Mesure du transport de la cargaison axonale dans les neurones corticaux primaires cultivés de souris

Résumé

Le présent protocole décrit l’ensemble de la procédure d’analyse pour le transport axonal. En particulier, le calcul de la vitesse de transport, sans compter la pause, et la méthode de visualisation à l’aide du logiciel en libre accès « KYMOMAKER » sont présentés ici.

Résumé

Les cellules neuronales sont des cellules hautement polarisées qui hébergent de manière stéréotypée plusieurs dendrites et un axone. La longueur d’un axone nécessite un transport bidirectionnel efficace par les protéines motrices. Divers rapports ont suggéré que des défauts dans le transport axonal sont associés à des maladies neurodégénératives. De plus, le mécanisme de coordination de plusieurs protéines motrices a été un sujet intéressant. Étant donné que l’axone a des microtubules unidirectionnels, il est plus facile de déterminer quelles protéines motrices sont impliquées dans le mouvement. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents au transport de la cargaison axonale est cruciale pour découvrir le mécanisme moléculaire des maladies neurodégénératives et la régulation des protéines motrices. Ici, nous présentons l’ensemble du processus d’analyse du transport axonal, y compris la culture des neurones corticaux primaires de souris, la transfection des plasmides codant pour les protéines de cargaison et les analyses directionnelles et de vitesse sans effet de pause. De plus, le logiciel en libre accès « KYMOMAKER » est introduit, qui permet de générer un kymographe pour mettre en évidence les traces de transport en fonction de leur direction et permettre une visualisation plus facile du transport axonal.

Introduction

Les membres de la famille des kinésines et la dynéine cytoplasmique sont des protéines motrices qui se déplacent le long des microtubules dans les cellules pour transporter leur cargaison¹. La plupart des kinésines se déplacent vers l’extrémité positive, tandis que la dynéine se déplace vers l’extrémité négative d’un microtubule. Les fonctions et les mécanismes du transport de marchandises dans l’axone neuronal ont été étudiés de manière approfondie. En raison de leur longueur, les axones ont besoin d’un transport stable sur de longues distances pour maintenir la santé des neurones. Des défauts dans le transport des mitochondries, des autophagosomes et des vésicules contenant le précurseur de la protéine β amyloïde (APP) ont été signalés comme causes de maladies neurodégénératives ^2,3. De nombreuses études in vitro ont révélé les mécanismes sous-jacents au transport coordonné par les protéines motrices, et diverses études utilisant des protéines motrices et des microtubules purifiés ont révélé comment les molécules motrices se déplacent le long des microtubules ^4,5. En règle générale, plusieurs moteurs sont impliqués dans une seule cargaison⁶. Cependant, il existe des modèles de la façon dont les moteurs opposés déterminent la direction du transport de marchandises. L’un est le « modèle d’association/dissociation » ; Dans ce cas, seuls des moteurs unidirectionnels sont associés à la cargaison lors du transport unidirectionnel. Dans le second, le « modèle de coordination », les deux moteurs sont attachés à la même cargaison, et un seul côté du moteur est activé. Dans le troisième modèle de tir à la corde, l’équilibre de force entre les kinésines et les dynéines détermine la direction du transport ^7,8,9. De plus, plusieurs rapports ont suggéré que l’équilibre et le nombre de protéines motrices activées influencent la vitesse du transport de marchandises in vitro ^8,10.

Une question sans réponse est de savoir comment ces activités des kinésines ou des dynéines sont régulées dans les cellules vivantes. Des rapports antérieurs ont montré l’acétylation des microtubules dans les axones, et les facteurs neurotrophiques améliorent le transport axonal^11,12. En outre, divers types de cargaison et d’adaptateurs de cargaison fonctionnent comme des activateurs de moteur de manière correspondante^13,14. Beaucoup sont associés à la membrane des vésicules de transport, et leurs fonctions sont régulées par des signaux tels que les modifications post-traductionnelles¹⁵. Par conséquent, l’observation de la direction et de la vitesse de transport dans les cellules vivantes offre des informations précieuses sur la régulation moléculaire du transport de marchandises dans des expériences in vitro. L’observation du transport axonal permet de distinguer le transport basé sur la kinésine et la dynéine. Parce que les axones hébergent des microtubules unidirectionnels¹⁶, la cargaison est transportée antérograde (c’est-à-dire du soma à la terminaison axonale) par les kinésines et rétrograde (c’est-à-dire de la terminaison axonale au soma) par les dynéines.

Dans la présente étude, une méthode d’observation et d’analyse du transport axonal dans les neurones primaires en culture est décrite. À titre d’exemple, la procédure d’observation du transport axonal des protéines membranaires-APP, de la calsynténine-1/alcadéine α (Alcα) et de la calsynténine-3/alcadéine β (Alcβ) - contenant des vésicules est décrite. Il est connu que le transport antérograde des vésicules contenant de l’APP est considérablement plus rapide que celui des vésicules contenant de l’Alcα, bien que les deux soient transportées par la kinésine-1 17,18,19. Dans les rapports précédents, plusieurs méthodes ont été utilisées pour mesurer la vitesse. L’étape la plus variable est la gestion des pauses pendant le transport. Dans les cellules vivantes, le transport est parfois entravé par des obstacles le long des microtubules ; Cependant, les moteurs peuvent contourner une région avec ou sans pause²⁰. Le calcul de la vitesse sur une période d’observation plus longue peut être affecté par la pause, ce qui peut entraîner une estimation plus lente de la vitesse. Ici, une méthode est décrite en utilisant le mouvement sur une période segmentée (200 ms) pour exclure l’effet de la pause physique des moteurs. Enfin, un logiciel en libre accès (Windows uniquement) appelé « KYMOMAKER »²¹ est introduit. Les kymographes sont largement utilisés pour visualiser le transport vésiculaire et sont utiles pour visualiser la direction de transport de chaque cargaison sans nécessiter de film. Le logiciel génère des kymographes à partir de films en accéléré en appliquant un algorithme unidimensionnel de Watershed plusieurs fois pendant la rotation des images. Cela permet au kymographe résultant de montrer des structures fines de manière efficace et facile. De plus, KYMOMAKER détecte et met automatiquement en évidence les sentiers en fonction de leur direction et permet de créer des diagrammes faciles à comprendre.

Protocole

Les expériences ont été approuvées par le Comité d’études animales de l’Université d’Hokkaido, conformément aux directives ARRIVE (Animal Research : Reporting of In Vivo Experiments). Des souris femelles C57BL/6J (gestantes, 15,5 jours) ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation de neurones corticaux primaires cultivés de souris

1. Ajouter 0,1 mg/mL de poly-L-lysine dans 0,1 M de Tris (tris(hydroxyméthyl)aminométhane)-HCl (pH 8,5) dans une chambre à fond de verre à 8 puits (n° 1.0) (voir le tableau des matériaux). Incuber la chambre dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h.
2. Rincez la chambre à l’eau stérilisée au moins trois fois et séchez-la à l’air libre dans une hotte de culture de tissus.
3. Sacrifiez les souris enceintes à 15,5 jours par luxation cervicale ou en suivant les réglementations approuvées par l’institution.
4. Pincez la corne utérine contenant les embryons, isolez toutes les cornes utérines à l’aide de ciseaux et plongez-les dans une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) sur de la glace.
5. Dans le PBS froid, isolez les embryons à l’aide d’une pince à épiler pointue et retirez toutes les membranes amniotiques des embryons.
6. Lavez à nouveau les embryons avec du PBS frais et froid.
   REMARQUE : Lors de chaque étape d’isolement, lavez autant de sang que possible et assurez-vous de ne pas endommager les vaisseaux ou les embryons.
7. Placez un embryon sur une gaze stérilisée dans une boîte de Pétri froide sous microscopie optique.
8. Isolez le cerveau. Coupez la tête, la peau et le crâne de l’embryon à l’aide de la pointe d’une pince à épiler pointue et incurvée. Retirez la peau et le crâne pour exposer le haut et les côtés du cerveau.
9. Prélevez tout le cerveau à l’aide de la partie incurvée de la pince à épiler et plongez-le dans une boîte de Pétri contenant 1x la solution saline équilibrée de Hanks glacée (HBSS ; 10 mM HEPES [pH 7,6], 5,3 mM KCl, 0,44 mM KH₂PO₄, 140 mM NaCl, 4,2 mM NaHCO₃, 0,34 mM Na₂HPO₄, 39 mM D-glucose, et 0,5 μg/mL de gentamicine ; voir la table des matériaux).
10. Répétez les étapes 1.7-1.9 jusqu’à ce que le nombre requis de cerveaux soit obtenu.
    REMARQUE : En règle générale, 5 x 10⁶ à 2 x 10⁷ cellules par cerveau peuvent être obtenues.
11. Séparez le cortex²² du cerveau à l’aide d’une pince à épiler dans un HBSS froid et arrachez les méninges du cortex.
12. Transférez le cortex dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 1x HBSS froid. Coupez le cortex en deux ou en trois à l’aide de lames chirurgicales.
13. Transférez le cortex dans un tube à centrifuger de 15 ml à l’aide d’embouts de 1 000 μL coupés et retirez l’excédent 1x HBSS.
14. Ajouter 100 unités de papaïne et 200 μg de désoxyribonucléase I (DNase I) dilués avec 5 mL de solution diluée de papaïne (5 mg/mL de D-glucose, 0,2 mg/mL d’albumine sérique bovine et 0,2 mg/mL de L-cystéine dans 1x PBS ; voir le tableau des matériaux) par embryon, et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min. Retournez le tube toutes les 5 min pendant l’incubation.
    REMARQUE : La préincubation de la papaïne dans une solution diluée de papaïne est recommandée. Incuber 5 min dans un bain-marie à 37 °C, puis ajouter la DNase I.
15. Jetez la solution. Ajouter 2 ml de sérum de cheval inactivé à 20 % par la chaleur (voir le tableau des matériaux) dans 1x HBSS. Incuber pendant 1 min.
16. Jetez la solution. Rincez le mouchoir avec 4 ml de 1x HBSS deux fois.
17. Jetez la solution. Ajouter 0,5 mL par embryon de milieu de placage (milieu neurobasal contenant 2 % de supplément de B-27, 4 mM de Glutamax, 5 % de sérum de cheval inactivé par la chaleur et 1 x pénicilline-streptomycine ; voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Au cours des étapes 1.14 à 1.17, aucune centrifugation n’est nécessaire car les morceaux de cortex coupés coulent au fond du tube sans elle. N’utilisez pas d’aspirateur et n’aspirez pas les morceaux.
18. Remettre en suspension très doucement à l’aide d’une pointe coupée de 1 000 μL ou d’une pipette de 10 ml 5 à 10 fois.
19. Remettez en suspension très doucement avec un embout de 1 000 μL 10 fois.
20. Centrifuger à 250 × g à température ambiante (20-25 °C) pendant 3 min.
21. Retirer le surnageant et le remettre en suspension très doucement avec 0,5 mL par embryon de milieu de placage à l’aide d’une pointe de 1 000 μL 10 fois.
22. Placez une crépine de cellule de 40 μm sur un tube à centrifuger de 50 mL, puis filtrez la suspension de cellule par écoulement par gravité. Récupérez la suspension cellulaire filtrée dans le tube.
23. Comptez les cellules et la plaque dans les chambres à raison de 2 × 10⁴ à 5 × 10⁴ cellules/cm², avec un volume approprié de milieu de placage. La figure supplémentaire 1 donne un exemple de la densité.
24. Au jour in vitro (division 2), remplacer la moitié du milieu par un milieu de culture (milieu neurobasal contenant 2 % de supplément de B-27, 4 mM de glutamax et 1 x pénicilline-streptomycine) et ajouter 5 μM de 5-fluoro-2-désoxyuridine (voir le tableau des matériaux).
25. Après la division 4, remplacer la moitié du milieu par un milieu de culture tous les 2 ou 3 jours.

2. Transfection de plasmides dans un neurone primaire cultivé à l’aide de la méthode du phosphate de calcium

REMARQUE : Les volumes mentionnés sont pour un puits de^{0,8 cm 2} dans une chambre à fond de verre à 8 puits (voir le tableau des matériaux).

1. Préparez 50 μL de solution d’ADN/CaCl₂ en mélangeant 200 ng à 2 μg d’un plasmide (APP-EGFP dans pCAGGS, Alcα-EGFP dans pcDNA3.1¹⁸ ou Alcβ-EGFP dans pcDNA3.1 ; voir le tableau supplémentaire 1) codant pour une protéine marquée en fluorescence, 6,2 μL de 2 M de CaCl₂ et de l’eau stérilisée.
2. Aliquote 50 μL de solution saline tamponnée HEPES (HBS) dans de nouveaux tubes à centrifuger.
3. Ajouter 6,2 μL de solution d’ADN/CaCl₂ dans une solution HBS 2x. Mélangez doucement en pipetant 10 fois.
4. Répétez l’étape 2.3 jusqu’à ce que toute la solution d’ADN/CaCl₂ ait été transférée.
5. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
6. Récupérez le milieu de culture dans la chambre à fond de verre et remplacez-le par un milieu de culture frais sans antibiotiques.
   REMARQUE : Conservez le milieu collecté dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à l’étape 2.10.
7. Ajouter 50 μL du mélange ADN/CaCl₂/HBS par puits goutte à goutte dans les neurones. Culture pendant 1 h.
8. Pendant l’incubation, préparez le milieu acidifié en plaçant une boîte de Pétri contenant du DMEM (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco)/du milieu F-12 de Ham dans un incubateur à 10 % de CO₂ à 37 °C.
9. Après l’incubation pendant 1 h suivant la transfection, rincer les neurones primaires avec le F-12 (milieu acidifié) de DMEM/Ham 3 fois.
10. Remplacer le milieu par un mélange de milieux à moitié collectés et à moitié frais. Culture jusqu’à observation par microscopie à 37 °C et 5 % de CO₂.

3. Observation du transport axonal

1. Préincuber la chambre équipée d’une microscopie TIRF (réflectance interne totale) (voir tableau des matériaux) à 37 °C.
2. Si le contrôleur de CO₂ est équipé, le milieu de culture peut être utilisé comme milieu d’observation à moins de 5 % de CO₂. S’il n’en est pas équipé, remplacez le milieu par un milieu au pH stable, tel que le Leibovitz L-15 (voir tableau des matériaux), fourni avec 4 mM de Glutamax et 2 % de supplément B-27.
3. Trouvez une cellule transfectée, puis identifiez un axone. Augmentez l’angle d’incidence du laser jusqu’à ce que le laser soit complètement réfléchi. Ensuite, diminuez l’angle jusqu’à ce que toutes les vésicules de l’axone soient visualisées (pseudo-TIRF). Acquérez des images avec un temps d’exposition de 200 ms pour 150 images (30 s).
   REMARQUE : Dans cette expérience, l’éclairage pseud-TIRF a été utilisé pour capturer toutes les vésicules axonales. D’autres microscopes équipés de systèmes de capture à grande vitesse peuvent être utilisés.
   REMARQUE : Enregistrez la direction de l’axone à chaque fois dans le nom du fichier. L’aire du segment axonal initial ou de l’aire de l’axone terminal a été évitée de l’observation.

4. Traitement d’image

1. Ouvrez les images acquises à l’aide du logiciel MetaMorph (voir Table des matériaux).
2. Ouvrez la barre d’outils > Mesurer > Calibrer la distance. Activez « Appliquer à toutes les images ouvertes » et entrez la distance réelle d’un pixel.
3. Ouvrez la barre d’outils > Afficher > Pivoter. Cochez la case « tous les plans ». Tournez de manière à ce que l’axone soit horizontal et que la direction vers la terminaison de l’axone soit vers la droite.
4. Ouvrez la barre d’outils > Régions > Créer des régions. Définissez la taille de la région pour le découpage et cliquez sur Créer. Placez le cadre qui apparaît sur l’image sur la zone axonale pour l’analyse. Enregistrez la séquence d’images générée en tant que fichier de pile.
   REMARQUE : Sélectionnez des zones qui ne contiennent pas d’axones ou de débris non focalisés.
5. Ouvrez la barre d’outils > Afficher > graphiques. Sélectionnez Barre d’étalonnage pour tamponner la barre d’échelle. Sélectionnez Données/Heure pour ajouter un horodatage aux images. Activez « tous les plans ». Déplacez les objets dans l’espace approprié et cliquez sur tamponner.
6. Ouvrez la barre d’outils > Empiler > Réaliser un film. Entrez la fréquence d’images appropriée et sélectionnez AVI. Enregistrez-le en tant que nouveau fichier.

5. Dessin d’un kymographe et détection de traces à l’aide de KYMOMAKER

1. Téléchargez KYMOMAKER (voir Tableau des matériaux) et ouvrez « Kymoanalysis.exe » dans le dossier KYMOMAKER.
2. Ouvrez « kymoAnalysis.exe » pour afficher les fenêtres principales (Figure 1A). Sélectionnez Fichier > Charger et ouvrez le film AVI créé. Une fenêtre « Aperçu » s’affiche (Figure 1B).
3. Dans l’onglet Générer Kymograph > section de découpage , saisissez les numéros de pixel pour le découpage. Le découpage est immédiatement répercuté dans la fenêtre « Aperçu » pour permettre un réglage facile (Figure 1C). Vérifiez que la barre d’échelle et l’horodatage ont été supprimés.
4. Cliquez sur le bouton Générer pour générer le kymographe (Figure 1C). KYMOMAKER détecte le pixel le plus brillant dans chaque axe y dans la fenêtre « Aperçu ». Enregistrez le kymographe via Fichier > Enregistrer > kymographe normal.
5. Pour détecter les traces de faible intensité dans le kymographe, cliquez sur Kymographe rotationnel. Ajustez le nombre dans la section « Kymographe de rotation » et affichez le résultat en cliquant sur le kymographe de rotation (Figure 1D).
   REMARQUE : « Rotation (degré) » est l’intervalle du degré pour l’algorithme de bassin versant^{rotationnel 21}. Par exemple, 10° signifie que l’algorithme de bassin versant est exécuté toutes les 10° 36 fois, et que les résultats sont ensuite combinés dans la fenêtre « Bassin versant de rotation ».
6. Pour détecter les traces antérogrades et rétrogrades dans le kymographe, dans l’onglet Détection > section Cible , sélectionnez original si le kymographe rotationnel n’a pas été généré. Assurez-vous qu’en sélectionnant Rotation, le bassin versant de rotation créé est utilisé pour détecter les traces. Sélectionnez Bassin versant dans « Méthode de détection ». Cliquez sur le bouton Détecter pour détecter automatiquement les traces.
   REMARQUE : Les traces détectées sont dessinées dans la fenêtre « Travail ». L’activation de « Masking » dessine des traces sur le kymographe original.
7. Détectez les traces antérogrades et rétrogrades en entrant un nombre dans la section Détection > filtrage > vitesse (Figure 1E,F). Détectez les traces antérogrades en saisissant 0,4 à 7,0 μm/s. Détectez les traces rétrogrades en saisissant −0,4 à −7,0 μm/s.
   REMARQUE : Le réglage de la vitesse la plus basse dépend de la définition d’une condition immobile des vésicules. Voir l’étape 6.7.
8. Enregistrez les fichiers.

6. Détermination du vecteur vitesse

1. Ouvrez le logiciel MetaMorph.
   REMARQUE : Le plugin « suivi manuel » d’ImageJ peut également calculer les vitesses de la même manière.
2. Ouvrez le fichier créé à l’étape 4.4. Assurez-vous que le calibrage est adapté aux images.
3. Ouvrez la barre d’outils > Applications > Suivre des points. Cliquez sur Ajouter une piste. Trouvez une vésicule en mouvement qui a été transportée antérogradement ou rétrogradement. Ensuite, suivez la vésicule en cliquant jusqu’à ce que le transport se termine. Cliquez sur Terminé.
4. Répétez l’étape 6.3 jusqu’à ce que toutes les vésicules aient été suivies.
5. Cliquez sur ouvrir le journal pour ouvrir un fichier CSV. Ensuite, cliquez sur le fichier journal pour afficher les données dans le fichier CSV.
6. Enregistrez le fichier CSV.
7. Pour calculer la vitesse segmentée non affectée par la pause, supprimez les vitesses calculées de 0,37 μm/s ou moins dans la colonne « vitesse ».
   REMARQUE : Les vésicules peuvent se déplacer très rapidement par diffusion anormale, et elles ne sont pas traitées par les protéines motrices²³. Pour éviter d’inclure ces mouvements dans le calcul des vitesses entraînées par le moteur, la vitesse la plus basse (1 pixel/200 ms) de ce protocole est supprimée du calcul.
8. Calculez la vitesse moyenne segmentée toutes les cinq images (soit un total de 1 s). Jetez la dernière partie de la vélocité s’il reste moins de cinq images.
9. Combinez toutes les vitesses moyennes d’une seule condition. Générez des histogrammes pour aider à visualiser la distribution des vitesses.

Résultats

Les neurones primaires cultivés du cortex de souris E15.5 ont été cultivés dans une boîte à fond de verre comme décrit. À titre d’exemple, APP-EGFP, Alcα-EGFP ou Alcβ-EGFP ont été exprimés dans les neurones corticaux primaires. On sait que l’APP et l’Alcα sont transportés dans l’axone par la kinésine-1 ^2,17. L’APP s’associe à la kinésine-1 via la protéine adaptatrice JIP1 (protéine interag...

Discussion

Une méthode d’analyse du transport axonal est décrite, qui comprend le calcul de la vitesse segmentée et la génération de kymographes. Une étape critique de l’étape de transfection est le maintien de la santé des neurones en culture. La méthode de transfection décrite par Jiang et Chen²⁹ a été suivie avec des modifications mineures. Le mélange doux de la solution d’ADN/CaCl₂ et de 2x HBS a augmenté l’efficacité de la transfection ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Apo TIRF 100x/1.49 OIL	Nikon
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo fischer scientific	17504044
Bovine serum albumin	Wako	013-25773
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Takara	631312
Cell strainer  40 µm Nylon	Falcon	352340
CoolSNAP HQ	Photometrics
Deoxyribonuclease I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Glucose	Wako	041-00595
DMEM/Ham’s F-12	Wako	042-30555
Dumont No. 7 forceps	Dumont	No.7
Feather surgical blade	Feather	No.11
Feather surgical blade handle	Feather	No. 3
Gentamicin	Wako	079-02973
Gentamicin Sulfate	Wako	075-04913
GlutaMAX Supplement	Thermo fischer scientific	35050061
HEPES	DOJINDO	342-01375
Horse Serum, heat inactivated	Thermo fischer scientific	26050088
KCl	Wako	163-03545
KH2PO4	Wako	169-04245
KYMOMAKER			http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L5520
MetaMorph version 6.2r1	Metamorph
Na2HPO4	Wako	197-02865
NaCl	Wako	197-01667
NaHCO3	Wako	191-01305
Neurobasal Medium	Thermo fischer scientific	21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-E	Nikon
Nunc Lab-Tek  8 well Chambered Coverglass	Thermo fischer scientific	155411
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636-500MG
Trizma base	Merck	T1194-10PAK	solved with water to make 0.1 M Tris-HCl (pH.8.5)