Misurazione del trasporto di merci assonale nei neuroni corticali primari di topo

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'intera procedura di analisi per il trasporto assonale. In particolare, qui vengono mostrati il calcolo della velocità di trasporto, esclusa la pausa, e il metodo di visualizzazione utilizzando il software ad accesso aperto "KYMOMAKER".

Abstract

Le cellule neuronali sono cellule altamente polarizzate che ospitano stereotipicamente diversi dendriti e un assone. La lunghezza di un assone richiede un efficiente trasporto bidirezionale da parte delle proteine motorie. Vari studi hanno suggerito che i difetti nel trasporto assonale sono associati a malattie neurodegenerative. Inoltre, il meccanismo di coordinazione di più proteine motrici è stato un argomento interessante. Poiché l'assone ha microtubuli unidirezionali, è più facile determinare quali proteine motorie sono coinvolte nel movimento. Pertanto, la comprensione dei meccanismi alla base del trasporto del carico assonale è fondamentale per scoprire il meccanismo molecolare delle malattie neurodegenerative e la regolazione delle proteine motorie. Qui, introduciamo l'intero processo dell'analisi del trasporto assonale, compresa la coltura di neuroni corticali primari di topo, la trasfezione di plasmidi che codificano proteine cargo e le analisi direzionali e di velocità senza l'effetto di pause. Inoltre, viene introdotto il software ad accesso aperto "KYMOMAKER", che consente la generazione di un chimografo per evidenziare le tracce di trasporto in base alla loro direzione e consentire una più facile visualizzazione del trasporto assonale.

Introduzione

I membri della famiglia delle chinesine e la dineina citoplasmatica sono proteine motrici che si muovono lungo i microtubuli nelle cellule per trasportare il loro carico¹. La maggior parte delle chinesine si muove verso l'estremità positiva, mentre la dineina si muove verso l'estremità negativa di un microtubulo. Le funzioni e i meccanismi del trasporto di merci nell'assone neuronale sono stati ampiamente studiati. A causa della loro lunghezza, gli assoni richiedono un trasporto stabile a lunga distanza per mantenere la salute dei neuroni. Difetti nel trasporto di mitocondri, autofagosomi e vescicole contenenti precursori della proteina amiloide-β (APP) sono stati riportati come cause di malattie neurodegenerative ^2,3. Numerose indagini in vitro hanno rivelato i meccanismi alla base del trasporto coordinato da parte delle proteine motorie, e vari studi che utilizzano proteine motorie purificate e microtubuli hanno scoperto come le molecole motorie si muovono lungo i microtubuli ^4,5. In genere, più motori sono coinvolti in un singolo carico⁶. Tuttavia, ci sono alcuni modelli di come i motori opposti determinano la direzione del trasporto merci. Uno è il "modello di associazione/dissociazione"; In questo, solo i motori unidirezionali sono associati al carico durante il trasporto unidirezionale. Nel secondo, il "modello di coordinamento", entrambi i motori sono collegati allo stesso carico e solo un lato del motore è attivato. Nel terzo "modello del tiro alla fune", l'equilibrio delle forze tra chinesine e dineine determina la direzione di trasporto ^7,8,9. Inoltre, diversi studi hanno suggerito che l'equilibrio e il numero di proteine motorie attivate influenzano la velocità di trasporto delle merci in vitro ^8,10.

Una domanda senza risposta è come queste attività delle chinesine o delle dineine siano regolate nelle cellule viventi. Precedenti studi hanno mostrato l'acetilazione dei microtubuli negli assoni e fattori neurotrofici migliorano il trasporto assonale^11,12. Inoltre, vari tipi di carico e adattatori di carico funzionano come attivatori del motore nei modi corrispondenti ^13,14. Molti sono associati alla membrana delle vescicole di trasporto e le loro funzioni sono regolate da segnali come le modifiche post-traduzionali¹⁵. Pertanto, l'osservazione della direzione e della velocità di trasporto nelle cellule viventi offre preziose informazioni sulla regolazione molecolare del trasporto di merci in esperimenti in vitro. L'osservazione del trasporto assonale consente di distinguere tra trasporto a base di chinesina e dineina. Poiché gli assoni ospitano microtubuli unidirezionali¹⁶, il carico viene trasportato anterogradamente (cioè da soma a terminale di assone) dalle chinesine e retrogradamente (da terminale di assoni a soma) da dineine.

Nel presente studio, viene descritto un metodo per osservare e analizzare il trasporto assonale nei neuroni primari in coltura. Ad esempio, viene descritta la procedura per osservare il trasporto assonale delle vescicole contenenti proteine di membrana (APP), calsyntenin-1/alcadeina α (Alcα) e calsyntenin-3/alcadeina β (Alcβ). È noto che il trasporto anterogrado delle vescicole contenenti APP è considerevolmente più veloce di quello delle vescicole contenenti Alcα, sebbene entrambe siano trasportate dalla chinesina-1 17,18,19. Nei rapporti precedenti, sono stati utilizzati diversi metodi per misurare la velocità. Il passaggio più variabile è la gestione delle pause durante il trasporto. Nelle cellule vive, il trasporto è talvolta ostacolato da ostacoli lungo i microtubuli; Tuttavia, i motori possono bypassare una regione con o senza una pausa²⁰. Il calcolo della velocità su un tempo di osservazione più lungo può essere influenzato dalla pausa, il che può comportare una stima della velocità più lenta. Qui, viene descritto un metodo che utilizza il movimento su un periodo segmentato (200 ms) per escludere l'effetto della pausa fisica dei motori. Infine, viene introdotto un programma software ad accesso aperto (solo Windows) chiamato "KYMOMAKER"²¹. I chimografi sono ampiamente utilizzati per visualizzare il trasporto vescicolare e sono utili per visualizzare la direzione di trasporto di ogni carico senza richiedere un filmato. Il software genera chimografi da filmati time-lapse applicando un algoritmo Watershed unidimensionale più volte durante la rotazione delle immagini. Ciò consente al chimografo risultante di mostrare strutture fini in modo efficiente e semplice. Inoltre, KYMOMAKER rileva ed evidenzia automaticamente i sentieri in base alla loro direzione e consente la creazione di diagrammi di facile comprensione.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per gli Studi Animali dell'Università di Hokkaido, seguendo le linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J (incinta, 15,5 giorni).

1. Preparazione di neuroni corticali primari di topo in coltura

1. Aggiungere 0,1 mg/mL di poli-L-lisina in 0,1 M Tris (tris(idrossimetil)amminometano)-HCl (pH 8,5) in una camera con fondo di vetro a 8 pozzetti (n. 1,0) (vedere la Tabella dei materiali). Incubare la camera in un'incubatrice a 37 °C per almeno 1 ora.
2. Sciacquare la camera con acqua sterilizzata almeno tre volte e asciugarla all'aria in una cappa di coltura tissutale.
3. Sacrificare le tope gravide a 15,5 giorni per lussazione cervicale o seguendo le normative approvate istituzionalmente.
4. Pizzicare il corno uterino contenente gli embrioni, isolare le intere corna uterine usando le forbici e immergerle in soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) su ghiaccio.
5. Nella PBS a freddo, isolare gli embrioni utilizzando una pinzetta affilata e rimuovere tutte le membrane amniotiche dagli embrioni.
6. Lavare nuovamente gli embrioni con PBS freddo fresco.
   NOTA: Durante ogni fase di isolamento, lavare via quanto più sangue possibile e assicurarsi di non danneggiare i vasi o gli embrioni.
7. Posizionare un embrione su una garza sterilizzata in una capsula di Petri fredda al microscopio ottico.
8. Isolare il cervello. Taglia la testa, la pelle e il cranio dell'embrione usando la punta di una pinzetta ricurva e affilata. Rimuovere la pelle e il cranio per esporre la parte superiore e i lati del cervello.
9. Estrarre l'intero cervello usando la parte curva della pinzetta e immergerlo in una capsula di Petri contenente 1x soluzione salina bilanciata di Hanks ghiacciata (HBSS; 10 mM HEPES [pH 7,6], 5,3 mM KCl, 0,44 mM KH₂PO₄, 140 mM NaCl, 4,2 mM NaHCO₃, 0,34 mM Na₂HPO₄, 39 mM D-glucosio, e 0,5 μg/mL di gentamicina; vedi Tabella dei materiali).
10. Ripetere i passaggi 1.7-1.9 fino a ottenere il numero richiesto di cervelli.
    NOTA: In genere, si possono ottenere da 5 x 10⁶ a 2 x 10⁷ cellule per cervello.
11. Separare la corteccia²² dal cervello usando una pinzetta in 1x HBSS freddo e strappare le meningi dalla corteccia.
12. Trasferisci la corteccia in una nuova capsula di Petri contenente 1x HBSS freddo. Tagliare la corteccia a metà o in terzi usando lame chirurgiche.
13. Trasferire la corteccia in una provetta da centrifuga da 15 ml utilizzando puntali da 1.000 μl tagliati con punta e rimuovere l'eccesso di 1x HBSS.
14. Aggiungere 100 unità di papaina e 200 μg di desossiribonucleasi I (DNasi I) diluite con 5 mL di soluzione diluita di papaina (5 mg/mL di D-glucosio, 0,2 mg/mL di albumina sierica bovina e 0,2 mg/mL di L-cisteina in 1x PBS; vedere la Tabella dei materiali) per embrione e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti. Capovolgere la provetta ogni 5 minuti durante l'incubazione.
    NOTA: Si consiglia la preincubazione della papaina in una soluzione diluita di papaina. Incubare per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C, quindi aggiungere DNasi I.
15. Scartare la soluzione. Aggiungere 2 mL di siero di cavallo inattivato termicamente al 20% (vedere la Tabella dei materiali) in 1x HBSS. Incubare per 1 minuto.
16. Scartare la soluzione. Sciacquare due volte il fazzoletto con 4 ml di 1x HBSS.
17. Scartare la soluzione. Aggiungere 0,5 ml per embrione di terreno di placcatura (terreno neurobasale contenente il 2% di integratore di B-27, 4 mM di Glutamax, il 5% di siero di cavallo inattivato termicamente e 1x penicillina-streptomicina; vedere la Tabella dei materiali).
    NOTA: Durante i passaggi 1.14-1.17, non è necessaria alcuna centrifugazione poiché i pezzi di corteccia tagliati affondano sul fondo della provetta senza di essa. Non utilizzare un aspiratore e non aspirare i pezzi.
18. Risospendere molto delicatamente con un puntale tagliato da 1.000 μl o una pipetta da 10 mL da 5 a 10 volte.
19. Risospendere molto delicatamente con un puntale da 1.000 μl 10 volte.
20. Centrifugare a 250 × g a temperatura ambiente (20-25 °C) per 3 min.
21. Rimuovere il surnatante e risospendere molto delicatamente con 0,5 mL per embrione di terreno di placcatura utilizzando una punta da 1.000 μL per 10 volte.
22. Posizionare un filtro cellulare da 40 μm su una provetta da centrifuga da 50 mL, quindi filtrare la sospensione cellulare mediante flusso per gravità. Raccogliere la sospensione cellulare filtrata nella provetta.
23. Contare le celle e impiattare nelle camere a 2 × 10^{da 4} a 5 × 10⁴ cellule/cm², con un volume adeguato di terreno di placcatura. Un esempio della densità è mostrato nella Figura 1 supplementare.
24. Al giorno in vitro (Div.) 2, sostituire metà del terreno con terreno di coltura (terreno neurobasale contenente il 2% di integratore di B-27, 4 mM di Glutamax e 1x penicillina-streptomicina) e aggiungere 5 μM di 5-fluoro-2-deossiuridina (vedere Tabella dei materiali).
25. Dopo la Div. 4, sostituire metà del terreno con il terreno di coltura ogni 2 o 3 giorni.

2. Trasfezione di plasmidi in neurone primario in coltura utilizzando il metodo del fosfato di calcio

NOTA: I volumi indicati si riferiscono a un pozzetto da 0,8 cm² in una camera con fondo di vetro a 8 pozzetti (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparare 50 μL di soluzione di DNA/CaCl₂ mescolando 200 ng a 2 μg di un plasmide (APP-EGFP in pCAGGS, Alcα-EGFP in pcDNA3.1¹⁸ o Alcβ-EGFP in pcDNA3.1; vedere la Tabella supplementare 1) che codifica per una proteina marcata con fluorescenza, 6,2 μL di 2 M CaCl₂ e acqua sterilizzata.
2. Aliquotare 50 μl di soluzione salina tamponata con HEPES (HBS) in nuove provette da centrifuga.
3. Aggiungere 6,2 μL di soluzione di DNA/CaCl₂ a 2 soluzioni HBS. Miscelare delicatamente pipettando 10 volte.
4. Ripetere il passaggio 2.3 fino a quando tutta la soluzione di DNA/CaCl₂ è stata trasferita.
5. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
6. Raccogliere il terreno di coltura nella camera con fondo di vetro e sostituirlo con un terreno di coltura fresco senza antibiotici.
   NOTA: Conservare il terreno raccolto nell'incubatore per colture cellulari fino al passaggio 2.10.
7. Aggiungere 50 μl della miscela DNA/CaCl₂/HBS per pozzetto goccia a goccia ai neuroni. Coltura per 1 ora.
8. Durante l'incubazione, preparare il terreno acidificato ponendo una piastra di Petri contenente DMEM (terreno di Eagle modificato di Dulbecco)/terreno F-12 di Ham in un incubatore al 10% di CO₂ a 37 °C.
9. Dopo l'incubazione per 1 ora dopo la trasfezione, sciacquare i neuroni primari con F-12 (terreno acidificato) di DMEM/Ham 3 volte.
10. Sostituire i terreni con una combinazione di terreni raccolti per metà e per metà freschi. Coltura fino all'osservazione al microscopio a 37 °C e 5% CO₂.

3. Osservazione del trasporto assonale

1. Preincubare la camera dotata di microscopia TIRF (Total Internal Reflectance) (vedi Tabella dei Materiali) a 37 °C.
2. Se il controller di CO₂ è equipaggiato, il terreno di coltura può essere utilizzato come terreno di osservazione con una percentuale di CO_{2 inferiore al} 5%. Se non ne è dotato, sostituire il terreno con un mezzo a pH stabile, come Leibovitz L-15 (vedi Tabella dei materiali), fornito con 4 mM di Glutamax e 2% di integratore di B-27.
3. Trova una cellula trasfettata, quindi identifica un assone. Aumentare l'angolo di incidenza del laser fino a quando il laser non è completamente riflesso. Quindi, diminuire l'angolo fino a visualizzare tutte le vescicole nell'assone (pseudo-TIRF). Acquisisci immagini con un tempo di esposizione di 200 ms per 150 fotogrammi (30 s).
   NOTA: In questo esperimento, l'illuminazione pseud-TIRF è stata utilizzata per catturare tutte le vescicole assonali. Possono essere utilizzati altri microscopi dotati di sistemi di acquisizione ad alta velocità.
   NOTA: Registrare la direzione dell'assone ogni volta nel nome del file. L'area del segmento iniziale dell'assone o l'area dell'assone terminale è stata evitata dall'osservazione.

4. Elaborazione delle immagini

1. Aprire le immagini acquisite utilizzando il software MetaMorph (vedi Tabella dei Materiali).
2. Apri la barra degli strumenti > Misura > Calibra distanza. Abilita "applica a tutte le immagini aperte" e inserisci la distanza effettiva di un pixel.
3. Aprire la barra degli strumenti > visualizzare > ruotare. Attivare la casella di controllo "tutti gli aerei". Ruotare in modo che l'assone sia orizzontale e la direzione verso il terminale dell'assone sia verso destra.
4. Apri la barra degli strumenti > Regioni > Crea regioni. Imposta la dimensione della regione per il ritaglio e fai clic su Crea. Posizionare il fotogramma che appare sull'immagine nell'area dell'assone per l'analisi. Salva la sequenza di immagini generata come file stack.
   NOTA: Selezionare aree che non contengano assoni o detriti non focalizzati.
5. Aprire la barra degli strumenti > visualizzare > grafica. Selezionare Barra di calibrazione per timbrare la barra della scala. Selezionare Dati/Ora per aggiungere un timestamp alle immagini. Abilita "tutti gli aerei". Sposta gli oggetti nello spazio appropriato e fai clic sul timbro.
6. Apri la barra degli strumenti > impila > crea filmato. Immettere la frequenza fotogrammi appropriata e selezionare AVI. Salvarlo come nuovo file.

5. Disegno di un chimografo e rilevamento di tracce con KYMOMAKER

1. Scarica KYMOMAKER (vedi Tabella dei materiali) e apri "Kymoanalysis.exe" nella cartella KYMOMAKER.
2. Aprire "kymoAnalysis.exe" per visualizzare le finestre principali (Figura 1A). Seleziona File > carica e apri il filmato AVI creato. Apparirà una finestra "Anteprima" (Figura 1B).
3. Nella sezione Genera > ritaglio della scheda Kymograph, inserire i numeri dei pixel per il ritaglio. Il ritaglio si riflette immediatamente nella finestra "Anteprima" per consentire una facile regolazione (Figura 1C). Verificare che l'intera barra della scala e il timestamp siano stati rimossi.
4. Fare clic sul pulsante Genera per generare il chimografo (Figura 1C). KYMOMAKER rileva il pixel più luminoso all'interno di ciascun asse y nella finestra "Anteprima". Salva il chimografo tramite File > Salva > chimografo normale.
5. Per rilevare le tracce a bassa intensità nel chimografo, fare clic su Chimografo rotazionale. Regolare il numero nella sezione "Kymograph rotazionale" e visualizzare il risultato facendo clic sul chimografo rotazionale (Figura 1D).
   NOTA: "Rotazione (grado)" è l'intervallo del grado per l'algoritmo Rotational Watershed²¹. Ad esempio, 10° significa che l'algoritmo del bacino idrografico viene eseguito ogni 10° 36 volte e i risultati vengono quindi combinati nella finestra "Bacino idrografico rotazionale".
6. Per rilevare le tracce anterograde e retrograde nel chimografo, nella scheda Rilevamento > sezione Target , selezionare l'originale se il chimografo rotazionale non è stato generato. Assicurarsi che selezionando Rotazione, il bacino idrografico rotazionale creato venga utilizzato per rilevare le tracce. Seleziona Spartiacque in "Metodo di rilevamento". Fare clic sul pulsante Rileva per rilevare automaticamente le tracce.
   NOTA: Le tracce rilevate vengono disegnate nella finestra "Lavoro". Attivando la funzione "Mascheramento" si disegnano tracce sul chimografo originale.
7. Rileva le tracce anterograde e retrograde inserendo un numero nella sezione Rilevamento > filtraggio > Velocità (Figura 1E, F). Rileva le tracce anterograde inserendo da 0,4 a 7,0 μm/s. Rileva le tracce retrograde inserendo da -0,4 a -7,0 μm/s.
   NOTA: L'impostazione della velocità più bassa dipende dalla definizione di una condizione immobile delle vescicole. Vedere il passaggio 6.7.
8. Salva i file.

6. Determinazione della velocità

1. Apri il software MetaMorph.
   NOTA: Il plug-in "tracciamento manuale" in ImageJ può anche calcolare le velocità nello stesso modo.
2. Aprire il file creato nel passaggio 4.4. Assicurarsi che la calibrazione sia adattata alle immagini.
3. Apri la barra degli strumenti > App > Track Points. Fare clic su Aggiungi traccia. Trova una vescicola in movimento che è stata trasportata anterogradamente o retrogradamente. Quindi, traccia la vescicola facendo clic fino al termine del trasporto. Fare clic su Fine.
4. Ripetere il passaggio 6.3 fino a quando tutte le vescicole sono state tracciate.
5. Fare clic su apri registro per aprire un file CSV. Quindi, fare clic sul file di registro per visualizzare i dati nel file CSV.
6. Salva il file CSV.
7. Per calcolare la velocità segmentata non influenzata dalla pausa, rimuovere le velocità calcolate di 0,37 μm/s o inferiori nella colonna "velocità".
   NOTA: Le vescicole possono muoversi molto brevemente per diffusione anomala e non vengono elaborate dalle proteine motrici²³. Per evitare di includere questi movimenti dal calcolo delle velocità azionate dal motore, la velocità più bassa (1 pixel/200 ms) in questo protocollo viene rimossa dal calcolo.
8. Calcola la velocità media segmentata ogni cinque fotogrammi (per un totale di 1 s). Scartare l'ultima parte della velocità se rimangono meno di cinque fotogrammi.
9. Combina tutte le velocità medie di un'unica condizione. Genera istogrammi per visualizzare la distribuzione delle velocità.

Risultati

I neuroni primari coltivati dalla corteccia di topo E15.5 sono stati coltivati in un piatto con fondo di vetro come descritto. Ad esempio, APP-EGFP, Alcα-EGFP o Alcβ-EGFP erano espressi nei neuroni corticali primari. È noto che APP e Alcα vengono trasportati nell'assone dalla chinesina-1 ^2,17. APP si associa con la chinesina-1 tramite la proteina adattatore JIP1 (proteina 1 che interagisce con JNK), mentre Alcα si l...

Discussione

Viene descritto un metodo di analisi per il trasporto assonale, che include il calcolo della velocità segmentata e la generazione di chimografi. Un passaggio critico durante la fase di trasfezione è il mantenimento della salute dei neuroni in coltura. Il metodo di trasfezione descritto da Jiang e Chen²⁹ è stato seguito con piccole modifiche. La miscelazione delicata della soluzione di DNA/CaCl₂ e 2x HBS ha aumentato l'efficienza della trasfezione rid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Apo TIRF 100x/1.49 OIL	Nikon
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo fischer scientific	17504044
Bovine serum albumin	Wako	013-25773
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Takara	631312
Cell strainer  40 µm Nylon	Falcon	352340
CoolSNAP HQ	Photometrics
Deoxyribonuclease I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Glucose	Wako	041-00595
DMEM/Ham’s F-12	Wako	042-30555
Dumont No. 7 forceps	Dumont	No.7
Feather surgical blade	Feather	No.11
Feather surgical blade handle	Feather	No. 3
Gentamicin	Wako	079-02973
Gentamicin Sulfate	Wako	075-04913
GlutaMAX Supplement	Thermo fischer scientific	35050061
HEPES	DOJINDO	342-01375
Horse Serum, heat inactivated	Thermo fischer scientific	26050088
KCl	Wako	163-03545
KH2PO4	Wako	169-04245
KYMOMAKER			http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L5520
MetaMorph version 6.2r1	Metamorph
Na2HPO4	Wako	197-02865
NaCl	Wako	197-01667
NaHCO3	Wako	191-01305
Neurobasal Medium	Thermo fischer scientific	21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-E	Nikon
Nunc Lab-Tek  8 well Chambered Coverglass	Thermo fischer scientific	155411
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636-500MG
Trizma base	Merck	T1194-10PAK	solved with water to make 0.1 M Tris-HCl (pH.8.5)