التحكم الميكانيكي في الاسترخاء باستخدام الترابيق القلبي السليم

Summary

الاسترخاء السريع لعضلة القلب والقلب ضروري لعلم وظائف الأعضاء الطبيعي. من المعروف الآن أن آليات الاسترخاء الميكانيكية تعتمد على معدل الإجهاد. يقدم هذا البروتوكول لمحة عامة عن اكتساب التجارب وتحليلها لمواصلة دراسة التحكم الميكانيكي في الاسترخاء.

Abstract

الخلل الانبساطي هو نمط ظاهري شائع عبر عروض أمراض القلب والأوعية الدموية. بالإضافة إلى تصلب القلب المرتفع (ارتفاع ضغط البطين الأيسر في نهاية الانبساطي) ، يعد ضعف استرخاء القلب مؤشرا تشخيصيا رئيسيا للخلل الانبساطي. في حين أن الاسترخاء يتطلب إزالة الكالسيوم الخلوي وتعطيل الخيوط الرقيقة الساركومية ، فإن استهداف مثل هذه الآليات لم يوفر بعد علاجات فعالة. تم وضع نظرية للآليات الميكانيكية ، مثل ضغط الدم (أي الحمل اللاحق) ، لتعديل الاسترخاء. في الآونة الأخيرة ، أظهرنا أن تعديل معدل الإجهاد للتمدد ، وليس الحمل اللاحق ، كان ضروريا وكافيا لتعديل معدل الاسترخاء اللاحق لأنسجة عضلة القلب. يمكن تقييم اعتماد معدل الإجهاد على الاسترخاء ، والذي يسمى التحكم الميكانيكي في الاسترخاء (MCR) ، باستخدام الترابيق القلبي السليم. يصف هذا البروتوكول إعداد نموذج حيواني صغير ، ونظام تجريبي وغرفة ، وعزل القلب والعزل اللاحق للترابيق ، وإعداد غرفة التجارب ، والبروتوكولات التجريبية والتحليلية. تشير الأدلة على إطالة السلالات في القلب السليم إلى أن MCR قد يوفر ساحات جديدة لتوصيف أفضل للعلاجات الدوائية ، إلى جانب طريقة لتقييم حركية الخيوط العضلية في العضلات السليمة. لذلك ، قد توضح دراسة MCR طريقا إلى مناهج جديدة وحدود جديدة في علاج قصور القلب.

Introduction

يضعف استرخاء القلب في جميع أشكال قصور القلب تقريبا (بما في ذلك قصور القلب مع انخفاض الكسر القذفي) وفي العديد من أمراض القلب والأوعية الدموية. بالإضافة إلى العديد من الطرق لتقييم وظيفة القلب في العضلات المتداخلة ، فإن تقييم عضلات القلب السليمة يكتسب اهتماما. يتم تقييم هذه الأنسجة فارغة (ينتهي خالية من الانقباض) أو محملة (يتم التحكم في الطول أو القوة). تاريخيا ، تم تقييم الخلايا العضلية المعزولة السليمة في حالة تفريغ ، حيث يكون جسم الخلية حرا في التقصير أثناء الانقباض. غالبا ما يتم تقييم الترابيق القلبي السليم في ظروف متساوية القياس ، حيث لا يسمح بتغيير الطول ، ولكن يتم إنشاء الإجهاد (القوة لكل منطقة مقطعية). بدأت كل من طرق الخلايا العضلية والترابيق السليمة تتقارب مع تعديلات الحمل ^1,2.

تم تطوير بروتوكولات لحمل العضلات (أي التحكم في الإجهاد المتطور للعضلة بقيمة محددة تحاكي الأحمال اللاحقة الفسيولوجية) على مدى عدة عقود³،^4،5. في أنسجة القلب السليمة ، تسمح مشابك الحمل للباحثين بمحاكاة الدورة القلبية في الجسم الحي عن كثب باستخدام الأحمال اللاحقة متساوية التوتر أو الشبيهة ب Windkessel⁶،^7،8،9. الهدف من هذا البروتوكول هو الحصول على البيانات المستخدمة لتحديد MCR (أي اعتماد معدل الإجهاد لمعدل الاسترخاء)^8,9.

في حين تم تكييف بروتوكول MCR من العمل السابق ، فإن تركيز هذا البروتوكول (مقارنة بالبروتوكولات المماثلة التي تستخدم أنسجة القلب السليمة) ينصب على الآليات الميكانيكية الحيوية التي تعدل الاسترخاء. هناك العديد من البروتوكولات التي تستخدم تثبيت الحمل³،⁴،⁵،⁷،¹⁰ والبروتوكولات التي تركز على طرازات Windkessel¹،^{2،11 ،} ولكن هذا البروتوكول يصف على وجه التحديد كيف يعدل التمدد قبل الاسترخاء معدل الاسترخاء. لقد أظهرنا أن هذا التحكم يحدث خلال فترة الانبساطي^{الأولي 8} ، وهي مرحلة وصفها في الأصل Wiggers¹². في القلوب السليمة الطبيعية، تخضع عضلة القلب لإجهاد مطول أثناء الطرد قبل إغلاق الصمام الأبهري (أي قبل الانحلال متساوي الحجم)¹³. يتم محاكاة ذلك عن طريق إطالة مدة التحكم في الحمل اللاحق حتى تبدأ العضلات في التمدد. تشير الأدلة السريرية إلى أن هذا الإطالة قد يتم تخفيفه أو فقده في حالات المرض¹⁴ ، ولم يتم توضيح الآثار والآليات المترتبة على معدلات الإجهاد الانقباضي النهائي المتغيرة بشكل كامل. بالنظر إلى خيارات العلاج المتناثرة للأمراض الانبساطية وفشل القلب مع جزء طرد محفوظ ، فإننا نفترض أن MCR قد يوفر نظرة ثاقبة للآليات الجديدة الكامنة وراء ضعف الاسترخاء.

بينما يركز التشريح الإجمالي الموصوف هنا على القوارض ، يمكن إجراء عزل التربيق من أي قلب سليم ، وقد تم استخدامه سابقا مع الترابيق القلبي^{البشري 8}. وبالمثل ، يمكن أيضا تطبيق الحصول على البيانات وتحليلها على خلايا عضلة القلب أو أنواع العضلات المعزولة الأخرى ^1,10. تتضمن المناقشة تعليقا على التعديلات والتعديلات المحتملة على الطريقة ، إلى جانب القيود ، مثل الحذر من استخدام العضلات الحليمية بسبب الخصائص الميكانيكية للوتر⁹.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التالي من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة واين ستيت. يصف البروتوكول هنا خطوات استخدام موضوعات تجارب القوارض ، ولكن يمكن تكييفها للاستخدام في الكائنات النموذجية الأخرى.

1. التحضير

1. الحصول على الموضوع التجريبي والسماح له بالتأقلم مع المختبر.
2. تحضير 250 مل من محلول التروية و 250 مل من محلول تيرود المعدل (الجدول 1) ، عن طريق أكسجة كل منهما إلى 10-20 جزء في المليون من O₂ ، مع الرقم الهيدروجيني 7.3.
3. تحضير حقنة 5 مل مع قنية المرفقة. ملء حقنة مع محلول التروية. استخدم القنية التي تبلغ 23 جراما للفأر ، و 18 أو 16 جراما للفأر الصغير أو الكبير ، على التوالي. حرك أنبوبا من البولي إيثيلين (PE) بطول 1 مم في نهاية إبرة حادة (جدول المواد) ، للمساعدة في منع الشريان الأورطي من الانزلاق من القنية بعد ربطه.
4. التحضير الكامل لمنطقة التشريح والقنية (الشكل 1)
   1. املأ زورقين نظيفين في منتصف الطريق على الأقل بمحلول التروية. اغمر طرف القنية في محلول التروية بخياطة واحدة مزدوجة الحلقة على الأقل موضوعة حول القنية. ثبت المحقنة في مكانها باستخدام مشبك شريط.
   2. ضع مقص جراحي ، ومرقئ ، وملقط قزحية العين ، ومقص صغير منحني ، وملقطين # 3 لسهولة الوصول إليه.
5. تحضير النظام التجريبي (الشكل 2) عن طريق تحضير وتعميم محلول Tyrode المعدل في جميع أنحاء النظام التجريبي. تأكد من أن الغرفة ممتلئة ومستقرة تماما.
6. قم بتشغيل جميع مربعات الحصول على البيانات ، بما في ذلك محول الطاقة ومحرك الطول ونظام السرعة ونظام التحكم في درجة الحرارة وكمبيوتر الحصول على البيانات.
7. انسخ مجلد قالب يحتوي على ملفات *.dap والمؤشر المطلوبة وأعد تسميته للإشارة إلى التجربة الحالية. افتح برنامج الحصول على البيانات.
8. قم بإعداد أدوات عزل الترابيق (مقص Vannas ، # 5 أو # 55 ملقط ، مسبار زجاجي) عن طريق غمر أطرافها في 10٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) في ماء عالي النقاء أو محلول تروية ، لتغليف المعدن بالبروتين (الشكل 2 ب).
   ملاحظة: يجب إعداد النظام التجريبي بأكمله قبل التشريح.

2. التشريح الإجمالي والقنية

1. سجل الهوية ووزن الجسم والمعلومات الأخرى ذات الصلة بموضوع الحيوان.
2. اختياريا ، حقن 1000 وحدة / كجم من الهيبارين في محلول ملحي معقم للقوارض عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل 10 دقائق على الأقل من القتل الرحيم ، لتقليل مخاطر التجلط قبل التروية التاجية.
3. ضع الحيوان في غرفة الحث وحث التخدير العام باستخدام 3٪ -5٪ إيزوفلوران مبخر في أكسجين 100٪ ، وفقا للإجراء القياسي.
   ملاحظة: قم بتشغيل أي كاسحات خارجية أو طاولات سحب لأسفل أو أغطية دخان تستخدم لتقليل التعرض للأيزوفلوران.
4. بمجرد أن يفقد القوارض رد الفعل الصحيح ويتباطأ معدل التنفس:
   1. (بالنسبة للفئران) أخرج الحيوان من غرفة الحث وضعه مستلقا على وسادة تشريح ، مع استمرار التخدير من خلال مخروط الأنف.
   2. (للفأر) أداء خلع عنق الرحم مباشرة بعد إزالة الحيوان من غرفة التعريفي. مخروط الأنف ليست ضرورية. أدر مبخر الأيزوفلوران إلى 0٪.
5. إذا لزم الأمر ، قم بتثبيت الأطراف العلوية للقوارض على وسادة التشريح بعيدا عن جدار الصدر باستخدام شريط مدعوم بدبابيس ، مع الحرص على عدم اختراق الحيوان. تحقق من عمق التخدير المناسب (عدم استجابة قرصة إصبع القدم) قبل الشروع في التشريح.
6. باستخدام المقص الجراحي (Mayo للفئران ، Metzenbaum للفئران) ، أسفل عملية xyphoid مباشرة ، قم بقطع الجلد المستعرض عبر العرض الكامل لبطن القوارض إلى الفضاء البريتوني.
7. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل قطعتين عموديتين شبه سهميتين (أعلى جانبي جدار الصدر) على كلا الجانبين الأيسر والأيمن من جدار الصدر من القطع المستعرض. ثم ، قطع عبر الحجاب الحاجز ، وربط الجروح parasagittal ، وتحرير الفضاء الصدري.
8. قم بتثبيت ورفع عملية xyphoid باستخدام مرقئ نحو رأس القوارض ، لتحريك القص وجدار الصدر لأعلى نحو رأس القوارض ، مما يؤدي إلى كشف الفضاء الصدري والقلب. إذا لزم الأمر ، قم بتمديد الجروح السهمية بسرعة بالقرب من الفضاء الفقري الثاني ، لكشف القلب بالكامل و / أو كسر غشاء التامور.
9. باستخدام ملقط القزحية المنحني ، ارفع القلب بعناية لتصور الأوعية الكبيرة. ضع الملقط بين عضلة القلب والعمود الفقري للقوارض ، وقم بتضييق الخناق على الأوعية الكبيرة ، وارفع القلب ، مع الحرص على عدم تثبيت الأذينين أو أجزاء البطين.
   1. أثناء رفع القلب قليلا ، ضع مقص القزحية المنحني بسرعة (مقعر لأعلى) بين ملقط القزحية المنحني والعمود الفقري للقوارض ، واقطع الأوعية الكبيرة والرئتين بعيدا عن القلب. حرك القلب بسرعة إلى وعاء وزن أو كأس زجاجية تحتوي على محلول نضح جديد، ورجه للمساعدة في إزالة الدم من القلب.
10. أدر مبخر الأيزوفلوران إلى 0٪ ، إن لم يكن قد تم بالفعل. إذا بقيت أجزاء كبيرة من أنسجة الرئة أو التامور أو الأنسجة الأخرى ملتصقة بالقلب ، فقم بقطعها بعناية والتخلص منها في هذا الوقت لتقليل التداخل مع القنية.
11. باستخدام ملقط القزحية المنحني ، حرك القلب إلى وعاء وزن نظيف أو دورق ، مع غمر القنية المعدة. قم بتقليب الشريان الأورطي ، وقم بتأمين الشريان الأورطي عن طريق شد خياطة الحرير الحلقية ، واغسله بما يصل إلى 5 مل من محلول التروية.
12. أخرج القلب من القنية وضعه في طبق وزن مغطى بالمطاط الصناعي السيليكوني للتحضير لعزل التربيق.

3. عزل وتوازن الترابيقولا

1. ضع القلب في طبق مطاط صناعي من السيليكون تحت مجهر مجسم وقم بإلقاء الضوء عليه.
2. حدد موقع مجرى تدفق البطين الأيمن. ثبت الأذين الأيسر وقمة البطين على المطاط الصناعي السيليكوني في الطبق.
3. باستخدام مقص Vannas الطويل ، يتم قطعه من مجرى تدفق البطين الأيمن إلى القمة على طول الحاجز. قطع من مجرى تدفق البطين الأيمن إلى الأذين الأيمن بالقرب من الشريان الأورطي ، ثم قطع من خلال الأذين الأيمن (الشكل 3B).
4. باستخدام الملقط ، اسحب بعناية الجدار الحر للبطين الأيمن (RV) من مجرى التدفق الخارجي ، مع الحرص على عدم تمديد الأنسجة.
   ملاحظة: قد يجد المجربون خيوطا رفيعة بيضاء من النسيج الضام ، والتي يمكن قطعها دون قلق. يجب تقييم الخيوط الكبيرة ذات اللون الوردي (الأنسجة) بعناية ، لأنها قد تكون ترابيق يمكن عزله.
5. ثبت الجدار الحر لمثلث البطين الأيمن على الطبق ، لكشف البطين الأيمن (الشكل 3C).
6. باستخدام ماصة زجاجية تم صهرها وتشكيلها بنهاية رقيقة (قطرها <500 ميكرومتر) ولكن ليس نهاية حادة ، ابحث في الشغاف المكشوف عن الترابيق القائم بذاته (الشكل 3C).
   ملاحظة: الترابيق القائم بذاته هو شريط من العضلات يمكن للمرء أن يسبر تحته بالكامل. استخدم الترابيق الذي له جوانب متوازية (عرض ثابت) ، وتجنب العضلات الحليمية الثلاثية. كن حذرا خلال هذه العملية والتشريح اللاحق ، لأن الضغط على الترابيق يمكن أن يسبب أضرارا ، مما يقلل من القوة المتقدمة.
7. تشريح الترابيق باستخدام مقص Vannas صغير. اترك قطعة مكعبة من الأنسجة ≥1 مم في كل طرف من طرفي الترابيقولا للسماح بالتعلق. لا تمد الترابيق حيثما أمكن ، وقلل من ملامسة الأدوات المعدنية ، لأن كلاهما يمكن أن يتسبب أيضا في تلف العضلات. انقل الدبابيس التي تمسك القلب حسب الحاجة لتقليل الضغط على العضلات بالقرب من التربيق المحدد.
8. قطع ~ 2 بوصة من نهاية ماصة نقل 7 مل ، وسحب الترابيق ببطء في ماصة ، ونقلها إلى طبق وزن جديد يحتوي على 50٪ محلول نضح و 50٪ محلول تيرود معدل. اسمح للعضلة بالتوازن مع الزيادة في الكالسيوم خارج الخلية داخل المحلول المختلط لعدة دقائق.
   1. كرر الخطوات 3.7-3.8 لتشريح الترابيكولا الإضافية في هذا الوقت ، للحصول على ترابيكولا إضافية كنسخة احتياطية.
9. قم بإيقاف تشغيل المضخة التي تزود غرفة التجربة بالتسريب الفائق و / أو الشفط. باستخدام ماصة نقل التجويف الكبيرة ، انقل الترابيق إلى غرفة التجارب المليئة بمحلول Tyrode.
10. قم بتثبيت قطعة مكعبة واحدة من الأنسجة >1 مم في نهاية الترابيقولا بخطاف على محول الطاقة ، ثم قم بتثبيت المكعب الثاني بالمحرك.
    ملاحظة: افصل المحرك ومحول الطاقة عند تركيب الجانب الأول للوصول بشكل أفضل إلى محول الطاقة ، ثم حرك الخطافات بالقرب من بعضها البعض قدر الإمكان عند تركيب المكعب الثاني من الأنسجة بينما تظل الترابيقولا متراخية.
11. أعد تشغيل الدمج الفائق وابدأ في تنظيم العضلات لتحديد عتبة الجهد. السرعة بنسبة 20٪ فوق جهد العتبة لمدة 1 ساعة تقريبا للسماح للترابيكولا بالتوازن.
12. في نهاية فترة التوازن هذه ، قم بتمديد العضلات ببطء باستخدام الميكرومتر المتصل بالمحرك حتى يتم تحقيق توليد الإجهاد الأمثل المتطور ، من خلال مراقبة التوتر المتطور (الحد الأدنى إلى الذروة). توقف عن زيادة طول العضلات عندما يرتفع التوتر الانبساطي السلبي بشكل أسرع من ذروة التوتر ، مما يشير إلى تجاوز الطول الأمثل.
13. قم بإيقاف تشغيل إضاءة المجهر المرسلة ، وقم بإضاءة الترابيق باستخدام مصباح معقوفة بزاوية شديدة الانحدار. باستخدام كاميرا متصلة من خلال بصريات المجهر التي تمت معايرتها مسبقا ، التقط صورة للترابيكولا أثناء الانبساط في المجلد التجريبي. إذا كانت الترابيق أوسع من مجال رؤية الكاميرا ، فالتقط صورا متعددة عبر العضلات.
14. افتح الصورة (الصور) في برنامج تصوير يبلغ عن مسافات البكسل.
    1. قم بقياس مسافة البكسل لقطر العضلة أربع مرات على طولها. قم بقياس طول العضلات (التربيق) بالبكسل، باستثناء المكعب الكبير من الأنسجة.
    2. إذا كان طول العضلة أطول من مجال الرؤية ، فاستخدم النقاط المرجعية على طول العضلة لقياس الطول بالكامل.
15. باستخدام القالب في المجلد التجريبي ، قم بحساب متوسط قياسات القطر ، وقم بتحويل القطر والأطوال من بكسل إلى مم باستخدام معايرة تم الحصول عليها مسبقا. احسب مساحة المقطع العرضي على أنها π * قطرها 2/4 مم² ، وطول العضلات بالميكرومتر.

4. الحصول على البيانات

1. بمجرد توازن العضلات ، افتح برنامج الحصول على البيانات ، وحدد التجارب | التحكم في الطول، وأدخل طول الترابيق المعاير (FL) ومنطقة المقطع العرضي (المساحة [م²]) في مربع المعايرة.
2. من مجلد القالب (الخطوة 1.7) ، تأكد من أن freeform_file.txt يشير إلى المجلد الصحيح ، وافتح الملف freeform.dap في محرر نصوص. اضبط مستوى متساوي التوتر (isoton) على 32000 في ملف *.dap.
3. في المربع التحكم في الطول، حدد علامة التبويب شكل حر واستعرض وصولا إلى ملف قائمة الشكل الحر المناسب. تأكد من أن مسار حفظ البيانات هو أيضا المجلد الصحيح لحفظ البيانات. ابدأ في الحصول على البيانات من تشنجات متساوية القياس بالكامل بالضغط على Run Experiment ، قبل الحصول على بيانات مشبك التحميل باستخدام عنصر تحكم التغذية المرتدة مع معلمات كسب التناسب والتكامل.
4. احصل على بيانات مثبتة بالتحميل عن طريق تحديد التحميل اللاحق (isoton) في ملف * .dap ، وتكرار قيم معلمات الكسب النسبي (propgain) والتكامل (Ki) عن طريق حفظ الملف في محرر النصوص. اضغط على تشغيل التجربة في واجهة برنامج الحصول على البيانات.
   1. تأكد من أن المشبك يتضمن إعادة الإطالة إلى طوله الأصلي (يشار إليه أحيانا باسم تحميل الاسترخاء⁵) أثناء هذا التكرار للوصول إلى النطاق الأقصى لمعدلات الإجهاد ، عن طريق ضبط الوضع (flswitch) من واحد وزيادة عتبة إنهاء مشبك الحمل (flthreshold) من الصفر.
5. تحكم في نهاية مشبك الحمل عن طريق تغيير الوضع (flswitch) من واحد إلى صفر. كرر الاستحواذ أثناء تغيير نهاية مشبك الحمل من صفر إعادة الإطالة لإكمال إعادة الإطالة مرة أخرى إلى طول البداية.
   1. لزيادة الطول ، قم بزيادة عتبة إنهاء مشبك الحمل (flthreshold) بشكل تدريجي من الصفر حتى تطول العضلة تقريبا إلى طولها الأصلي.
6. أعد تعيين الوضع (flswitch = 1) والعتبة (flthreshold = 0) ، وقم بتشغيل عملية اكتساب بيانات نهائية واحدة.
7. إذا رغبت في ذلك ، قم بتعديل الحمل اللاحق في الدراسة بتكرار الخطوات 4.4-4.6. يمكن أن يتم هذا الاستحواذ على الفور.
8. إذا رغبت في ذلك ، قم بتعديل التحميل المسبق عن طريق شد العضلات أو تقصيرها ، أو علاج العضلات عن طريق إضافة مركبات إلى محلول Tyrode. في حالة تغيير التحميل المسبق أو إضافة مركبات ، انتظر ما لا يقل عن 20 دقيقة للتأكد من استقرار استجابة القوة^{البطيئة 9,15} و / أو حتى يخترق المركب العضلات بالكامل.
9. بمجرد اكتمال الحصول على البيانات ، قم بإزالة الترابيق. إذا لزم الأمر ، قم بتجميد أو إصلاح الترابيق للتحليل الكيميائي الحيوي أو النسيجي.
10. قم بتنظيف مناطق العمل والنظام التجريبي ، واغسل جميع الأنابيب بالماء ، وأوقف تشغيل جميع المكونات.

5. تحليل البيانات

1. افتح ملفات البيانات باستخدام برنامج التحليل الكمي عن طريق توجيه البرنامج إلى مسار الملف المناسب.
2. قم بقياس الاسترخاء من خلال التأكد من أن برنامج تحليل البيانات يحلل النبض المثبت ، وأن البرنامج يكتسب بشكل صحيح بداية مشبك الحمل.
   1. تأكد من تحديد نهاية مشبك الحمل ، بحيث يتم تحديد معدل الاسترخاء (1 / τ) من مشتق الذروة السلبي للإجهاد أثناء الاسترخاء متساوي القياس.
   2. استخدم طريقة جلانتز¹⁶ لتحديد ثابت الوقت الأسي هذا ، أو أي تقدير كمي مناسب آخر للاسترخاء (الحد الأدنى من مشتق الإجهاد ، ثابت الوقت اللوجستي 17 ، أو النموذج الحركي¹⁸).
3. التأكد من أن برنامج تحليل البيانات يحسب معدل الانفعال بأخذ المشتق الزمني للإجهاد حيث يتم حساب الانفعال كدالة للوقت مقسوما على الطول عند الانكماش الأمثل.
4. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لجميع آثار حالة معينة.
5. ارسم العلاقة بين معدل الاسترخاء ومعدل الإجهاد ، مما يحد من الحد الأقصى للبيانات إلى معدل إجهاد فسيولوجي أقل من 1 ^s-1. استبعد البيانات بمعدلات إجهاد منخفضة (الشكل 4C) ، لأن مرحلة الاسترخاء قد لا تعكس الاضمحلال الأسي^17,18.
6. احصل على ميل الخط الفاصل بين معدل الانحلال ومعدل الانفعال، وسجل الميل كمؤشر MCR.
7. كرر التحليل أعلاه لكل حالة تم استجوابها.

النتائج

يظهر الشكل 4 مجموعة بيانات تمثيلية ، ويمكن العثور على نتائج إضافية في المنشورات السابقة ^8,9. باختصار ، يتم حساب معدل الإجهاد من مشتق السلالة ، قبل الاسترخاء متساوي القياس مباشرة. الإجهاد هو الطول كدالة للوقت مقسوما على طول العضلة عند الطول الأمثل. يتم حساب معدل الاسترخاء على أنه 1 / τ ، حيث τ هو ثابت الوقت الأسي¹⁶. هناك حاجة إلى معدلات إجهاد متعددة ومعدلات الاسترخاء الناتجة عنها لتحديد التحكم الميكانيكي في الاسترخاء (MCR). يتم رسم هذه البيانات على الرسم البياني لمعدل الاسترخاء مقابل معدل الإجهاد. يوفر ميل الخط مؤشر MCR.

لاحظ أنه من غير المحتمل أن تتجاوز معدلات الإجهاد الانقباضي والانبساطي النهائي 1 ^s-1. لذلك ، يجب أن يتضمن المنحدر فقط معدلات الإجهاد < 1 ^s-1. يمكن إرباك معدل الاسترخاء عند معدلات الإجهاد المنخفضة بسبب التغيرات في الحد الأدنى من مشتق الوقت للإجهاد (dStress / dt_min) ، وفي هذه الحالات ، قد يتم تجاهل البيانات من الامتدادات التي تقل عن 0.15 ^s-1 تقريبا.

الشكل 1: إعداد التشريح الإجمالي ومنطقة قنية القلب. من اليمين إلى اليسار: أ. تقع غرفة تحريض التخدير للحيوان بالقرب من منطقة التشريح. b. غص لزبال الغاز المتطاير الاختياري. ج. وسادة تشريح ، حيث سيتم وضع الحيوان مستلقا ، محاطة (في اتجاه عقارب الساعة) د. مخروط الأنف ، لتوفير التخدير المستمر للقوارض ، ه. مرقئ ، و. مقص جراحي ، ز. مقص ناعم منحني موضوع لسهولة الوصول إليه باليد المهيمنة (القاطعة) ، ح. ملقط قزحية منحني موضوع لسهولة الوصول إليه باليد غير المهيمنة. يمكن لصق الأطراف العلوية للقوارض على وسادة التشريح باستخدام شريط لاصق ، و i. يجب وضع طبق تشريح (أو دورق صغير) مع محلول نضح في مكان قريب لشطف القلب. j. يجب وضع منطقة منظمة للقنية في مكان قريب. يتم تثبيت حقنة مع قنية مناسبة على حامل حلقي. ك. (أقحم) صورة أقرب لقنية 16 G ، مع 1 مم من أنابيب PE205 المرفقة وخياطة معقودة بشكل فضفاض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المنطقة التجريبية والأدوات. أ: المنطقة التجريبية. يتم إعداد الغرفة التجريبية ونظام الحصول على البيانات على مجهر مقلوب قريب (يسار). يحدث عزل الترابيق وتركيبه تحت مجسمة (يمين). (ب) يتم تحضير أطراف ملقطين ومقص فانا كبير وصغير ومسبار زجاجي مخصص عن طريق النقع في محلول BSA بنسبة 10٪. (ج) أدوات تشريح إضافية. يسمح الطبق المطلي بالمطاط الصناعي السيليكوني بتركيب القلب أثناء التشريح الدقيق. تظهر ماصة نقل 7 مل مع قطع النهاية أسفل الطبق ومسبار الزجاج. يتم التخلص من الطرف المقطوع لماصة النقل ، ويتم استخدام تجويف متضخم لنقل العضلات ، مع الحد الأدنى من خطر التمدد أو الجفاف. (د) صورة مكبرة لنهاية ماصة زجاجية، طولها 2 مم تقريبا وقطرها 0.25-0.5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: دليل التشريح . (أ) يجب أن يبدأ التشريح الإجمالي بقطع عرضي (1. أخضر) عبر الجلد إلى التجويف البريتوني أسفل عملية xyphoid (يشار إلى الضلوع السفلية والإكسيفوئيد بخط رمادي رفيع). يجب أن تتبع الجروح شبه السهمية من التجويف البريتوني إلى أعلى القفص الصدري (2. البط البري و 3. الخطوط الزرقاء) ، وبعد ذلك يجب قطع الحجاب الحاجز. يمكن بعد ذلك استخدام مرقئ لتثبيت عملية xyphoid ورفع جدار الصدر نحو الرأس. (ب) قلب فأر سليم مثبت على طبق من مطاط السيليكون ، موجه مع رؤية مجرى تدفق البطين الأيمن (RVOT) ، والأذين الأيمن (RA) ، والشريان الأورطي (Ao) ، والأذين الأيسر (LA). يجب أن تكون المجموعة الأولى من التخفيضات من RVOT إلى القمة على طول الحاجز (1. الخط الأصفر). يجب أن تكون المجموعة الثانية من الجروح من RVOT على طول قاعدة القلب ثم عبر الأذين الأيمن (2. الخط البرتقالي). (ج) يمكن سحب RVOT بعناية بعيدا عن الشريان الأورطي لفتح القلب وتثبيته مرة أخرى. تتوافق الخطوط الصفراء والبرتقالية مع القطع الموضحة في B. غالبا ما توجد الترابيق القائمة بذاتها بالقرب من قاعدة الجدار الحر RV وبالقرب من الحاجز ، ولكن يمكن أن تحدث في أي مكان (تشير الخطوط الحمراء إلى مواقع مشتركة). (د) منظر مكبرة للمسبار الزجاجي تحت الترابيقولا (يشير السهم الأصفر إلى تقاطع التربيق والمسبار). (ه) يتم تثبيت الترابيقولا (السهم الأحمر) على النظام التجريبي بين محول القوة (يسار) والمحرك (يمين الوسط) ، ويحيط به اثنان من خيوط السرعة (أفقي أعلى وأسفل الترابيق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: آثار ونتائج تمثيلية . (أ) ترابيق قلبي واحد مضاء باستخدام ضوء LED معقوفة بزاوية شديدة الانحدار (~ 75 درجة) من محور عدسة المجهر ، مما يعزز تباين التربيق. في هذا المثال، يتم تجانب صورتين لإظهار الطول الكامل للترابيق. (ب) منحنيات وقت الإجهاد (أعلى) وزمن الإجهاد (أسفل) لنفس التربيق. يتم عرض نشل متساوي القياس ، جنبا إلى جنب مع ثلاث تشنجات مشبك الحمل عند زيادة معدلات الإجهاد الانقباضي النهائي. (ج) حساب MCR التمثيلي. يعرف MCR بأنه ميل الخط الفاصل بين معدل الاسترخاء ومعدل الإجهاد. كما لوحظ في المناقشة ، قد يتم تقييد معدلات الإجهاد لتوفير MCR كمي قابل للتكرار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الحلول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

يحدد التحكم الميكانيكي في الاسترخاء (MCR) اعتماد معدل استرخاء عضلة القلب على معدل إجهاد استرخاء العضلات ^8,9. معدل الإجهاد ، بدلا من الحمل اللاحق ، ضروري وكاف لتعديل معدل الاسترخاء⁸. نظرا لأن التدخلات لتعديل معدل الكالسيوم لم يثبت أنها تحسن استرخاء القلب بشكل كبير ، فقد يوفر التدخل الميكانيكي رؤى جديدة للآلية ويوفر علاجا جديدا للخلل الانبساطي.

يستخدم بروتوكول تعديل معدل إجهاد عضلة القلب الموصوف هنا مشبك حمل متساوي التوتر ^8,9. قوة مشبك الحمل متساوي التوتر هي التحكم الكمي في إجهاد الحمل اللاحق. يمكن استخدام البروتوكولات الشبيهة ب Windkessel لمزيد من التحقيق في التغييرات في التحميل اللاحق والتحميل المسبق وعمل القلب^2،6،7. يمكن أيضا استخدام منحدر لا يتم التحكم فيه بواسطة مشبك الحمل لعزل التغير في الإجهاد بشكل أفضل عن معدل الإجهاد. بغض النظر ، لا يبدو أن الحمل اللاحق نفسه هو معدل قوي لمعدل الاسترخاء⁸.

يمكن أيضا تكييف البروتوكول لمقاربة المزيد من الظروف الفسيولوجية لدرجة الحرارة ومعدل السرعة. تم استخدام تفاصيل البروتوكول الحالي لإظهار وجود MCR. يوصى عموما بإجراء تجارب في الظروف الفسيولوجية ، اعتمادا على السؤال التجريبي. ومع ذلك ، فإن التجارب التي يتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية ، أو بمعدلات سرعة عالية ، يمكن أن تحفز بسرعة أكبر المتهدمة (الضرر) للعضلة. قد تكون هناك حاجة إلى حل مع تحسين القدرة على حمل الأكسجين. علاوة على ذلك ، يجب أن يكون الحصول على البيانات قادرا على أخذ عينات من الطول والقوة بسرعة كافية لحل التشنجات السريعة وتوفير التحكم في التغذية الراجعة.

لا يصف البروتوكول الحالي قياس الكالسيوم أو قياس أطوال القطعة العضلية والتحكم فيها. تم تناول قياسات الكالسيوم في بروتوكولات أخرى¹¹ ، بينما يمكن إضافة قياس طول القطعة العضلية باستخدام المعدات المناسبة. لا يتم استخدام التحكم في طول القطعة العضلية في دراسات MCR الحالية ، لأن طول العضلات هو المعلمة الأكثر ارتباطا بالحالة السريرية¹⁹. سيوفر المزيد من التحكم في طول القطعة العضلية (مقابل التحكم في طول العضلات) إجابات محددة على الأسئلة الحركية ، ولكن من غير المرجح أن تضيف إلى المعرفة الانتقالية بسبب الاختلاف بين الساركومير والحد الأدنى من فهم تغيرات طول القطعة العضلية في الجسم الحي.

يتم تسليط الضوء على ثلاثة اعتبارات تجريبية هنا لزيادة قابلية استنساخ البيانات.

أولا ، قد يكون من الصعب العثور على الترابيق القلبي القائم بذاته في بعض الحيوانات (النتائج والاتصالات غير المنشورة). في حين يمكن العثور على عضلات الوخز في معظم الفئران ، فإن معدل النجاح المعقول للحصول على البيانات من الترابيق في الفئران هو واحد من كل ثلاثة. قد يكون نجاح الترابيقولا أعلى مع فئران براون النرويج × لويس F1 ، والتي تم استخدامها أيضا تاريخيا²⁰ وأفادت التقارير أن لديها المزيد من الترابيق (الاتصالات غير المنشورة). بالنسبة للفئران ، من المرجح أن تكون معدلات النجاح أقل ، مع توقع أقل من واحد من كل 10 للفئران من خلفية BL / 6. ومع ذلك ، من المتوقع أن يكون معدل أعلى للفئران من خلفية FVBN (الاتصالات والملاحظات غير المنشورة).

ثانيا ، يمكن أن يؤدي تلف العضلات إلى تقليل الإنتاج. إذا كانت القوى المتقدمة أقل من 10 mN ^mm-2 عند 25 درجة مئوية وسرعة 0.5 هرتز ، فقد يحتاج الباحثون إلى إجراء استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتقييم ما إذا كان هناك تمدد أو اتصال غير مقصود بين الملقط المعدني والعضلات ، أو إذا لم يتم إعداد المحاليل بشكل صحيح ، أو إذا كانت السرعة أو المعدات التجريبية تعمل بشكل صحيح. اقترحت بروتوكولات أخرى تستخدم الترابيق السليم استخدام محاقن Luer-lock كأوعية نقل¹¹. في حين أن هذا ممكن ، خاصة إذا كان المستخدم يتحكم في معدل تدفق بطيء جدا أو جزء عضلي أصغر ، فإن البروتوكول الحالي يستخدم ماصة نقل تجويف أكبر بكثير لتقليل الضرر المحتمل. خطوة أخرى حيث قد يحدث تلف نقص تروية أثناء التشريح. يجب تقليب الشريان الأورطي وشطفه بمحلول التروية في غضون 3 دقائق من أول قطع في البطن (فئران) أو خلع عنق الرحم (فأر) ، على غرار الحدود المدرجة في بروتوكولات عزل عضلة القلب^21،22. هذا يقلل من الوقت الذي لا تتعرض فيه أنسجة القلب لمحلول التروية الشبيه بشلل القلب. علاوة على ذلك ، فإن التشريح الذي يستمر لأكثر من 30 دقيقة بشكل عام لا ينتج عنه تربيق ارتعاش. وبالتالي ، يجب على المشغلين ممارسة تشريح سريع ولكن دقيق لتقليل الضرر. قد تعاني مساحة المقطع العرضي التي تزيد عن 0.2 مم² (2 × ^10-7 م²) من نقص التروية^{الأساسية 20}.

ثالثا ، يجب مراعاة الطريقة التي ترتبط بها العضلات بالمحرك ومحول القوة. يركز هذا البروتوكول حاليا على الخطافات والترابيق القائم بذاته. يمكن أن يتسبب معدل الإجهاد السريع في بعض الأحيان للتمدد قبل الاسترخاء في انزلاق العضلات إذا لم يتم لصقها بشكل صحيح ، وهذا هو السبب في أن البروتوكول الحالي لا يستخدم "سلال" لعقد الترابيق^23,24. يمكن أيضا النظر في طرق التركيب البديلة (المواد اللاصقة ، المشابك ، إلخ^25,26) والتحقق من صحتها. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا الترابيق وليس العضلات الحليمية. تحفز أوتار العضلة الحليمية مرونة متسلسلة يمكن أن تمنع التغييرات في MCR⁹. ومع ذلك ، من غير المرجح أن يؤثر الموضع الدقيق للمرفقات في العضلات على التدابير ، لأن طول الترابيق (وقطره) يختلف اختلافا كبيرا.

من قيود ثقب نهايات العضلات بخطافات أن نقطة التثبيت نفسها يمكن أن تتلف أيضا. قد يؤدي التمزق المحتمل للأنسجة العضلية الملصقة مع تقلصات متكررة (حسب قوتها) إلى تغيير الطول أو مرونة السلسلة. من الصعب السيطرة على معدل التمزق هذا. وبالمثل ، يمكن أن يتفاقم تلف الأنسجة والخطاف أثناء التمدد ، مما قد يتسبب أيضا في حدوث مشاكل. يجب استخدام الفحص البصري ، وقيم القوة المتقدمة المتبقية >80٪ من القوة متساوية القياس المتوازنة ، لتقييم ما إذا كان المستحضر تالفا ويجب استبعاده.

يؤثر قيد أو اعتبار آخر على الأسئلة التجريبية التي يمكن الإجابة عليها من خلال الطريقة. على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك استخدام 2،3-butanedione monoxime (BDM) في محلول التروية. BDM هو الفوسفاتيز ، والذي قد يغير وظيفة العضلات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن فترة التفريغ الطويلة ونقص السرعة تعني أن حالة الفسفرة الكامنة قد تغيرت على الأرجح. وبالتالي ، يجب توخي الحذر في محاولة إجراء تقييم مباشر لانقباض عضلات الحيوان (مقابل الاختلافات بين الأنماط الجينية أو العلاجات) ، حيث من المحتمل أن تكون حالة الانقباض قد تغيرت. ومع ذلك ، يمكن تقييم تأثير الفسفرة دوائيا عن طريق إضافة ناهض أو مضاد للمسار.

باختصار ، يوفر MCR نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم الاسترخاء من خلال حركة العضلات (معدل الإجهاد). قد يساعد MCR في توفير رؤية أفضل لتشخيص ومراقبة الأمراض الانبساطية ، إلى جانب أهداف التدخل الدوائي ، مثل تعديل حركية الميوسين. يحدد البروتوكول والنصائح الموضحة هنا المعرفة التي تم تطويرها على مدى عدة سنوات من التجارب ، ويجب أن تكون قابلة للتطبيق على الأنظمة والنماذج الأخرى لأمراض القلب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 or 16 gauge blunted needle/canula			for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma-Aldrich	B0753-25G
23 gauge blunted needle/canula			for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop
5 mL syringe	BD Luer-Lock	309646
95% Oxygen/5% CO2	AirGas	Z02OX9522000043
Anethesia system	EZ Systems	EZ-SA800	Can use any appropriate anethesia method/system
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP-1600	to coat tips of fine forcepts, scissors
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Chemical	C79-500
Containers/dissection dishes	FisherBrand	08-732-113	Weigh dishes for creating dissection plates
Crile Hemostat	Fine Science Tools	13005-14	for mouse gross dissection
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
Data acquisition software	SLControl
Data acquisition system	MicrostarLabs	DAP5216a	Can use any DAQ.  This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot
Data analysis software	Mathworks	Matlab	Custom Script
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	2x for cannulation of aorta
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11254-20	2x for trabecula isolation
Experimental system	Aurora Scientific	801C	Can use any appropriate experimental chamber with force and length control
Fine Scissors, curved	Fine Science Tools	14061-09	for removal of heart
Gooseneck Piggyback Illuminator	AmScope	LED-6WA
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Imaging software	IrfanView
Iris Forceps	World Precision Instruments	15915	for removal of heart
Isoflurane	VetOne	502017
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670-100G
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Mayo Scissors	Fine Science Tools	14110-15	for rat gross dissection
Metzenbaum Scissors	Fine Science Tools	14116-14	for mouse gross dissection
Microscope connected camera	Flir	BFS-U3-27S5M-C	Includes acquisition software
Microscope/digital imaging system	Olympus	IX-73	Can use any appropriate microscope.  Needed to measure muscle length, cross sectional area
Mounting Pin/Needle	BD PrecisionGlide	305136	For holding heart to dish.  27 G x 1-1/4
Mounting Pin/Needle	Fine Science Tools	26000-40	For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle)
Oxygen (O2)	AirGas	OX USP300
Peristaltic Pump	Rainin	Rabbit	Can be any means to create flow in experimental chamber
pH and Oxygen sensor	Mettler Toledo	SevenGo pH and DO
Potassium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	237205-100G
Potassium Chloride	Fisher Chemical	P217-500
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	795488-500G
Rochester-pean Hemostat	World Precision Instruments	501708	for rat gross dissection
Silk Suture, Size: 4/0	Fine Science Tools	18020-40	cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-1KG
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045-500G
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S7907-100G
Stereomicroscope	AmScope	SM-1TX
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	for opening of the RV
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning	3097358-1004	For creating dissection plates
Syringe Holder	Harbor Frieght	Helping Hands 60501	Can be used as alternate for ring stand
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625-1KG
Transfer Pipette	FisherBrand	13-711-7M	cut ~1" from tip to widen bore
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00	for trabecula isolation