肺腺癌に対する トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギ の作用機序のネットワーク薬理予測と実験的検証

要約

本研究では、肺腺癌の治療における トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギイ のメカニズムを、ネットワーク薬理学と実験的検証に基づいて明らかにしました。この研究はまた、PI3K / AKTシグナル伝達経路が、肺腺癌の治療における トリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギの 作用に重要な役割を果たしていることも示しています。

要約

肺腺癌(LUAD)の治療におけるトリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギイのメカニズムをネットワーク薬理学と実験的検証に基づいて研究することを目的とした。TrichosanthisとFritillaria thunbergiiの有効成分と潜在的な標的は、漢方薬のハイスループット実験およびリファレンスガイド(HERB)データベースと類似性アンサンブルアプローチ(SEA)データベースによって収集され、LUAD関連の標的は、GeneCardsおよびオンラインメンデル遺伝(OMIM)データベースによって照会されました。薬物-成分-疾患-標的ネットワークは、Cytoscapeソフトウェアによって構築されました。タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク、遺伝子オントロジー(GO)機能、および京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)パスウェイエンリッチメント解析を実施し、コアターゲットとキーパスウェイを取得しました。トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギイおよびA549細胞の水性抽出物を、その後の実験的検証に使用した。HERBデータベースと文献検索を通じて、トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギイの31の有効化合物と157の潜在的標的遺伝子がスクリーニングされ、そのうち144は肺腺癌の治療におけるトリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギの調節標的でした。GO機能エンリッチメント分析は、肺腺癌に対するトリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギの作用機序が主にタンパク質リン酸化であることを示した。KEGG経路エンリッチメント解析では、トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギイによる肺腺癌の治療には、主にPI3K/AKTシグナル伝達経路が関与していることが示唆されました。実験的検証は、トリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギの水性抽出物がA549細胞の増殖およびAKTのリン酸化を阻害できることを示した。ネットワーク薬理学と実験的検証を通じて、PI3K / AKTシグナル伝達経路が肺腺癌の治療におけるトリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギの作用に重要な役割を果たすことが確認されました。

概要

肺がんとは、肺気管支粘膜を起源とする悪性腫瘍を指し、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がん、小細胞がんなどが含まれます¹。肺腺癌(LUAD)は最も一般的なタイプの肺癌であり、肺癌症例全体の約40%を占めています²。ほとんどの患者は進行した段階で診断されるか、遠隔転移があるため、手術の機会を失います³。現在の臨床治療では、LUADを治療するための最も一般的な戦略は化学放射線療法の併用ですが、重篤な副作用のためにその適用は制限されています⁴。

伝統的な漢方薬(TCM)は、LUAD患者の臨床症状を効果的に緩和し、放射線療法と化学療法によって引き起こされる副作用を軽減することができるため、研究のホットスポットになっています^5,6,7。伝統的な漢方薬では、肺がんは「肺蓄積」と「肺錐体」のカテゴリーに属します。気の欠乏と痰、うっ滞、毒の相互作用は、肺がんの病因において重要です。したがって、気を緊張させ、痰とうっ血を解消することは、TCM理論⁹による肺がんの主な臨床治療⁸つの方法です。トリコサンテス・キリロウィマキシム(グアロウ)とフリティラリア・トゥンベルギイ・ミク(ジェベイム)は、肺がんの治療における一般的な薬物ペアを表しており、この組み合わせは熱を取り除き、痰を減らす効果があります^10,11,12。しかし、その作用機序は未だ不明であり、さらなる研究が必要です。

ネットワーク薬理学は、システム生物学と多方向薬理学の理論に基づく包括的な手法であり、複数の薬物と疾患の間の複雑なネットワーク関係を明らかにすることを目的としています¹³。伝統的な中国の処方箋は、多成分および多標的であるという特徴があり、ネットワーク薬理学の研究に非常に適しています^14,15。最近、ネットワーク薬理学はTCMフォーミュラの研究における強力なアプローチとして浮上し、研究のホットスポットとなっています^16,17。

しかし、私たちの知る限り、ネットワーク薬理学に関するすべての研究はテキストとして提示されています。この技術をビデオで紹介することで、学習のしきい値が大幅に下がり、この記事の利点の1つであるこの技術の普及促進が容易になります。本研究では、肺腺癌に対する Trichosanthes-Fritillaria thunbergii を例に、ネットワーク薬理学の予測と実験的検証を実施しました。

プロトコル

全てのネットワーク薬理学手順は、ネットワーク薬理学評価方法ガイドライン¹⁸に従って実施した。すべての実験手順は、北京中医薬大学の実験室管理規則に従って実施されました。

1. ネットワーク薬理予測

1. 有効成分の選択
   1. HERBデータベース(http://herb.ac.cn)¹⁹を開き、「グアロウ」( トリコサンテス・キリロウィ ・マキシムの中国名)と「ジェベイム」(フシギドリの中国 名)をキーワードとして、2つの薬の成分を取得します。2つの薬のリストと標準的なSMILES構造をダウンロードしてください。
   2. 取得したコンポーネントがアクティブコンポーネントであるかどうかを判断します。
      1. HERBグループデータベースに経口バイオアベイラビリティ(OB)および薬物様(DL)値を有するもの(すなわち、OB≥30%およびDL≥0.18を有する成分)を活性成分として含める^20,21。
      2. コンポーネントにOB値とDL値がない場合は、コンポーネントをスイスのADMEデータベース(http://www.swissadme.ch/index.php)²²に入力して、各コンポーネントに関する情報を取得します。GI吸収が「高い」成分と少なくとも2つの「はい」のDL値を持つ成分を有効成分として含めます。
2. アクティブコンポーネントのターゲット予測
   1. HERB データベース (http://herb.ac.cn) を開きます。アクティブなコンポーネントの正規の SMILES 構造を検索してコピーします。
   2. SEA(類似アンサンブルアプローチ、http://sea.bkslab.org)データベース²³を開きます。アクティブなコンポーネントの正規の SMILES 構造を検索ボックスに貼り付け、[ SEA を試す ] をクリックして、各アクティブ コンポーネントのターゲット キー、ターゲット名、 P 値、および MaxTC を取得します。
   3. データをスプレッドシートにコピーし、スプレッドシートファイルのフィルタリング機能を使用して、アクティブなコンポーネントのターゲットをターゲットキー(Human、 P < 0.05、MaxTC > 0.5)でフィルタリングします。
   4. すべてのターゲットをスプレッドシートにコピーし、重複を削除してドラッグターゲットを取得します。
3. 疾患標的の予測
   1. GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org)²⁴およびオンラインMendelian Inheritance in Manデータベース(OMIM、https://www.omim.org)²⁵を開き、肺腺癌をキーワードとして 肺腺癌 の疾患標的を取得します。
   2. 疾患ターゲットのスプレッドシートをダウンロードします。繰り返しターゲットを削除して、LUAD ターゲットを取得します。
4. 創薬-成分-疾患-標的ネットワークの構築
   1. LUAD 関連のターゲットと創薬ターゲットを新しいスプレッドシートの同じ列にコピーします。ツールバーの「 データ - 重複の識別」 機能を使用して、LUAD 関連ターゲットと トリコサンテス-フリティラリア・トゥンベルギイ のアクティブコンポーネント関連ターゲットの交差ターゲットを取得します。
   2. サイトスケープ3.8.0を開きます。メニュー バーの [ ファイル ] をクリックし、[ ファイルからネットワーク> インポート] を選択してスプレッドシート ファイルをインポートします。左側のコントロールパネルのスタイルバーを使用して、ネットワークノードのサイズと色を最適化します。
   3. ネットワーク トポロジ解析には、[ ネットワークの解析 ] 関数を使用します。メニュー バーの [ツール ] をクリックし、[ ネットワークの分析] を選択します。 [テーブル ]パネルで、タイトルバーの[度]をクリックして、コンポーネントを 度 数で降順に並べます。上位10のコンポーネントとターゲットを主要なアクティブコンポーネントとコアターゲットとします。
5. PPIネットワークの構築とコアタンパク質のスクリーニング
   1. 文字列データベース (https://cn.string-db.org/)²⁶ を開きます。LUAD に対するトリコサンテス・フリティラリア・トゥンベルギイの潜在的なターゲットのテキスト形式リストを [名前のリスト] ダイアログ ボックスに貼り付けます。生物でホモサピエンスを選択し、[検索]ボタン>[続行]ボタンをクリックします。
   2. 結果が利用可能になったら、設定をクリックし、基本設定>最低限必要なインタラクションスコアで高い信頼度(0.700)にチェックマークを付けます。[詳細設定]で[ネットワーク内の切断されたノードを非表示にする]にチェックマークを付け、[更新]ボタンをクリックします。
   3. タイトル バーの [エクスポート ] をクリックし、PPI リレーションシップの短い表形式テキストを TSV 形式でダウンロードします。
   4. サイトスケープ3.8.0を開きます。[ ファイルから>ネットワークをインポートする ]をクリックして>ビジュアル分析のためにTSV形式のファイルをインポートします。
   5. ネットワーク アナライザ機能を使用して、トポロジ解析を実行します。左側のコントロールパネルのスタイルバーを使用して、ネットワークノードのサイズと色を最適化します。
6. KEGG エンリッチメント分析
   1. メタスケープ(https://metascape.org/)²⁷プラットフォームを開きます。潜在的な治療標的のテキスト形式のリストをダイアログボックスに貼り付け、[送信]ボタンをクリックします。種として入力と種としての分析の両方でH.サピエンスにチェックマークを付け、[カスタム分析]ボタンをクリックします。[エンリッチメント] を選択し、[KEGG パスウェイ] のみにチェックマークを付けて、[エンリッチメント分析] をクリックします。進行状況バーが 100% に達したら、分析レポート ページのオレンジ色のボタンをクリックすると、エンリッチメントの結果が表示されます。
   2. [オールインワン Zip ファイル] をクリックしてエンリッチメント結果をダウンロードし、Enrichment_GO フォルダー内の _ FINAL_GO.csv ファイルを開いて結果を取得します。
   3. R ソフトウェア (https://cran.r-project.org/) を開きます。ggplot2 R パッケージをインストールするために、 R に install.package (" ggplot2") と ライブラリ (ggplot2) を入力します。 実行 キーを押して、KEGG 視覚化プログラムを実行します。

2. 実験的検証

1. 薬の準備
   注: Fritillaria thunbergii Miqと Trichosanthes kirilowii Maximは、北京中医薬大学と提携している東直門病院から購入しました。
   1. 50 gのフリティラリア・ツンベルギ・ミクと50 gのトリコサンテス・キリロウィ・マキシムを混ぜ合わせます。混合物を1Lの蒸留水に20分間浸した後、常圧下で100°Cで1時間デコクトします。
   2. 煎じ薬をろ過して、滅菌医療用ガーゼの二重層でろ液を得、次に80μmのろ紙を使用して抽出物をさらにろ過します。上記の操作を3回繰り返します。
   3. ろ液を混合して、約1.2 Lの煎じ薬を得る。溶液をロータリーエバポレーターのフラスコに入れます。回転速度を37°Cで50rpmに設定します。 煎じ薬をロータリーエバポレーターで6時間混合して抽出物に凝縮し、粘性のある液体を生成します。
   4. 真空凍結乾燥機構をオンにして、温度を-40°Cに予冷します。 得られた抽出物を材料トレイに入れ、それを凍結用のコールドトラップに入れる。
   5. コールドトラップの温度が-50°Cに達し、材料が2時間凍結したら、凍結した材料をコールドトラップに配置された乾燥ラックに移します。真空ポンプをオンにして、凍結乾燥プロセスを開始します。フリーズドライパウダーを取り出し、後で使用するために-20°Cの冷蔵庫に保管します。
2. 細胞培養
   1. 89%のDMEM基本培地、10%のウシ胎児血清、および1%のペニシリン-ストレプトマイシンでDMEM完全培地を構成します。
   2. 液体窒素からA549細胞を除去した後、細胞を37°Cの水浴中でインキュベートし、バイアル内の培地が溶けるまで撹拌する。
   3. 4倍容量のDMEM完全培地を溶融セルに加える。細胞を遠心分離し(4°C、679 x g、5分間)、上清を捨てる。
   4. 沈殿した細胞を6mLのDMEM完全培地で再懸濁し、それらをT25培養フラスコにプレートし、フラスコを37°C、5%_CO2の細胞インキュベーター内でインキュベートする。
3. 細胞生存率の検出
   1. 対数増殖期A549細胞を1 mLの0.25%トリプシンで37°Cで1分間消化します。 1 mLのDMEM完全培地を加えてトリプシンを中和し、穏やかに吹き付けて細胞の脱落を促進します。混合物を遠心分離し、菌体ペレットを得た(4°C、192 x g、5分間)。得られた細胞をDMEM完全培地を用いて再懸濁する。
   2. 細胞懸濁液を血球計算盤に加え、自動セルカウンターを使用してカウントします。DMEM完全培地を使用して5 x 10⁴ 細胞/ mLに希釈します。
   3. トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギイ水抽出物1gをPBS溶液10 mLに溶解し、0.22 μmのフィルターでろ過滅菌します。PBSを使用して、混合物を90 mg / mL、80 mg / ml、70 mg / mL、60 mg / mL、50 mg / mL、40 mg / mL、30 mg / mL、20 mg / mL、および10 mg / mLに希釈します。.
   4. 希釈した細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり100 μLでプレートします。細胞接着後、異なる濃度の トリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギイ 水抽出物を1 μL添加し、各ウェルの濃度を900 μg/mL、800 μg/mL、700 μg/mL、600 μg/mL、500 μg/mL、400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、および100 μg/mLに調整します。
   5. 24時間の培養後に元の培地を廃棄し、100 μLのDMEM塩基性培地を加えて、37°C、5%_CO2で2時間さらにインキュベートします。
   6. 上記の処理後、20 μLのMTS溶液(材料表)を加え、細胞を37°C、5%_CO2でさらに1時間インキュベートします。
   7. インキュベートした混合物を別のプレートに移します。マイクロプレートリーダーを使用して、波長490 nmの吸光度(OD)を測定します。次の式を使用して細胞生存率を計算します。
      生存率(%)= 100 ×(処理されたサンプルのOD-培地のOD)/(対照サンプルのOD-培地のOD)。
      注:IC50に近い最小濃度は、高用量として定義されます。細胞増殖が阻害され始める濃度は低線量濃度として定義され、中間値はその後の実験的研究のための中用量濃度として定義される。この研究では、400 μg / mL、600 μg / mL、および800 μg / mLが低、中、および高用量として使用されました。
4. 薬物介入とサンプル収集
   注:細胞増殖は、対数相を決定するために時間に対してプロットされました。
   1. 対数増殖期A549細胞を5 x 10⁵ 細胞/mLに希釈します。2 mLの細胞懸濁液を6ウェルプレートに加え、12時間増殖させます。
   2. ステップ2.3.3を繰り返して、トリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギイ水抽出物の80 mg / mL、60 mg / mL、および40 mg / mLPBS希釈液を取得します。PBS溶液20 μL、40 mg/mLトリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギ水抽出物20 μL、60 mg/mLトリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギ水抽出物20 μL、および80 mg/mLトリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギイ水抽出物20 μLをブランク対照群、低濃度群、中濃度群、高濃度群に加え、 それぞれ。24時間の介入後に上清を廃棄し、PBSで細胞を3回洗浄します。
      注: トリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギイ 水抽出物のブランクコントロール群、低濃度群、中濃度群、および高濃度群の濃度は、それぞれ0 μg / mL、400 μg / mL、600 μg / mL、および800 μg / mLでした。.
   3. 250 μLのRIPAバッファー(1%PMSFおよび1%ホスファターゼ阻害剤を含む)を各ウェルに加え、細胞を30分間溶解します。遠心分離(4°C、6,714 x g、10分)用のライセートを回収し、上清を得た。
5. ウェスタンブロッティング
   1. 製造元の指示に従ってBCA法によりサンプルのタンパク質濃度を検出します。RIPAバッファーを使用して、各サンプルの濃度が一致するように調整します。
   2. 40 μLのタンパク質サンプルを10 μLの5xローディングバッファーと混合し、100°Cで5分間煮沸します。 この混合物を遠心分離機(4°C、6,714 x g、10分間)し、その後の実験のために上清を得た。
   3. 120 V垂直電気泳動を用いたゲル電気泳動によりタンパク質を単離します。
   4. 電気「サンドイッチ」(スポンジ-ろ紙-ゲル-PVDFメンブレン-ろ紙-スポンジ)を準備します。転写装置を氷浴に浸し、タンパク質をPVDFメンブレンに70 Vで60分間転写します。
   5. 100 mLのTBST溶液(0.05%[v/v] Tween-20、10 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.5)と5 gの脱脂粉乳を使用して、5%ミルクを構成します。AKT抗体とp-AKT抗体を抗体希釈剤で1:1,000の比率で事前に希釈します。
   6. PVDFメンブレンを5%脱脂粉乳で1時間振とうします。ブロッキング後、ブロッキングミルクを捨て、希釈した一次抗体を加えて4°Cで一晩インキュベートします。
   7. 一次抗体を除去した後、TBST溶液を使用してPVDFメンブレンを5回ずつ5分間洗浄します。
   8. 二次抗体を抗体希釈剤で1:5,000の比率で事前に希釈します。二次抗体を添加し、室温(RT)で1.5時間インキュベートします。二次抗体を除去した後、TBST溶液を使用してPVDFメンブレンを5回ずつ5分間洗浄します。
   9. 化学発光検出システムを使用してタンパク質を検出します。

3. 分子ドッキング

1. ユニプロットデータベースを開きます (https://www.uniprot.org)²⁸.検索ボックスにターゲットシンボルを入力し、[検索]ボタンをクリックします。構造小見出しで、タンパク質ターゲットの3D構造のダウンロードをクリックします。
2. RCSB PDB データベース (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)²⁹ を開きます。検索ボックスにタンパク質高分子の名前を入力します。タンパク質高分子構造をPDB形式でダウンロードします。
3. UCSF Chimera 1.16 ソフトウェア(https://vina.scripps.edu/)および AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/) のインストールパッケージをダウンロードします。UCSF Chimera 1.16 ソフトウェアをインストールして開きます。[ファイル] > [開く ] をクリックして、受容体タンパク質を表示します。
4. [ 構造編集>ツール]>[ドックの準備]をクリックし、ポップオーバーの[ 溶剤の削除]、[ 水素の追加]、および [チャージの追加 ]にチェックマークを付けて、水を削除し、水素化とバランスチャージを追加します。 [Mol2ファイルの書き込み ]をクリックして、受容体タンパク質をmol2形式で保存します。リガンドについても同様のステップを実行します。
5. ファイル>開くをクリックして、UCSF Chimera 1.16ソフトウェアでmol2フォーマットのリガンドを表示します。AutoDock Vina>表面/結合解析>ツールで、受容体バーを受容体タンパク質の名前に設定し、リガンドバーをリガンドの名前に設定します。[中心]と[サイズ]の後ろのボックスに値を入力して、新しく開発されたスペースを調整し、リガンドと受容体を完全に包含できるようにします。
6. 分子ドッキング仮想スクリーニングで OK をクリックして、受容体へのリガンド結合に最適な位置を取得します。結合エネルギー値を最適な位置に記録します。

4. 統計分析

1. SPSS 26.0統計ソフトウェアを開きます。データロードのために ファイル>インポートデータ をクリックします。
2. 実験データを平均±標準偏差として提示します。
3. 一元配置分散分析を使用して複数のグループを比較します。
   注: この研究では、P < 0.05が統計的に有意であると考えられました。

結果

21のトリコサンテスと10のフリティラリア・ツンベルギア成分、および144の対応する標的を含む、合計31のトリコサンテス-フリティラリア・ツンベルギア関連の活性成分が同定されました。 全体として、9,049および67のLUAD関連遺伝子がそれぞれGeneCardsデータベースおよびOMIMデータベースから抽出された。重複遺伝子を削除した後、LUADに関連する9,057個の遺伝子が同定され?...

ディスカッション

一般に、完全なネットワーク薬理学研究には、データベースからの活性成分の同定、活性成分および疾患に対応する標的の取得、薬物-成分-疾患-標的ネットワークの構築、およびコア標的および経路の予測が含まれる。活性成分とコアタンパク質の関連(分子ドッキング)をコンピュータ技術で事前に予測し、実験を用いて最終検証を行います。

関連するデータベースの選...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	R001100
A549 cell line	Procell	CL-0016
AKT antibody	CST	4691S
BCA Protein Assay Kit	Solarbio	PC0020
Chemiluminescence detection system	Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory	ChemiScope 6100
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Solarbio	11995
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit	ABclonal	RM00021
Fetal bovine serum	ScienCell	0025
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	ABclonal	AS014
MTS assay kit	Promega	G3580
p-AKT antibody	CST	6040S
Penicillin streptomycin	Gibco	C14-15070-063
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Solarbio	P0100
Phosphatase inhibitor	Beyotime	P1081
Phosphate buffered saline (PBS)	Solarbio	P1020
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010
RIPA lysis solution	Solarbio	R0010
Rotary evaporator	Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory	RE52CS-1
Vacuum freeze-drying mechanism	Ningbo Scientz Biotechnology	SCIENTZ-10
β-Actin antibody	ABclonal	AC026