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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo describe todo el procedimiento de análisis para el transporte axonal. En particular, aquí se muestra el cálculo de la velocidad de transporte, sin incluir la pausa, y el método de visualización utilizando el software de acceso abierto "KYMOMAKER".

Resumen

Las células neuronales son células altamente polarizadas que albergan estereotipadamente varias dendritas y un axón. La longitud de un axón requiere un transporte bidireccional eficiente por parte de las proteínas motoras. Diversos informes han sugerido que los defectos en el transporte axonal están asociados con enfermedades neurodegenerativas. Además, el mecanismo de coordinación de múltiples proteínas motoras ha sido un tema atractivo. Dado que el axón tiene microtúbulos unidireccionales, es más fácil determinar qué proteínas motoras están involucradas en el movimiento. Por lo tanto, comprender los mecanismos que subyacen al transporte de la carga axonal es crucial para descubrir el mecanismo molecular de las enfermedades neurodegenerativas y la regulación de las proteínas motoras. Aquí, presentamos todo el proceso del análisis de transporte axonal, incluido el cultivo de neuronas corticales primarias de ratón, la transfección de plásmidos que codifican proteínas de carga y análisis direccionales y de velocidad sin el efecto de pausas. Además, se introduce el software de acceso abierto "KYMOMAKER", que permite la generación de un quimógrafo para resaltar las trazas de transporte según su dirección y facilitar la visualización del transporte axonal.

Introducción

Los miembros de la familia de la kinesina y la dineína citoplasmática son proteínas motoras que se mueven a lo largo de los microtúbulos de las células para transportar su carga. La mayoría de las kinesinas se mueven hacia el extremo positivo, mientras que la dineína se mueve hacia el extremo negativo de un microtúbulo. Las funciones y mecanismos del transporte de carga en el axón neuronal se han investigado ampliamente. Debido a su longitud, los axones requieren un transporte estable a larga distancia para mantener la salud de las neuronas. Se han descrito defectos en el transporte de mitocondrias, autofagosomas y vesículas que contienen precursores de proteínas β amiloide (APP) como causas de enfermedades neurodegenerativas 2,3. Numerosas investigaciones in vitro han revelado los mecanismos que subyacen al transporte coordinado de las proteínas motoras, y varios estudios con proteínas motoras purificadas y microtúbulos han descubierto cómo se mueven las moléculas motoras a lo largo de los microtúbulos 4,5. Por lo general, varios motores están involucrados en una sola carga6. Sin embargo, hay algunos modelos de cómo los motores opuestos determinan la dirección del transporte de carga. Uno es el "modelo de asociación/disociación"; En este, solo los motores unidireccionales están asociados con la carga durante el transporte unidireccional. En el segundo, el "modelo de coordinación", ambos motores están unidos a la misma carga y solo se activa un lado del motor. En el tercer "modelo de tira y afloja", el equilibrio de fuerzas entre quinesinas y dineínas determina la dirección del transporte 7,8,9. Además, varios reportes han sugerido que el equilibrio y el número de proteínas motoras activadas influyen en la velocidad del transporte de carga in vitro 8,10.

Una pregunta sin respuesta es cómo se regulan estas actividades de las quinesinas o dineínas en las células vivas. Informes previos han demostrado la acetilación de los microtúbulos en los axones y los factores neurotróficos aumentan el transporte axonal11,12. Además, varios tipos de carga y adaptadores de carga funcionan como activadores de motor de manera correspondiente13,14. Muchos están asociados a la membrana de las vesículas transportadoras y sus funciones están reguladas por señales como las modificaciones postraduccionales15. Por lo tanto, la observación de la dirección y la velocidad del transporte en células vivas ofrece información valiosa sobre la regulación molecular del transporte de carga en experimentos in vitro. La observación del transporte axonal permite distinguir entre el transporte basado en kinesina y el transporte basado en dineína. Debido a que los axones albergan microtúbulos unidireccionales de extremo positivo16, la carga es transportada anterógradamente (es decir, del soma al terminal del axón) por quinesinas y retrógradamente (es decir, del terminal del axón al soma) por las dineínas.

En el presente estudio se describe un método para observar y analizar el transporte axonal en neuronas primarias cultivadas. A modo de ejemplo, se describe el procedimiento para observar el transporte axonal de las proteínas de membrana-APP, calsintenina-1/alcadeína α (Alcα) y vesículas que contienen calsintenina-3/alcadeína β (Alcβ). Se sabe que el transporte anterógrado de las vesículas que contienen APP es considerablemente más rápido que el de las vesículas que contienen Alcα, aunque ambas son transportadas por la kinesina-1 17,18,19. En informes anteriores, se han utilizado varios métodos para medir la velocidad. El paso más variable es el manejo de las pausas durante el transporte. En las células vivas, el transporte a veces se ve obstaculizado por obstáculos a lo largo de los microtúbulos; Sin embargo, los motores pueden omitir una región con o sin pausa20. El cálculo de la velocidad durante un tiempo de observación más largo puede verse afectado por la pausa, lo que puede resultar en una estimación de velocidad más lenta. Aquí, se describe un método que utiliza el movimiento durante un período segmentado (200 ms) para excluir el efecto de la pausa física de los motores. Por último, se introduce un programa de software de acceso abierto (solo para Windows) llamado "KYMOMAKER"21. Los chimógrafos se utilizan ampliamente para visualizar el transporte vesicular y son útiles para visualizar la dirección de transporte de cada carga sin necesidad de una película. El software genera kymographs a partir de películas de lapso de tiempo mediante la aplicación de un algoritmo de cuenca hidrográfica unidimensional varias veces durante la rotación de las imágenes. Esto permite que el kymograph resultante muestre estructuras finas de manera eficiente y fácil. Además, KYMOMAKER detecta y resalta automáticamente los senderos según su dirección y permite la creación de diagramas fáciles de entender.

Protocolo

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Estudios Animales de la Universidad de Hokkaido, siguiendo las directrices de ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6J (preñados, 15,5 días).

1. Preparación de neuronas corticales primarias cultivadas en ratones

  1. Agregue 0.1 mg/mL de poli-L-lisina en 0.1 M de Tris (tris(hidroximetil)aminometano)-HCl (pH 8.5) en una cámara de 8 pocillos (No.1.0) con fondo de vidrio (ver Tabla de Materiales). Incubar la cámara en una incubadora a 37 °C durante un mínimo de 1 h.
  2. Enjuague la cámara con agua esterilizada un mínimo de tres veces y séquela al aire en una campana de cultivo de tejidos.
  3. Sacrificar las ratas preñadas a los 15,5 días por luxación cervical, o siguiendo las normas aprobadas institucionalmente.
  4. Pellizque el cuerno uterino que contiene los embriones, aísle todos los cuernos uterinos con unas tijeras y sumérjalos en solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) con hielo.
  5. En el PBS frío, aísle los embriones con pinzas afiladas y retire todas las membranas amnióticas de los embriones.
  6. Lavar los embriones de nuevo con PBS fresco y frío.
    NOTA: Durante cada paso del aislamiento, lave la mayor cantidad de sangre posible y asegúrese de no dañar los vasos o los embriones.
  7. Coloque un embrión en una gasa esterilizada en una placa de Petri fría bajo microscopía óptica.
  8. Aísla el cerebro. Corta la cabeza, la piel y el cráneo del embrión con la punta de unas pinzas afiladas y curvas. Retire la piel y el cráneo para exponer la parte superior y los lados del cerebro.
  9. Extraiga todo el cerebro con la parte curva de las pinzas y sumérjalo en una placa de Petri que contenga 1 solución salina equilibrada de Hanks helada (HBSS; 10 mM HEPES [pH 7,6], 5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 4,2 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4, 39 mM D-glucosa, y 0,5 μg/mL de gentamicina; ver Tabla de Materiales).
  10. Repita los pasos 1.7-1.9 hasta obtener el número requerido de cerebros.
    NOTA: Por lo general, se pueden obtener de 5 x 106 a 2 x 107 células por cerebro.
  11. Separe la corteza22 del cerebro usando pinzas en HBSS frío 1x y arranque las meninges de la corteza.
  12. Transfiera la corteza a una nueva placa de Petri que contenga 1x HBSS frío. Corta la corteza por la mitad o en tercios con cuchillas quirúrgicas.
  13. Transfiera la corteza a un tubo de centrífuga de 15 mL utilizando puntas de 1.000 μL cortadas en punta y elimine el exceso de HBSS 1x.
  14. Añadir 100 unidades de papaína y 200 μg de desoxirribonucleasa I (DNasa I) diluidas con 5 mL de solución diluida de papaína (5 mg/mL de D-glucosa, 0,2 mg/mL de albúmina sérica bovina y 0,2 mg/mL de L-cisteína en 1x PBS; ver Tabla de Materiales) por embrión, e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 15 min. Invierta el tubo cada 5 minutos durante la incubación.
    NOTA: Se recomienda la preincubación de la papaína en una solución diluida de papaína. Incubar durante 5 min en un baño de agua a 37 °C, luego agregar DNasa I.
  15. Deseche la solución. Añadir 2 mL de suero de caballo inactivado por calor al 20% (ver Tabla de Materiales) en 1x HBSS. Incubar durante 1 min.
  16. Deseche la solución. Enjuague el pañuelo con 4 mL de 1x HBSS dos veces.
  17. Deseche la solución. Añadir 0,5 mL por embrión de medio de siembra (medio neurobasal que contiene un 2% de suplemento de B-27, 4 mM de Glutamax, un 5% de suero de caballo inactivado por calor y 1x penicilina-estreptomicina; ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Durante los pasos 1.14-1.17, no es necesaria la centrifugación ya que las piezas de la corteza cortada se hunden hasta el fondo del tubo sin ella. No use un aspirador y no aspire las piezas.
  18. Vuelva a suspender muy suavemente con una punta cortada de 1.000 μL o una pipeta de 10 mL de 5 a 10 veces.
  19. Vuelva a suspender muy suavemente con una punta de 1.000 μL 10 veces.
  20. Centrifugar a 250 × g a temperatura ambiente (20-25 °C) durante 3 min.
  21. Retirar el sobrenadante y volver a suspender muy suavemente con 0,5 mL por embrión de medio de siembra utilizando una punta de 1.000 μL 10 veces.
  22. Coloque un filtro de celdas de 40 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL, luego filtre la suspensión de celdas por flujo de gravedad. Recoja la suspensión celular filtrada en el tubo.
  23. Cuente las células y la placa en las cámaras a 2 × 104 a 5 × 104 células/cm2, con un volumen adecuado de medio de siembra. Un ejemplo de la densidad se muestra en la Figura Suplementaria 1.
  24. En el día in vitro (Div.) 2, reemplace la mitad del medio con medio de cultivo (medio neurobasal que contiene un 2% de suplemento de B-27, 4 mM de Glutamax y 1x penicilina-estreptomicina) y agregue 5 μM de 5-fluoro-2-desoxiuridina (ver Tabla de Materiales).
  25. Después de la Div. 4, reemplace la mitad del medio con medio de cultivo cada 2 o 3 días.

2. Transfección de plásmidos a neurona primaria cultivada mediante el método del fosfato de calcio

NOTA: Los volúmenes mencionados corresponden a un pocillo de 0,8cm2 en una cámara de 8 pocillos con fondo de vidrio (ver Tabla de Materiales).

  1. Prepare 50 μL de solución de ADN/CaCl2 mezclando 200 ng a 2 μg de un plásmido (APP-EGFP en pCAGGS, Alcα-EGFP en pcDNA3.118, o Alcβ-EGFP en pcDNA3.1; ver Tabla suplementaria 1) que codifica una proteína marcada con fluorescencia, 6,2 μL de 2 M CaCl2 y agua esterilizada.
  2. Alícuota 50 μL de solución salina tamponada (HBS) 2x HEPES en nuevos tubos de centrífuga.
  3. Agregue 6,2 μL de solución de ADN/CaCl2 a 2x solución HBS. Mezclar suavemente pipeteando 10 veces.
  4. Repita el paso 2.3 hasta que se haya transferido toda la solución de ADN/CaCl2 .
  5. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Recoja el medio de cultivo en la cámara con fondo de vidrio y reemplácelo con un medio de cultivo fresco sin antibióticos.
    NOTA: Mantenga el medio recolectado en la incubadora de cultivos celulares hasta el paso 2.10.
  7. Añadir 50 μL de la mezcla de ADN/CaCl2/HBS por pocillo gota a gota a las neuronas. Cultivo durante 1 h.
  8. Durante la incubación, prepare el medio acidificado colocando una placa de Petri que contenga DMEM (medio de águila modificado de Dulbecco)/medio F-12 de Ham en una incubadora de CO2 al 10% a 37 °C.
  9. Después de incubar durante 1 h después de la transfección, enjuague las neuronas primarias con DMEM/Ham's F-12 (medio acidificado) 3 veces.
  10. Reemplace los medios con una mezcla de medios medio recolectados y medios de cultivo medio frescos. Cultivo hasta observación por microscopía a 37 °C y 5% de CO2.

3. Observación del transporte axonal

  1. Preincubar la cámara equipada con microscopía TIRF (reflectancia interna total) (ver Tabla de Materiales) a 37 °C.
  2. Si el controlador de CO2 está equipado, el medio de cultivo se puede utilizar como medio de observación por debajo del 5% de CO2. Si no está equipado, sustituya el medio por un medio de pH estable, como Leibovitz L-15 (ver Tabla de materiales), suministrado con 4 mM de Glutamax y un suplemento de B-27 al 2%.
  3. Encuentra una célula transfectada y luego identifica un axón. Aumente el ángulo de incidencia del láser hasta que el láser se refleje por completo. Luego, disminuya el ángulo hasta que se visualicen todas las vesículas en el axón (pseudo-TIRF). Adquiera imágenes con un tiempo de exposición de 200 ms durante 150 fotogramas (30 s).
    NOTA: En este experimento, se utilizó la iluminación pseud-TIRF para capturar todas las vesículas axónicas. Se pueden utilizar otros microscopios equipados con sistemas de captura de alta velocidad.
    NOTA: Registre la dirección del axón cada vez en el nombre del archivo. Se evitó el área del segmento axónico inicial o el área terminal del axón en la observación.

4. Procesamiento de imágenes

  1. Abra las imágenes adquiridas con el software MetaMorph (consulte la Tabla de materiales).
  2. Abra la barra de herramientas > Medir > calibrar distancia. Habilite "aplicar a todas las imágenes abiertas" e ingrese la distancia real de un píxel.
  3. Abra la barra de herramientas > Mostrar > girar. Active la casilla de verificación para "todos los aviones". Gire para que el axón quede horizontal y la dirección hacia el terminal del axón sea hacia la derecha.
  4. Abra la barra de herramientas > Regiones > Crear regiones. Establezca el tamaño de la región para el recorte y haga clic en Crear. Coloque el marco que aparece en la imagen en el área del axón para su análisis. Guarde la secuencia de imágenes generada como un archivo de pila.
    NOTA: Seleccione áreas que no contengan axones desenfocados o desechos.
  5. Abra la barra de herramientas > Mostrar > gráficos. Seleccione Barra de calibración para estampar la barra de escala. Seleccione Datos/Tiempo para agregar una marca de tiempo a las imágenes. Habilitar "todos los aviones". Mueva los objetos al espacio apropiado y haga clic en sello.
  6. Abra la barra de herramientas > Apilar > Crear película. Introduzca la velocidad de fotogramas adecuada y seleccione AVI. Guárdalo como un archivo nuevo.

5. Dibujar un kymograph y detectar rastros con KYMOMAKER

  1. Descargue KYMOMAKER (ver Tabla de Materiales) y abra "Kymoanalysis.exe" en la carpeta KYMOMAKER.
  2. Abra "kymoAnalysis.exe" para mostrar las ventanas principales (Figura 1A). Seleccione Archivo > Cargar y abra la película AVI creada. Aparecerá una ventana de "Vista previa" (Figura 1B).
  3. En la pestaña Generar kymograph > sección de recorte , introduzca los números de píxeles para el recorte. El recorte se refleja inmediatamente en la ventana de "Vista previa" para permitir un fácil ajuste (Figura 1C). Confirme que se han eliminado toda la barra de escala y la marca de tiempo.
  4. Haga clic en el botón Generar para generar el quimógrafo (Figura 1C). KYMOMAKER detecta el píxel más brillante dentro de cada eje Y en la ventana "Vista previa". Guarde el quimógrafo a través de Archivo > Guardar > momógrafo normal.
  5. Para detectar las trazas de baja intensidad en el quimógrafo, haga clic en Momógrafo rotacional. Ajuste el número en la sección "Quimógrafo rotacional" y vea el resultado haciendo clic en el quimógrafo rotacional (Figura 1D).
    NOTA: "Rotación (grado)" es el intervalo del grado para el algoritmo de cuenca hidrográficarotacional 21. Por ejemplo, 10° significa que el algoritmo de cuenca hidrográfica se realiza cada 10° 36 veces, y los resultados se combinan en la ventana "Cuenca hidrográfica rotacional".
  6. Para detectar las trazas anterógradas y retrógradas en el quimógrafo, en la pestaña Detección > sección Objetivo , seleccione original si no se ha generado el Quimógrafo rotacional. Asegúrese de que, al seleccionar Rotación, la cuenca hidrográfica rotacional creada se utilice para detectar seguimientos. Seleccione Cuenca hidrográfica en "Método de detección". Haga clic en el botón Detectar para detectar rastros automáticamente.
    NOTA: Las trazas detectadas se dibujan en la ventana "Trabajando". Al activar "Enmascaramiento", se dibujan trazos en el kymograph original.
  7. Detecte las trazas anterógradas y retrógradas ingresando un número en la sección Detección > filtrado > velocidad (Figura 1E, F). Detecte trazas anterógradas introduciendo de 0,4 a 7,0 μm/s. Detecte trazas retrógradas introduciendo de −0,4 a −7,0 μm/s.
    NOTA: El ajuste de la velocidad más baja depende de la definición de una condición inmóvil de las vesículas. Consulte el paso 6.7.
  8. Guarde los archivos.

6. Determinación de la velocidad

  1. Abra el software MetaMorph.
    NOTA: El complemento de "seguimiento manual" en ImageJ también puede calcular las velocidades de la misma manera.
  2. Abra el archivo creado en el paso 4.4. Asegúrese de que la calibración se adapte a las imágenes.
  3. Abra la barra de herramientas > Aplicaciones > Rastrear puntos. Haga clic en Agregar pista. Encuentre una vesícula móvil que haya sido transportada anterógrada o retrógradamente. A continuación, rastree la vesícula haciendo clic hasta que finalice el transporte. Haga clic en Listo.
  4. Repita el paso 6.3 hasta que se haya realizado un seguimiento de todas las vesículas.
  5. Haga clic en abrir registro para abrir un archivo CSV. A continuación, haga clic en el archivo de registro para mostrar los datos en el archivo CSV.
  6. Guarde el archivo CSV.
  7. Para calcular la velocidad segmentada que no se vea afectada por la pausa, elimine las velocidades calculadas de 0,37 μm/s o menos en la columna "velocidad".
    NOTA: Las vesículas pueden moverse muy rápidamente por difusión anómala, y no son procesadas por las proteínas motoras23. Para evitar incluir estos movimientos en el cálculo de las velocidades impulsadas por el motor, la velocidad más baja (1 píxel/200 ms) de este protocolo se elimina del cálculo.
  8. Calcule la velocidad media segmentada cada cinco fotogramas (un total de 1 s). Descarte la última parte de la velocidad si quedan menos de cinco fotogramas.
  9. Combine todas las velocidades medias de una condición. Genere histogramas para ayudar a visualizar la distribución de las velocidades.

Resultados

Las neuronas primarias cultivadas de la corteza de ratón E15.5 se cultivaron en un plato con fondo de vidrio como se describe. Por ejemplo, APP-EGFP, Alcα-EGFP o Alcβ-EGFP se expresaron en las neuronas corticales primarias. Se sabe que APP y Alcα son transportados en el axón por la kinesina-1 2,17. APP se asocia con la kinesina-1 a través de la proteína adaptadora JIP1 (proteína 1 que interactúa con JNK), mientr...

Discusión

Se describe un método de análisis para el transporte axonal, que incluye el cálculo de la velocidad segmentada y la generación de quimógrafos. Un paso crítico durante la etapa de transfección es mantener la salud de las neuronas cultivadas. El método de transfección descrito por Jiang y Chen29 fue seguido con pequeñas modificaciones. La mezcla suave de la solución de ADN/CaCl2 y 2x HBS aumentó la eficiencia de la transfección al reducir el ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de KAKENHI (22K15270, Grant-in-Aid for Young Scientists) y la Fundación de Ciencias de la Vida Akiyama para YS. Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento al Dr. Masataka Kinjo y al Dr. Akira Kitamura, del Laboratorio de Dinámica de Células Moleculares, Facultad de Ciencias Avanzadas de la Vida de la Universidad de Hokkaido, por proporcionar información crítica y experiencia que ayudaron en gran medida a la investigación. La observación con microscopía TIRF se realizó utilizando el instrumento instalado en el Laboratorio de Dinámica Celular Molecular de la Facultad de Ciencias Avanzadas de la Vida de la Universidad de Hokkaido. El instrumento está registrado en el sistema Open Facility gestionado por el Global Facility Center, Creative Research Institution, Hokkaido University (AP-100138). Agradecemos al Dr. Seiichi Uchida, Laboratorio de Interfaz Humana, Departamento de Tecnología de la Información Avanzada, Facultad de Ciencias de la Información e Ingeniería Eléctrica, Universidad de Kyushu, Fukuoka, Japón, por el montaje con la aplicación Kymomaker. El Laboratorio Avanzado de Prevención e Investigación de la Demencia de la Escuela de Graduados de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Hokkaido cuenta con el apoyo de Japan Medical Leaf co., Ltd.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
5-Fluoro-2-deoxyuridineSigma-AldrichF0503
Apo TIRF 100x/1.49 OILNikon
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo fischer scientific17504044
Bovine serum albuminWako013-25773
CalPhos Mammalian Transfection KitTakara631312
Cell strainer  40 µm NylonFalcon352340
CoolSNAP HQPhotometrics
Deoxyribonuclease ISigma-AldrichDN-25
D-GlucoseWako041-00595
DMEM/Ham’s F-12Wako042-30555
Dumont No. 7 forcepsDumont No.7
Feather surgical blade FeatherNo.11
Feather surgical blade handle FeatherNo. 3
GentamicinWako079-02973
Gentamicin SulfateWako075-04913
GlutaMAX SupplementThermo fischer scientific35050061
HEPESDOJINDO342-01375
Horse Serum, heat inactivatedThermo fischer scientific26050088
KClWako163-03545
KH2PO4Wako169-04245
KYMOMAKERhttp://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL5520
MetaMorph version 6.2r1 Metamorph
Na2HPO4Wako197-02865
NaClWako197-01667
NaHCO3Wako191-01305
Neurobasal MediumThermo fischer scientific21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-ENikon
Nunc Lab-Tek  8 well Chambered CoverglassThermo fischer scientific155411
PapainWorthingtonLS003126
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-AldrichP2636-500MG
Trizma baseMerckT1194-10PAKsolved with water to make 0.1 M Tris-HCl (pH.8.5)

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