الجدولي القصير لعلاقة PPI بتنسيق TSV.
    4. افتح Cytoscape 3.8.0. انقر فوق ملف > استيراد شبكة > من ملف لاستيراد ملف تنسيق TSV للتحليل المرئي.
    5. استخدم وظيفة محلل الشبكة لإجراء التحليل الطوبولوجي. قم بتحسين حجم ولون عقد الشبكة من خلال شريط الأنماط في لوحة التحكم اليسرى.
  6. تحليل التخصيب KEGG
    1. افتح منصة Metascape (https://metascape.org/)27 . الصق قائمة تنسيق النص للأهداف العلاجية المحتملة في مربع الحوار ، ثم انقر فوق الزر إرسال . ضع علامة H. العاقل في كل من الإدخال كأنواع والتحليل كأنواع ، ثم انقر فوق الزر "تحليل مخصص ". حدد التخصيب ، وحدد مسار KEGG فقط ، ثم انقر فوق تحليل الإثراء. بعد وصول شريط التقدم إلى 100٪ ، انقر فوق الزر البرتقالي لصفحة تقرير التحليل للحصول على نتائج الإثراء.
    2. انقر فوق الكل في ملف مضغوط واحد لتنزيل نتيجة الإثراء ، ثم افتح ملف _ FINAL_GO.csv في المجلد Enrichment_GO للحصول على النتيجة.
    3. افتح برنامج R (https://cran.r-project.org/). اكتب install.package (" ggplot2") والمكتبة (ggplot2) في R لتثبيت حزمة ggplot2 R. اضغط مفتاح الإدخال Enter لتشغيل برنامج التصور KEGG.

2. التحقق التجريبي

  1. إعداد المخدرات
    ملاحظة: تم شراء Fritillaria thunbergii Miq و Trichosanthes kirilowii Maxim من مستشفى Dongzhimen التابع لجامعة بكين للطب الصيني.
    1. اخلطي 50 جم من فريتيلاريا ثونبيرجي ميك و 50 جم من تريكوسانثيس كيريلوي مكسيم معا. ينقع الخليط في 1 لتر من الماء المقطر لمدة 20 دقيقة ، ثم يفرز الخليط على حرارة 100 درجة مئوية تحت الضغط العادي لمدة 1 ساعة.
    2. قم بتصفية ديكوتيون للحصول على مرشح بطبقة مزدوجة من الشاش الطبي المعقم ، ثم استخدم ورق ترشيح 80 ميكرومتر لمزيد من تصفية المستخلص. كرر العملية المذكورة أعلاه ثلاث مرات.
    3. امزج المرشح معا للحصول على حوالي 1.2 لتر مغلي. ضع المحلول في قارورة المبخر الدوار. اضبط سرعة الدوران على 50 دورة في الدقيقة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. امزج وكثف decoctions في مستخلص في المبخر الدوار لمدة 6 ساعات لإنتاج سائل لزج.
    4. قم بتشغيل آلية التجفيف بالتجميد بالتفريغ لتبريد درجة الحرارة مسبقا إلى -40 درجة مئوية. ضع المستخلص الذي تم الحصول عليه في صينية المواد ، وضعه في المصيدة الباردة للتجميد.
    5. عندما تصل درجة حرارة المصيدة الباردة إلى -50 درجة مئوية وتم تجميد المادة لمدة 2 ساعة ، انقل المواد المجمدة إلى رف تجفيف يوضع في المصيدة الباردة. قم بتشغيل مضخة التفريغ لبدء عملية التجفيد. أخرج المسحوق المجفف بالتجميد ، وقم بتخزينه في الثلاجة على حرارة -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
  2. زراعة الخلايا
    1. قم بتكوين وسط DMEM الكامل مع 89٪ وسط أساسي DMEM ، و 10٪ مصل بقري جنيني ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين.
    2. بعد إزالة خلايا A549 من النيتروجين السائل ، احتضان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية ، وحركها حتى يذوب الوسط الموجود في القارورة.
    3. أضف حجما رباعيا من وسط DMEM الكامل إلى الخلايا الذائبة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا (4 درجة مئوية ، 679 × جم ، 5 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية.
    4. أعد تعليق الخلايا المترسبة ب 6 مل من الوسط الكامل DMEM ، وقم بوضعها في دورق ثقافة T25 ، واحتضان القارورة في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  3. الكشف عن صلاحية الخلية
    1. هضم خلايا مرحلة النمو اللوغاريتمية A549 مع 1 مل من 0.25٪ تربسين لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية. أضف 1 مل من وسط DMEM الكامل لتحييد التربسين ، ونفخه برفق لتعزيز سفك الخلايا. طرد مركزي الخليط للحصول على بيليه الخلية (4 °C ، 192 × جم ، 5 دقائق). أعد تعليق الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام وسيط DMEM الكامل.
    2. أضف تعليق الخلية إلى مقياس الدم ، وعد باستخدام عداد الخلايا الآلي. تمييعه إلى 5 × 104 خلايا / مل باستخدام وسط DMEM الكامل.
    3. قم بإذابة 1 جم من مستخلص الماء Trichosanthes-Fritillaria thunbergii في 10 مل من محلول PBS ، وقم بتعقيمه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. خفف الخليط إلى 90 ملغم/مل، 80 ملغم/مل، 70 ملغم/مل، 60 ملغم/مل، 50 ملغم/مل، 40 ملغم/مل، 30 ملغم/مل، 20 ملغم/مل، 10 ملغم/مل باستخدام برنامج تلفزيوني.
    4. لوحة الخلايا المخففة على لوحات 96 بئر مع 100 ميكرولتر لكل بئر. بعد التصاق الخلية ، أضف 1 ميكرولتر من مستخلصات مياه Trichosanthes-Fritillaria thunbergii بتركيزات مختلفة لضبط تركيز كل بئر إلى 900 ميكروغرام / مل ، 800 ميكروغرام / مل ، 700 ميكروغرام / مل ، 600 ميكروغرام / مل ، 500 ميكروغرام / مل ، 400 ميكروغرام / مل ، 300 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل ، و 100 ميكروغرام / مل.
    5. تخلص من الوسط الأصلي بعد 24 ساعة من الاستزراع ، وأضف 100 ميكرولتر من الوسط الأساسي DMEM لمزيد من الحضانة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    6. بعد المعالجة المذكورة أعلاه ، أضف 20 ميكرولتر من محلول MTS (جدول المواد) ، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    7. نقل الخليط المحتضن إلى طبق مختلف. قم بقياس الامتصاص (OD) بطول موجي 490 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. احسب صلاحية الخلية باستخدام الصيغة التالية:
      الصلاحية (٪) = 100 × (OD للعينة المعالجة - OD للوسط) / (OD لعينة التحكم - OD للوسط).
      ملاحظة: يتم تعريف الحد الأدنى للتركيز بالقرب من IC50 على أنه جرعة عالية. يتم تعريف التركيز الذي يبدأ عنده تثبيط تكاثر الخلايا على أنه تركيز جرعة منخفضة ، ويتم تعريف القيمة الوسيطة على أنها تركيز جرعة متوسطة للدراسات التجريبية اللاحقة. في هذه الدراسة ، تم استخدام 400 ميكروغرام / مل و 600 ميكروغرام / مل و 800 ميكروغرام / مل كجرعات منخفضة ومتوسطة وعالية.
  4. التدخل الدوائي وجمع العينات
    ملاحظة: تم رسم نمو الخلايا مقابل الوقت لتحديد مرحلة السجل.
    1. تمييع خلايا مرحلة النمو اللوغاريتمية A549 إلى 5 × 105 خلايا / مل. أضف 2 مل من معلق الخلية إلى لوحة 6 آبار ، وتنمو لمدة 12 ساعة.
    2. كرر الخطوة 2.3.3 للحصول على تخفيفات 80 مجم / مل و 60 مجم / مل و 40 مجم / مل من مستخلص ماء Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. أضف 20 ميكرولتر من محلول PBS ، و 20 ميكرولتر من مستخلص ماء Trichosanthes-Fritillaria thunbergii سعة 40 مجم / مل ، و 20 ميكرولتر من مستخلص ماء Trichosanthes-Fritillaria thunbergii سعة 60 مجم / مل ، و 20 ميكرولتر من مستخلص ماء Trichosanthes-Fritillaria thunbergii سعة 80 مجم / مل إلى مجموعة التحكم الفارغة ، ومجموعة التركيز المنخفض ، ومجموعة التركيز المتوسط ، ومجموعة التركيز العالي ، على التوالي. تخلص من المادة الطافية بعد 24 ساعة من التدخل ، ونظف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
      ملاحظة: كانت تركيزات المجموعة الضابطة الفارغة ، ومجموعة التركيز المنخفض ، ومجموعة التركيز المتوسط ، ومجموعة التركيز العالي لمستخلص الماء Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 0 ميكروغرام / مل ، 400 ميكروغرام / مل ، 600 ميكروغرام / مل ، و 800 ميكروغرام / مل ، على التوالي.
    3. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA (يحتوي على 1٪ PMSF ومثبط الفوسفاتيز 1٪) إلى كل بئر ، وقم بتحليل الخلايا لمدة 30 دقيقة. اجمع المحللة للطرد المركزي (4 درجات مئوية ، 6714 × جم ، 10 دقائق) ، واحصل على المادة الطافية.
  5. النشاف الغربي
    1. كشف تركيز البروتين للعينات بطريقة BCA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدم المخزن المؤقت RIPA لضبط تركيز كل عينة لتكون متسقة.
    2. امزج 40 ميكرولتر من عينة البروتين مع 10 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 5x ، واغلي لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي (4 درجات مئوية ، 6714 × جم ، 10 دقائق) الخليط للحصول على المادة الطافية للتجارب اللاحقة.
    3. عزل البروتينات عن طريق هلام الكهربائي باستخدام الكهربائي العمودي 120 فولت.
    4. تحضير "شطيرة" كهربائية (إسفنجة - ورق ترشيح - جل - غشاء PVDF - ورق ترشيح - إسفنجة). انقع جهاز النقل في حمام جليدي ، وانقل البروتين إلى أغشية PVDF عند 70 فولت لمدة 60 دقيقة.
    5. استخدم 100 مل من محلول TBST (0.05٪ [v / v] Tween-20 ، 10 mM Tris ، 150 mM NaCl ، pH 7.5) و 5 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم لتكوين 5٪ حليب. قم بتخفيف الأجسام المضادة AKT و p-AKT مسبقا باستخدام مخفف الجسم المضاد بنسبة 1: 1000.
    6. سد غشاء PVDF في مسحوق الحليب منزوع الدسم 5 ٪ لمدة 1 ساعة مع الهز. بعد الحجب ، تخلص من الحليب المانع ، وأضف الجسم المضاد الأولي المخفف للحضانة الليلية عند 4 درجات مئوية.
    7. بعد إزالة الجسم المضاد الأساسي ، استخدم محلول TBST لغسل غشاء PVDF خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    8. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي مسبقا باستخدام مخفف الجسم المضاد بنسبة 1: 5000. أضف الجسم المضاد الثانوي ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1.5 ساعة. بعد إزالة الجسم المضاد الثانوي ، استخدم محلول TBST لغسل غشاء PVDF خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    9. كشف البروتين باستخدام نظام الكشف عن التلألؤ الكيميائي.

3. الالتحام الجزيئي

  1. افتح قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org)28. اكتب الرموز المستهدفة في مربع البحث ، وانقر على زر البحث . في العنوان الفرعي للهيكل ، انقر فوق تنزيل للحصول على هياكل 3D لأهداف البروتين.
  2. افتح قاعدة بيانات RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. اكتب اسم جزيئات البروتين الكبيرة في مربع البحث. قم بتنزيل هياكل جزيئات البروتين الكبيرة بتنسيق PDB.
  3. قم بتنزيل حزمة تثبيت برنامج UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) و AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). قم بتثبيت وفتح برنامج UCSF Chimera 1.16. انقر فوق ملف > فتح لعرض بروتين المستقبلات.
  4. انقر فوق أدوات > تحرير الهيكل > Dock Prep ، وحدد حذف المذيبات وإضافة الهيدروجين وإضافة الشحنات في النافذة المنبثقة لإزالة الماء وإضافة رسوم الهدرجة وموازنة. انقر فوق كتابة ملف Mol2 لحفظ بروتين المستقبل بتنسيق mol2. نفذ نفس الخطوة على الرباط.
  5. انقر فوق ملف > فتح لعرض الليجند بتنسيق mol2 في برنامج UCSF Chimera 1.16. في أدوات > تحليل السطح/الربط > AutoDock Vina، قم بتعيين شريط المستقبل إلى اسم بروتين المستقبل وشريط Ligand إلى اسم الرباط. أدخل قيمة في المربع خلف المركز والحجم لضبط المساحة المطورة حديثا ، مما يجعل من الممكن تضمين الرباط والمستقبل بالكامل.
  6. انقر فوق "موافق " للفحص الافتراضي للالتحام الجزيئي للحصول على الموقع الأمثل لربط الرباط بالمستقبل. سجل قيمة طاقة الربط في الموضع الأمثل.

4. التحليل الإحصائي

  1. افتح برنامج SPSS 26.0 الإحصائي. انقر فوق ملف > استيراد البيانات لتحميل البيانات.
  2. قدم البيانات التجريبية كمتوسط ± الانحراف المعياري.
  3. قارن بين مجموعات متعددة باستخدام ANOVA.
    ملاحظة: اعتبر P < 0.05 ذا دلالة إحصائية في هذا العمل.

النتائج

وتم تحديد ما مجموعه 31 مكونا نشطا متصلا بالترايكوسانثس-فريتيلاريا ثونبرغي، بما في ذلك 21 مكونا من مكونات الترايكوسانثي و10 مكونات من مكونات ثونبيرجيا فريتيلاريا، فضلا عن 144 هدفا مناظرا. بشكل عام ، تم استخراج 9049 و 67 جينا مرتبطا ب LUAD من قاعدة بيانات GeneCards وقاعدة بيانات OMIM ، على ال?...

Discussion

بشكل عام ، تتضمن دراسة علم الأدوية الشبكي الكاملة تحديد المكونات النشطة من قواعد البيانات ، واكتساب الأهداف المقابلة للمكونات النشطة والأمراض ، وبناء شبكة مستهدفة لمكونات الدواء والمرض ، والتنبؤ بالأهداف والمسارات الأساسية. يتم التنبؤ مبدئيا بالارتباط بين المكونات النشطة والبروتينات ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج التدريب على الابتكار بجامعة بكين للطب الصيني (رقم: 202110026036).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibcoR001100
A549 cell lineProcellCL-0016
AKT antibodyCST4691S
BCA Protein Assay KitSolarbioPC0020
Chemiluminescence detection systemShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Solarbio11995
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit ABclonalRM00021
Fetal bovine serumScienCell0025
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)ABclonalAS014
MTS assay kitPromegaG3580
p-AKT antibodyCST6040S
Penicillin streptomycinGibcoC14-15070-063
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)SolarbioP0100
Phosphatase inhibitorBeyotimeP1081
Phosphate buffered saline (PBS)SolarbioP1020
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010
RIPA lysis solutionSolarbioR0010
Rotary evaporatorShanghai Yarong Biochemical Instrument FactoryRE52CS-1
Vacuum freeze-drying mechanismNingbo Scientz BiotechnologySCIENTZ-10
β-Actin antibodyABclonalAC026

References

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. The Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708 (2022).
  3. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  4. Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
  5. Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
  6. Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690 (2021).
  7. Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
  8. Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
  9. Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20 (2017).
  10. Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
  11. Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
  12. Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
  13. Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252 (2021).
  14. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  15. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925 (2022).
  16. Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783 (2018).
  17. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462 (2021).
  18. World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
  19. Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299 (2022).
  21. Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162 (2020).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717 (2017).
  23. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
  24. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
  27. Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523 (2019).
  28. Pundir, S., et al. UniProt protein knowledgebase. Methods in Molecular Biology. 1558, 41-55 (2017).
  29. Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  30. Welsh, L. C., Welsh, M. VEGFA and tumour angiogenesis. Journal of Internal Medicine. 273 (2), 114-127 (2013).
  31. Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713 (2017).
  32. Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300 (2015).
  33. Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796 (2017).
  34. Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
  35. Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
  36. Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460 (2016).
  37. Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843 (2021).
  38. Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
  39. Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
  40. Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
  41. Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
  42. Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
  43. Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
  44. Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
  45. Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910 (2020).
  46. Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
  47. Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821 (2022).
  48. Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923 (2020).
  49. Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133 (2020).
  50. Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
  51. Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37 (2019).
  52. Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193 Trichosanthes kirilowii PI3K AKT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved