JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء تحليل النقل المحوري بأكمله. على وجه الخصوص ، يتم عرض حساب سرعة النقل ، وليس بما في ذلك الإيقاف المؤقت ، وطريقة التصور باستخدام برنامج الوصول المفتوح "KYMOMAKER".

Abstract

الخلايا العصبية عبارة عن خلايا شديدة الاستقطاب تحتوي بشكل نمطي على العديد من التشعبات ومحور عصبي. يتطلب طول المحور العصبي نقلا ثنائي الاتجاه فعالا بواسطة البروتينات الحركية. أشارت تقارير مختلفة إلى أن العيوب في النقل المحوري مرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية. أيضا ، كانت آلية تنسيق البروتينات الحركية المتعددة موضوعا جذابا. نظرا لأن المحور العصبي يحتوي على أنابيب دقيقة أحادية الاتجاه ، فمن الأسهل تحديد البروتينات الحركية المشاركة في الحركة. لذلك ، فإن فهم الآليات الكامنة وراء نقل البضائع المحورية أمر بالغ الأهمية للكشف عن الآلية الجزيئية للأمراض التنكسية العصبية وتنظيم البروتينات الحركية. هنا ، نقدم العملية الكاملة لتحليل النقل المحوري ، بما في ذلك زراعة الخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر ، وتعداء البلازميدات التي تشفر بروتينات الشحن ، وتحليلات الاتجاه والسرعة دون تأثير التوقف. علاوة على ذلك ، تم تقديم برنامج الوصول المفتوح "KYMOMAKER" ، والذي يتيح إنشاء جهاز التصوير الحربي لتسليط الضوء على آثار النقل وفقا لاتجاهها والسماح بتصور أسهل للنقل المحوري.

Introduction

أفراد عائلة كينيسين والداينين السيتوبلازمي هي بروتينات حركية تتحرك على طول الأنابيب الدقيقة في الخلايا لنقل حمولتها1. تتحرك معظم الحركينات نحو الطرف الزائد ، بينما يتحرك الداينين نحو الطرف الناقص للأنابيب الدقيقة. تم التحقيق على نطاق واسع في وظائف وآليات نقل البضائع في المحور العصبي نظرا لطولها ، تتطلب المحاور نقلا مستقرا لمسافات طويلة للحفاظ على صحة الخلايا العصبية. تم الإبلاغ عن عيوب في نقل الميتوكوندريا والبلعمات الذاتية والحويصلات التي تحتوي على سلائف بروتين β الأميلويد (APP) كأسباب للأمراض التنكسيةالعصبية 2،3. كشفت العديد من التحقيقات في المختبر عن الآليات الكامنة وراء النقل المنسق بواسطة البروتينات الحركية ، وكشفت دراسات مختلفة باستخدام البروتينات الحركية المنقاة والأنابيب الدقيقة عن كيفية تحرك جزيئات المحرك على طول الأنابيب الدقيقة4،5. عادة ما تشارك محركات متعددة في شحنة واحدة6. ومع ذلك ، هناك بعض النماذج لكيفية تحديد المحركات المعاكسة لاتجاه نقل البضائع. أحدهما هو "نموذج الارتباط / الانفصال". في هذا ، ترتبط المحركات أحادية الاتجاه فقط بالبضائع أثناء النقل أحادي الاتجاه. في الثاني ، "نموذج التنسيق" ، يتم توصيل كلا المحركين بنفس الشحنة ، ويتم تنشيط جانب واحد فقط من المحرك. في "نموذج شد الحبل" الثالث ، يحدد توازن القوة بين كينيسين وداينين اتجاه النقل7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، اقترحت العديد من التقارير أن توازن وعدد البروتينات الحركية المنشطة يؤثران على سرعة نقل البضائع في المختبر8،10.

السؤال الذي لم تتم الإجابة عليه هو كيف يتم تنظيم أنشطة كينيسين أو داينين هذه في الخلايا الحية. أظهرت التقارير السابقة أن أستلة الأنابيب الدقيقة في المحاور العصبية تعزز النقل المحوري11،12. أيضا ، تعمل أنواع مختلفة من محولات البضائع والبضائع كمنشطات للمحركات بالطرق المقابلة13،14. يرتبط العديد منها بغشاء حويصلات النقل ، ويتم تنظيم وظائفها بواسطة إشارات مثل تعديلات ما بعد الترجمة15. لذلك ، فإن مراقبة اتجاه النقل وسرعته في الخلايا الحية يوفر نظرة ثاقبة للتنظيم الجزيئي لنقل البضائع في التجارب المختبرية . تسمح مراقبة النقل المحوري بالتمييز بين النقل القائم على كينيسين ودينين. نظرا لأن المحاور تحتوي على أنابيب دقيقة أحادية الاتجاه16 ، يتم نقل البضائع بشكل متقدم (أي سوما إلى محطة محورية) بواسطة كينيسين وإلى الوراء (أي محطة محورية إلى سوما) بواسطة الديناميات.

في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة لمراقبة وتحليل النقل المحوري في الخلايا العصبية الأولية المزروعة. على سبيل المثال ، تم وصف إجراء مراقبة النقل المحوري لبروتينات الغشاء - APP ، والكالسينتينين -1 / α الألكادين (Alcα) ، والكالسينتينين -3 / الألكادين β (Alcβ) - المحويصلات المحتوية على ذلك. من المعروف أن النقل الأمامي للحويصلات المحتوية على APP أسرع بكثير من الحويصلات المحتوية على Alcα ، على الرغم من أن كلاهما يتم نقله بواسطة kinesin-117،18،19. في التقارير السابقة ، تم استخدام عدة طرق لقياس السرعة. الخطوة الأكثر تغيرا هي التعامل مع فترات التوقف أثناء النقل. في الخلايا الحية ، يتم إعاقة النقل أحيانا بسبب العوائق على طول الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، يمكن للمحركات تجاوز منطقة مع أو بدون توقفمؤقت 20. قد يتأثر حساب السرعة على مدى فترة مراقبة أطول بالتوقف المؤقت ، مما قد يؤدي إلى تقدير أبطأ للسرعة. هنا ، يتم وصف طريقة باستخدام الحركة على مدى فترة مجزأة (200 مللي ثانية) لاستبعاد تأثير التوقف المؤقت المادي للمحركات. أخيرا ، تم تقديم برنامج الوصول المفتوح (Windows فقط) يسمى "KYMOMAKER"21. تستخدم أجهزة التصوير على نطاق واسع لتصور النقل الحويصلي وهي مفيدة لتصور اتجاه النقل لكل شحنة دون الحاجة إلى فيلم. يقوم البرنامج بإنشاء أجهزة التصوير الحركي من أفلام الفاصل الزمني من خلال تطبيق خوارزمية مستجمعات المياه أحادية البعد عدة مرات أثناء دوران الصور. يتيح ذلك للكيموغراف الناتج إظهار الهياكل الدقيقة بكفاءة وسهولة. علاوة على ذلك ، يكتشف KYMOMAKER تلقائيا المسارات ويبرزها وفقا لاتجاهها ويتيح إنشاء مخططات سهلة الفهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة الدراسات الحيوانية بجامعة هوكايدو ، وفقا لإرشادات ARRIVE (أبحاث: الإبلاغ عن تجارب In Vivo). تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J (حامل ، 15.5 يوما) في هذه الدراسة.

1. تحضير الخلايا العصبية القشرية الأولية المزروعة للفأر

  1. أضف 0.1 مجم / مل من بولي إل ليسين في 0.1 م تريس (تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان) -حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.5) في غرفة ذات قاع زجاجي من 8 آبار (رقم 1.0) (انظر جدول المواد). احتضان الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
  2. اشطف الغرفة بالماء المعقم ثلاث مرات على الأقل وجففها بالهواء في غطاء مزرعة الأنسجة.
  3. التضحية بالفئران الحامل في عمر 15.5 يوما عن طريق خلع عنق الرحم ، أو باتباع اللوائح المعتمدة مؤسسيا.
  4. اقرص قرن الرحم الذي يحتوي على الأجنة ، وعزل قرون الرحم بالكامل باستخدام المقص ، واغمرها في محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) على الجليد.
  5. في PBS البارد ، اعزل الأجنة باستخدام ملاقط حادة وقم بإزالة جميع الأغشية السلوية من الأجنة.
  6. اغسل الأجنة مرة أخرى باستخدام PBS البارد الطازج.
    ملاحظة: خلال كل خطوة عزل ، اغسل أكبر قدر ممكن من الدم وتأكد من عدم إتلاف الأوعية أو الأجنة.
  7. ضع جنينا على شاش معقم في طبق بتري بارد تحت المجهر الضوئي.
  8. عزل الدماغ. قطع جلد رأس الجنين وجمجمته باستخدام طرف ملاقط حادة منحنية. قم بإزالة الجلد والجمجمة لكشف الجزء العلوي والجوانب من الدماغ.
  9. استخرج الدماغ بالكامل باستخدام الجزء المنحني من الملقط واغمره في طبق بتري يحتوي على محلول ملح متوازن بارد 1x Hanks (HBSS ؛ 10 ملي هيبس [درجة الحموضة 7.6] ، 5.3 ملي كلوريد الكودميوم ، 0.44 ملي هيلو هيلو أمبير2PO4 ، 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 4.2 ملي NaHCO3 ، 0.34 ملي Na2HPO4 ، 39 ملي مولار D-glucose ، و 0.5 ميكروغرام / مل جنتاميسين ؛ انظر جدول المواد).
  10. كرر الخطوات 1.7-1.9 حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من الأدمغة.
    ملاحظة: عادة ، يمكن الحصول على 5 × 106 إلى 2 × 107 خلايا لكل دماغ.
  11. افصل القشرة22 عن الأدمغة باستخدام ملاقط في البرد 1x HBSS وتمزيق السحايا من القشرة.
  12. انقل القشرة إلى طبق بتري جديد يحتوي على 1x HBSS بارد. قطع القشرة إلى نصفين أو إلى أثلاث باستخدام شفرات جراحية.
  13. انقل القشرة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام أطراف مقطوعة بطول 1,000 ميكرولتر وقم بإزالة 1x HBSS الزائد.
  14. أضف 100 وحدة من غراء و 200 ميكروغرام من ديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I) مخفف ب 5 مل من محلول غراء المخفف (5 مجم / مل D-glucose ، 0.2 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار ، و 0.2 مجم / مل L-cysteine في 1x PBS ؛ انظر جدول المواد) لكل جنين ، واحتضانه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اقلب الأنبوب كل 5 دقائق أثناء الحضانة.
    ملاحظة: يوصى بحضانة غراء في محلول مخفف من البابا. احتضن لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم أضف DNase I.
  15. تجاهل الحل. أضف 2 مل من مصل الحصان المعطل بالحرارة بنسبة 20٪ (انظر جدول المواد) في 1x HBSS. احتضن لمدة 1 دقيقة.
  16. تجاهل الحل. اشطف المنديل ب 4 مل من 1x HBSS مرتين.
  17. تجاهل الحل. أضف 0.5 مل لكل جنين من وسط الطلاء (الوسط العصبي القاعدي الذي يحتوي على 2٪ من مكمل B-27 ، و 4 ملي مولار Glutamax ، و 5٪ مصل الحصان المعطل بالحرارة ، و 1x البنسلين - الستربتومايسين ؛ انظر جدول المواد).
    ملاحظة: خلال الخطوات 1.14-1.17 ، ليست هناك حاجة إلى الطرد المركزي حيث تغرق قطع القشرة المقطوعة في قاع الأنبوب بدونها. لا تستخدم شفاطة ولا تمتص القطع.
  18. أعد التعليق برفق شديد باستخدام طرف مقطوع سعة 1,000 ميكرولتر أو ماصة سعة 10 مل من 5 إلى 10 مرات.
  19. أعد التعليق برفق شديد باستخدام طرف 1,000 ميكرولتر 10 مرات.
  20. جهاز طرد مركزي عند 250 × جم في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق.
  21. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها برفق شديد مع 0.5 مل لكل جنين من وسط الطلاء باستخدام طرف 1,000 ميكرولتر 10 مرات.
  22. ضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، ثم قم بترشيح تعليق الخلية عن طريق تدفق الجاذبية. اجمع تعليق الخلية المفلترة في الأنبوب.
  23. عد الخلايا واللوحة في الغرف عند 2 × 104 إلى 5 × 104 خلايا / سم2 ، بحجم مناسب من وسط الطلاء. يظهر مثال على الكثافة في الشكل التكميلي 1.
  24. في اليوم في المختبر (Div.) 2 ، استبدل نصف الوسط بوسط المزرعة (الوسط العصبي القاعدي الذي يحتوي على 2٪ من مكمل B-27 ، و 4 ملي مولار Glutamax ، و 1x البنسلين - الستربتومايسين) وأضف 5 ميكرومتر من 5-fluoro-2-deoxyuridine (انظر جدول المواد).
  25. بعد القسم 4 ، استبدل نصف الوسط بوسط الاستزراع كل 2 أو 3 أيام.

2. نقل البلازميدات إلى الخلايا العصبية المزروعة الأولية باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم

ملاحظة: المجلدات المذكورة مخصصة لبئر 0.8 سم2 في غرفة ذات قاع زجاجي من 8 آبار (انظر جدول المواد).

  1. قم بإعداد 50 ميكرولتر من محلول الحمض النووي / CaCl2 عن طريق خلط 200 نانوغرام إلى 2 ميكروغرام من البلازميد (APP-EGFP في pCAGGS ، أو Alcα-EGFP في pcDNA3.118 ، أو Alcβ-EGFP في pcDNA3.1 ؛ انظر الجدول التكميلي 1) ترميز بروتين مضان ، 6.2 ميكرولتر من 2 M CaCl2 ، والماء المعقم.
  2. Aliquot 50 ميكرولتر من 2x محلول ملحي مخزن ب HEPES (HBS) في أنابيب طرد مركزي جديدة.
  3. أضف 6.2 ميكرولتر من محلول الحمض النووي / كالسيطرالكندي 2 إلى محلول HBS 2x. تخلط بلطف عن طريق سحب العينة 10 مرات.
  4. كرر الخطوة 2.3 حتى يتم نقل كل محلول DNA / CaCl2 .
  5. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. اجمع وسط الاستزراع في الغرفة ذات القاع الزجاجي واستبدله بوسط استزراع طازج بدون مضادات حيوية.
    ملاحظة: احتفظ بالوسط الذي تم جمعه في حاضنة زراعة الخلايا حتى الخطوة 2.10.
  7. أضف 50 ميكرولتر من خليط الحمض النووي / CaCl2 / HBS لكل بئر بالتنقيط إلى الخلايا العصبية. ثقافة لمدة 1 ساعة.
  8. أثناء الحضانة ، قم بإعداد وسط محمض عن طريق وضع طبق بتري يحتوي على DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco) / وسائط Ham's F-12 في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 10٪ عند 37 درجة مئوية.
  9. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة بعد التعدي ، اشطف الخلايا العصبية الأولية باستخدام DMEM / Ham's F-12 (وسط محمض) 3 مرات.
  10. استبدل الوسائط بمزيج من الوسائط نصف المجمعة ونصف الوسائط الثقافية الجديدة. الاستزراع حتى المراقبة بالفحص المجهري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.

3. مراقبة النقل المحوري

  1. احتضان الغرفة المجهزة بالفحص المجهري TIRF (الانعكاس الداخلي الكلي) (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية.
  2. إذا تم تجهيز وحدة التحكم في ثاني أكسيد الكربون2 ، فيمكن استخدام وسط الثقافة كوسيط مراقبة تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. إذا لم يكن مجهزا ، فاستبدل الوسط بوسط مستقر للأس الهيدروجيني ، مثل Leibovitz L-15 (انظر جدول المواد) ، مزود ب 4 ملي مولار Glutamax و 2٪ B-27.
  3. ابحث عن خلية منقولة ، ثم حدد محورا. قم بزيادة زاوية سقوط الليزر حتى ينعكس الليزر بالكامل. بعد ذلك ، قم بتقليل الزاوية حتى يتم تصور جميع الحويصلات الموجودة في المحور العصبي (TIRF الزائف). احصل على صور بوقت تعريض 200 مللي ثانية لمدة 150 إطارا (30 ثانية).
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام إضاءة الكاذب-TIRF لالتقاط جميع الحويصلات المحورية. يمكن استخدام مجاهر أخرى مجهزة بأنظمة التقاط عالية السرعة.
    ملاحظة: سجل اتجاه المحور العصبي في كل مرة في اسم الملف. تم تجنب مساحة الجزء المحوري الأولي أو منطقة المحور العصبي الطرفي من المراقبة.

4. معالجة الصور

  1. افتح الصور المكتسبة باستخدام برنامج MetaMorph (انظر جدول المواد).
  2. افتح شريط الأدوات > قياس > معايرة المسافة. قم بتمكين "التطبيق على جميع الصور المفتوحة" وأدخل المسافة الفعلية للبكسل.
  3. افتح شريط الأدوات > Display > Rotate. قم بتمكين خانة الاختيار الخاصة ب "جميع الطائرات". قم بالتدوير بحيث يكون المحور العصبي أفقيا والاتجاه نحو طرف المحور العصبي إلى اليمين.
  4. افتح شريط الأدوات > المناطق > إنشاء مناطق. اضبط حجم المنطقة للقطع وانقر فوق إنشاء. ضع الإطار الذي يظهر على الصورة على منطقة المحور العصبي للتحليل. احفظ تسلسل الصورة الذي تم إنشاؤه كملف مكدس.
    ملاحظة: حدد المناطق التي لا تحتوي على محاور عصبية أو حطام غير مركز.
  5. افتح شريط الأدوات > Display > Graphics. حدد شريط المعايرة لختم شريط المقياس. حدد Data/Time لإضافة طابع زمني إلى الصور. قم بتمكين "جميع الطائرات". انقل الكائنات إلى المساحة المناسبة وانقر على الطابع.
  6. افتح شريط الأدوات > Stack > Make film. أدخل معدل الإطارات المناسب وحدد AVI. احفظه كملف جديد.

5. رسم التصوير الحربي واكتشاف الآثار باستخدام KYMOMAKER

  1. قم بتنزيل KYMOMAKER (انظر جدول المواد) وافتح "Kymoanalysis.exe" في مجلد KYMOMAKER.
  2. افتح "kymoAnalysis.exe" لإظهار النوافذ الرئيسية (الشكل 1 أ). حدد ملف > تحميل وافتح فيلم AVI الذي تم إنشاؤه. ستظهر نافذة "معاينة" (الشكل 1 ب).
  3. في قسم إنشاء Kymograph علامة التبويب > التشذيب ، أدخل أرقام البكسل للتشذيب. ينعكس التشذيب على الفور في نافذة "معاينة" للسماح بالضبط السهل (الشكل 1C). تأكد من إزالة شريط المقياس والطابع الزمني بالكامل.
  4. انقر فوق الزر "إنشاء " لإنشاء الرسم الاحترافي (الشكل 1 ج). يكتشف KYMOMAKER ألمع بكسل داخل كل محور y في نافذة "معاينة". احفظ الكيموغراف عبر ملف > حفظ > التصوير الذهني العادي.
  5. للكشف عن الآثار منخفضة الكثافة في الكيموغراف ، انقر فوق التصوير الدوراني. اضبط الرقم في قسم "التصوير الدوراني" واعرض النتيجة بالنقر فوق مخطط الكيموغراف الدوراني (الشكل 1 د).
    ملاحظة: "الدوران (الدرجة)" هو الفاصل الزمني للدرجة لخوارزمية مستجمعات المياه الدورانية21. على سبيل المثال ، تعني 10 درجات أن خوارزمية مستجمعات المياه يتم تنفيذها كل 10 درجات 36 مرة ، ثم يتم دمج النتائج في نافذة "مستجمعات المياه الدورانية".
  6. للكشف عن التتبعات الأمامية والرجعية في مخطط الحراب، في علامة التبويب الكشف > قسم الهدف ، حدد الأصلي إذا لم يتم إنشاء التصوير الدوراني. تأكد من أنه من خلال تحديد الدوران ، يتم استخدام مستجمعات المياه الدورانية التي تم إنشاؤها للكشف عن الآثار. حدد مستجمعات المياه في "طريقة الكشف". انقر فوق الزر "اكتشاف " لاكتشاف الآثار تلقائيا.
    ملاحظة: يتم رسم الآثار المكتشفة في نافذة "العمل". يؤدي تشغيل "التقنيع" إلى رسم آثار على الكيموغراف الأصلي.
  7. اكتشف الآثار الأمامية والرجعية عن طريق إدخال رقم في قسم سرعة > > الكشف (الشكل 1E ، F). اكتشف آثار التصلب الأمامي عن طريق إدخال 0.4 إلى 7.0 ميكرومتر / ثانية. كشف الآثار الارتجاعية عن طريق إدخال -0.4 إلى -7.0 ميكرومتر / ثانية.
    ملاحظة: يعتمد إعداد السرعة المنخفضة على تعريف حالة الحويصلات غير المتحركة انظر الخطوة 6.7.
  8. احفظ الملفات.

6. تحديد السرعة

  1. افتح برنامج MetaMorph.
    ملاحظة: يمكن للمكون الإضافي "التتبع اليدوي" في ImageJ أيضا حساب السرعات بنفس الطرق.
  2. افتح الملف الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.4. تأكد من تكييف المعايرة مع الصور.
  3. افتح شريط الأدوات > التطبيقات > نقاط التتبع. انقر فوق إضافة مسار. ابحث عن حويصلة متحركة تم نقلها بشكل أمامي أو رجعي. ثم تتبع الحويصلة بالنقر حتى ينتهي النقل. انقر فوق تم.
  4. كرر الخطوة 6.3 حتى يتم تتبع جميع الحويصلات.
  5. انقر فوق فتح السجل لفتح ملف CSV. ثم انقر فوق ملف السجل لإظهار البيانات في ملف CSV.
  6. احفظ ملف CSV.
  7. لحساب السرعة المجزأة التي لا تتأثر بالتوقف المؤقت ، قم بإزالة السرعات المحسوبة 0.37 ميكرومتر / ثانية أو أقل في عمود "السرعة".
    ملاحظة: يمكن أن تتحرك الحويصلات قريبا جدا عن طريق الانتشار الشاذ ، ولا تتم معالجتها بواسطة البروتينات الحركية23. لتجنب تضمين هذه الحركات من حساب السرعات التي يحركها المحرك ، تتم إزالة أقل سرعة (1 بكسل / 200 مللي ثانية) في هذا البروتوكول من الحساب.
  8. احسب متوسط السرعة المجزأ كل خمسة إطارات (إجمالي 1 ثانية). تجاهل الجزء الأخير من السرعة إذا بقي أقل من خمسة إطارات.
  9. اجمع بين جميع متوسط السرعات من حالة واحدة. قم بإنشاء الرسوم البيانية للمساعدة في تصور توزيع السرعات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تمت زراعة الخلايا العصبية الأولية المزروعة من قشرة الفأر E15.5 في طبق زجاجي القاع كما هو موضح. على سبيل المثال ، تم التعبير عن APP-EGFP أو Alcα-EGFP أو Alcβ-EGFP في الخلايا العصبية القشرية الأولية. من المعروف أن APP و Alcα يتم نقلهما في المحور العصبي بواسطة kinesin-12،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يتم وصف طريقة تحليل للنقل المحوري ، والتي تتضمن حساب السرعة المجزأة وتوليد التصوير الحركي. تتمثل الخطوة الحاسمة خلال خطوة التعدي في الحفاظ على صحة الخلايا العصبية المستنبتة. اتبعت طريقة التعدي التي وصفها جيانغ وتشن29 بتعديلات طفيفة. أدى الخلط اللطيف لمحلول ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل KAKENHI (22K15270 ، منحة في المساعدة للعلماء الشباب) ومؤسسة أكياما لعلوم الحياة ل YS. نود أن نعرب عن امتناننا للدكتور ماساتاكا كينجو والدكتور أكيرا كيتامورا ، مختبر ديناميكيات الخلايا الجزيئية ، كلية علوم الحياة المتقدمة ، جامعة هوكايدو على تقديم المدخلات والخبرات الهامة التي ساعدت البحث بشكل كبير. تم إجراء الملاحظة باستخدام الفحص المجهري TIRF باستخدام الأداة المثبتة في مختبر ديناميكيات الخلايا الجزيئية ، كلية علوم الحياة المتقدمة ، جامعة هوكايدو. الأداة مسجلة في نظام المرافق المفتوحة الذي يديره مركز المرافق العالمي ، مؤسسة البحوث الإبداعية ، جامعة هوكايدو (AP-100138). نشكر الدكتور Seiichi Uchida ، مختبر الواجهة البشرية ، قسم تكنولوجيا المعلومات المتقدمة ، كلية علوم المعلومات والهندسة الكهربائية ، جامعة كيوشو ، فوكوكا اليابان ، على التجميع مع تطبيق Kymomaker. مختبر الوقاية والبحث المتقدم للخرف ، كلية الدراسات العليا للعلوم الصيدلانية ، جامعة هوكايدو مدعوم من قبل شركة Japan Medical Leaf co.، Ltd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-Fluoro-2-deoxyuridineSigma-AldrichF0503
Apo TIRF 100x/1.49 OILNikon
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo fischer scientific17504044
Bovine serum albuminWako013-25773
CalPhos Mammalian Transfection KitTakara631312
Cell strainer  40 µm NylonFalcon352340
CoolSNAP HQPhotometrics
Deoxyribonuclease ISigma-AldrichDN-25
D-GlucoseWako041-00595
DMEM/Ham’s F-12Wako042-30555
Dumont No. 7 forcepsDumont No.7
Feather surgical blade FeatherNo.11
Feather surgical blade handle FeatherNo. 3
GentamicinWako079-02973
Gentamicin SulfateWako075-04913
GlutaMAX SupplementThermo fischer scientific35050061
HEPESDOJINDO342-01375
Horse Serum, heat inactivatedThermo fischer scientific26050088
KClWako163-03545
KH2PO4Wako169-04245
KYMOMAKERhttp://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL5520
MetaMorph version 6.2r1 Metamorph
Na2HPO4Wako197-02865
NaClWako197-01667
NaHCO3Wako191-01305
Neurobasal MediumThermo fischer scientific21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-ENikon
Nunc Lab-Tek  8 well Chambered CoverglassThermo fischer scientific155411
PapainWorthingtonLS003126
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-AldrichP2636-500MG
Trizma baseMerckT1194-10PAKsolved with water to make 0.1 M Tris-HCl (pH.8.5)

References

  1. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 682-696 (2009).
  2. Stokin, G. B., et al. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's diseases. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
  3. Guo, W., Stoklund Dittlau, K., vanden Bosch, L. Axonal transport defects and neurodegeneration: Molecular mechanisms and therapeutic implications. Seminars in Cell & Developmental Biology. 99, 133-150 (2020).
  4. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  5. Carter, N. J., Cross, R. A. Mechanics of the kinesin step. Nature. 435 (7040), 308-312 (2005).
  6. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Current Biology. 14 (13), R525-R537 (2004).
  7. Hendricks, A. G., et al. Motor coordination via a tug-of-war mechanism drives bidirectional vesicle transport. Current Biology. 20 (8), 697-702 (2010).
  8. Rezaul, K., et al. Engineered tug-of-war between kinesin and dynein controls direction of microtubule based transport in vivo. Traffic. 17 (5), 475-486 (2016).
  9. Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Biophysical challenges to axonal transport: motor-cargo deficiencies and neurodegeneration. Annual Review of Biophysics. 43, 141-169 (2014).
  10. Monzon, G. A., et al. Stable tug-of-war between kinesin-1 and cytoplasmic dynein upon different ATP and roadblock concentrations. Journal of Cell Science. 133 (22), 226248(2020).
  11. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861(2017).
  12. Tosolini, A. P., et al. BDNF-dependent modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 121(2022).
  13. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 765-777 (2009).
  14. Fu, M. M., Holzbaur, E. L. F. Integrated regulation of motor-driven organelle transport by scaffolding proteins. Trends in Cell Biology. 24 (10), 564-574 (2014).
  15. Kumari, D., Ray, K. Phosphoregulation of kinesins involved in long-range intracellular transport. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 873164(2022).
  16. Wai Yau, K., et al. Cellular/molecular dendrites in vitro and in vivo contain microtubules of opposite polarity and axon formation correlates with uniform plus-end-out microtubule orientation. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1071-1085 (2016).
  17. Araki, Y., et al. The novel cargo Alcadein induces vesicle association of kinesin-1 motor components and activates axonal transport. The EMBO Journal. 26 (6), 1475-1486 (2007).
  18. Sobu, Y., et al. Phosphorylation of multiple sites within an acidic region of Alcadein α is required for kinesin-1 association and Golgi exit of Alcadein α cargo. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3844-3856 (2017).
  19. Tsukamoto, M., et al. The cytoplasmic region of the amyloid β-protein precursor (APP) is necessary and sufficient for the enhanced fast velocity of APP transport by kinesin-1. FEBS Letters. 592 (16), 2716-2724 (2018).
  20. Ferro, L. S., Can, S., Turner, M. A., Elshenawy, M. M., Yildiz, A. Kinesin and dynein use distinct mechanisms to bypass obstacles. eLife. 8, e48629(2019).
  21. Chiba, K., Shimada, Y., Kinjo, M., Suzuki, T., Uchida, S. Simple and direct assembly of kymographs from movies using KYMOMAKER. Traffic. 15 (1), 1-11 (2014).
  22. Xu, S. -Y., Wu, Y. -M., Ji, Z., Gao, X. -Y., Pan, S. -Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 803930(2012).
  23. Han, D., et al. Deciphering anomalous heterogeneous intracellular transport with neural networks. eLife. 9, e52224(2020).
  24. Araki, Y., et al. Novel cadherin-related membrane proteins, Alcadeins, enhance the X11-like protein-mediated stabilization of amyloid beta-protein precursor metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 278 (49), 49448-49458 (2003).
  25. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nature Protocols. 1 (2), 695-700 (2006).
  26. Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the toolkit for in vivo imaging of axonal transport. Journal of Visualized Experiments. (178), e63471(2021).
  27. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  28. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  29. Basu, H., Ding, L., Pekkurnaz, G., Cronin, M., Kymolyzer Schwarz, T. L. a semi-autonomous kymography tool to analyze intracellular motility. Current Protocols in Cell Biology. 87 (1), 107(2020).
  30. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319 (5866), 1086-1089 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

KYMOMAKER

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved