تشريح وعزل أنسجة الرئة المنزوعة الخلايا الخاصة بالمنطقة

Summary

يظهر هنا بروتوكول لعزل أنسجة الرئة الخلوية الإقليمية. يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لدراسة التعقيدات في المصفوفة خارج الخلية وتفاعلات مصفوفة الخلية.

Abstract

غالبا ما يكون زرع الرئة هو الخيار الوحيد للمرضى في المراحل المتأخرة من مرض الرئة الحاد ، ولكن هذا محدود بسبب توفير رئتي المتبرع المناسبة والرفض الحاد والمزمن بعد الزرع. يعد التحقق من مناهج الهندسة الحيوية الجديدة لاستبدال الرئتين المريضة أمرا ضروريا لتحسين بقاء المريض على قيد الحياة وتجنب المضاعفات المرتبطة بمنهجيات الزرع الحالية. يتضمن النهج البديل استخدام رئتين كاملتين منزوعتين للخلايا تفتقر إلى المكونات الخلوية التي عادة ما تكون سبب الرفض الحاد والمزمن. نظرا لأن الرئة عضو معقد ، فمن المهم فحص مكونات المصفوفة خارج الخلية لمناطق معينة ، بما في ذلك الأوعية الدموية والممرات الهوائية والأنسجة السنخية. الغرض من هذا النهج هو إنشاء طرق بسيطة وقابلة للتكرار يمكن للباحثين من خلالها تشريح وعزل الأنسجة الخاصة بالمنطقة من الرئتين المنزوع الخلايا بالكامل. تم وضع البروتوكول الحالي لرئتي الخنازير والإنسان ، ولكن يمكن تطبيقه على الأنواع الأخرى أيضا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تحديد أربع مناطق من الأنسجة: مجرى الهواء والأوعية الدموية والحويصلات الهوائية وأنسجة الرئة السائبة. يسمح هذا الإجراء بشراء عينات من الأنسجة التي تمثل بدقة أكبر محتويات أنسجة الرئة منزوعة الخلايا بدلا من طرق التحليل السائبة التقليدية.

Introduction

أمراض الرئة ، بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ، والتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والتليف الكيسي (CF) ، لا تزال حاليا بدون علاج¹،²،^3،4. غالبا ما يكون زرع الرئة هو الخيار الوحيد للمرضى في المراحل اللاحقة ، ولكن هذا يظل خيارا محدودا بسبب توفير رئتي المتبرع المناسبة والرفض الحاد والمزمن بعد الزرع³،^5،6. على هذا النحو ، هناك حاجة ماسة لاستراتيجيات علاج جديدة. أحد الأساليب الواعدة في الهندسة الحيوية التنفسية هو تطبيق السقالات المشتقة من الأنسجة المحضرة من أنسجة الرئة الأصلية منزوعة الخلايا. نظرا لأن سقالات الرئة الكاملة اللاخلوية تحتفظ بالكثير من تعقيد تكوين المصفوفة خارج الخلية الأصلية (ECM) والنشاط الحيوي ، فقد تمت دراستها بشكل مكثف لهندسة الأعضاء الكاملة وكنماذج محسنة لدراسة آليات أمراض الرئة⁷،^8،9،10. في موازاة ذلك ، هناك اهتمام متزايد باستخدام الأنسجة منزوعة الخلايا من أعضاء مختلفة ، بما في ذلك الرئتين ، كهلاميات مائية وركائز أخرى لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM في نماذج زراعة الأنسجة العضوية وغيرها¹¹،12،13،¹⁴،¹⁵،^16،17. توفر هذه النماذج أكثر صلة من الركائز المتاحة تجاريا ، مثل Matrigel ، المشتقة من مصادر الورم. ومع ذلك، فإن المعلومات المتعلقة بالهلاميات المائية المشتقة من الرئة البشرية محدودة نسبيا في الوقت الحاضر. لقد وصفنا سابقا الهلاميات المائية المشتقة من رئتي الخنازير منزوعة الخلايا وميزنا خصائصها الميكانيكية والمادية ، بالإضافة إلى إثبات فائدتها كنماذج لزراعة الخلايا^18,19. قام تقرير حديث بتفصيل التوصيف الميكانيكي واللزج الأولي للهلاميات المائية المشتقة من رئتي الإنسان الطبيعية والمريضة (COPD ، IPF)²⁰. لقد قدمنا أيضا بيانات أولية تميز محتوى الجليكوزامينوجليكان في الرئتين البشرية الطبيعية ومرض الانسداد الرئوي المزمن ، بالإضافة إلى قابليتها للتطبيق لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM¹¹.

توضح هذه الأمثلة قوة استخدام ECMs الرئة البشرية منزوعة الخلايا لأغراض التحقيق. ومع ذلك ، فإن الرئة عضو معقد ، ويختلف كل من الهيكل والوظيفة في مناطق مختلفة من الرئة ، بما في ذلك تكوين ECM وخصائص أخرى مثل الصلابة^21,22. على هذا النحو ، من المهم دراسة ECM في مناطق فردية من الرئة ، بما في ذلك القصبة الهوائية والممرات الهوائية الكبيرة ، والممرات الهوائية متوسطة الحجم والصغيرة ، والحويصلات الهوائية ، وكذلك الأوعية الدموية الكبيرة والمتوسطة الحجم والصغيرة. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لتشريح رئتي الإنسان والخنازير منزوعة الخلايا وبالتالي عزل كل من تلك المناطق التشريحية. وقد سمح ذلك بتحليل تفاضلي مفصل لمحتوى البروتين الإقليمي في كل من الرئتين الطبيعية والمريضة²¹.

Protocol

تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقا ل IACUC بجامعة فيرمونت (UVM). تم الحصول على جميع الرئتين البشرية من خدمات تشريح الجثة UVM وتم إجراء الدراسات ذات الصلة وفقا لإرشادات IRB من UVM.

ملاحظة: تم وصف إزالة الخلايا من رئتي الخنازير والإنسان سابقا من قبل مجموعتنا⁷،⁸،⁹،^10،21. باختصار ، يتم إزالة الخلايا من فصوص الرئة الكاملة من خلال التروية المتسلسلة للممرات الهوائية والأوعية الدموية بسلسلة من محاليل المنظفات والإنزيم سعة 2 لتر باستخدام مضخة تمعجية: 0.1٪ Triton-X 100 ، 2٪ ديوكسي كولات الصوديوم ، 1 M كلوريد الصوديوم ، 30 ميكروغرام / مل DNase / 1.3 mM MgSO 4/2 mM CaCl₂ ، 0.1٪ حمض البيراسيتيك /₄٪ إيثانول ، وغسل ماء منزوع الأيونات. تشمل الطرق القياسية لتأكيد إزالة الخلايا الفعالة تحديد <50 نانوغرام / ملغ من الحمض النووي المزدوج المتبقي داخل الرئتين المنزوع الخلايا وغياب شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ، والتلوين النووي بواسطة تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ^9,21.

1. الإعداد

1. اجمع كل المعدات اللازمة لإجراء التشريح ، بما في ذلك طبق خزفي زجاجي ، وزوجين من الملقط الجراحي ، وزوج واحد من الملقط ، ومقص جراحي ، والأوتوكلاف قبل الاستخدام.
2. احصل على جزء من الرئة ، وضعه في طبق خزفي زجاجي ، وقم بتوجيهه بحيث يمكن رؤية الطرف العلوي من مجرى الهواء بوضوح.
3. حدد الطرف القريب من الأوعية الدموية واحتفظ بها سليمة حتى خطوات لاحقة. يجب أن تكون نهاية الأوعية الدموية مرئية بوضوح ولونها أبيض معتم تماما.
4. باستخدام زوج من الملقط والمقص الجراحي ، قم بإزالة أي غشاء الجنب الذي قد يكون مبطنا للجزء الخارجي من الرئة وتخلص منه.

2. كشف مجرى الهواء

1. باستخدام تقنية الانتشار مع المقص الجراحي ، اعمل برفق على كشف مجرى الهواء الإضافي.
   1. حدد موقع أكبر مجرى هوائي ، والذي يبلغ قطره عادة حوالي 2-4 سم. هناك طريقة أخرى لتحديد مجرى الهواء وهي من خلال مراقبة حلقات الغضاريف ، والتي يمكن اكتشافها بصريا أو عن طريق ملامسة الأنسجة.
   2. باستخدام زوج من الملقط ، قم بجس طول مجرى الهواء من أجل تحديد موقع مجرى الهواء غير المرئي على عمق 1 بوصة تقريبا.
      ملاحظة: كونها مبطنة بحلقات غضروفية ، فإن مجرى الهواء أصعب بشكل مميز من أنسجة الرئة الأخرى. على هذا النحو ، يجب أن يكون العثور على مجرى الهواء غير المرئي وجسه بسيطا نسبيا.
   3. أمسك المقص الجراحي بالتوازي مع مجرى الهواء ، أدخل الأطراف المغلقة في الأنسجة المحيطة مباشرة بمجرى الهواء غير المرئي.
   4. افتح المقص الجراحي ببطء لسحب الغشاء المحيط برفق. بعد ذلك ، قم بإزالة المقص الجراحي وتجنب قطع أي نسيج على الإطلاق.
   5. كرر هذه العملية بشكل متقطع طوال إجراء التسلخ لمواصلة تعريض مجرى الهواء.
2. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقطع مجرى الهواء عند نقاط التفرع وتشريح أي من الفرعين بشكل مستقل.
   ملاحظة: نقطة التفرع هي الموقع الذي ينقسم فيه مجرى هوائي واحد إلى مجاريين هوائيين منفصلين.
3. المناطق المقطوعة من مجرى الهواء بمجرد التأكد من أن النهايات السليمة ستظل قابلة للتحديد ويمكن تحديد موقعها بسهولة لمزيد من التشريح.
4. ضع المناطق المقطوعة من مجرى الهواء في الأنبوب المقابل. يختلف حجم المناطق المقطوعة اعتمادا على العينة ، ولكن بشكل عام ، سيتراوح طولها بين 1-5 سم. يختلف العرض بناء على الموقع النسبي على طول شجرة مجرى الهواء ، مع احتفاظ المناطق البعيدة بعرض أصغر من المناطق القريبة.

3. تعريض واستئصال مناطق الأوعية الدموية

1. ضع ضغطا لطيفا على الأوعية الدموية وابتعد ببطء عن مجرى الهواء. اسمح للأوعية الدموية بالتمدد قليلا واستخدم المقص الجراحي لفصل الأوعية الدموية عن مجرى الهواء.
   ملاحظة: الكثير من الضغط سوف يمزق الأوعية الدموية. إذا تمزق الوعاء، فما عليك سوى وضع هذا الجزء من الأوعية الدموية في الأنبوب المسمى المقابل وتحديد نهايته السليمة.
2. عندما يتم الكشف عن نقطة متفرعة في شجرة الأوعية الدموية ، استخدم المقص الجراحي والملاقط لفضح المزيد من المناطق السفلية من الأوعية الدموية.
   1. ابدأ بإدخال الأطراف المغلقة للمقص الجراحي أسفل نقطة التفرع مباشرة وبين منطقتي الأوعية الدموية المقابلتين.
   2. افتح المقص ببطء لنشر الأنسجة الكامنة.
   3. بشكل متقطع ، استخدم زوجا من الملقط لإزالة الأنسجة التي انتشرت باستخدام المقص الجراحي ، وكذلك أي نسيج آخر يحيط مباشرة بالأوعية الدموية.
3. عندما تغطي الأوعية الدموية مناطق مجرى الهواء أو تصبح مرهقة لأي خطوة في إجراء التشريح ، قم بقطع الأوعية الدموية عند نقطة متفرعة وقم بتشريح أي من الفرعين بشكل مستقل.
4. المناطق المقطوعة من الأوعية الدموية بمجرد التأكد من أن النهايات السليمة ستظل قابلة للتحديد ويمكن تحديد موقعها بسهولة لمزيد من التشريح.

4. تحديد واستئصال الأنسجة السنخية

1. باستخدام زوج من الملقط أو الملقط ، قرصة ثم تمزيق مناطق صغيرة من الأنسجة السنخية برفق.
   1. حدد موقع منطقة الأنسجة التي ليست في المنطقة المجاورة مباشرة لمجرى الهواء أو الأوعية الدموية.
   2. باستخدام الملقط ، قرصة منطقة صغيرة من الأنسجة التي تبدو خالية من أي الأوعية الدموية أو مجرى الهواء.
   3. تمزيق المنطقة مقروص من الأنسجة من الرئة.
2. راقب منطقة الأنسجة التي تمت إزالتها وتأكد مما إذا كانت الأنسجة السنخية أم لا.
   ملاحظة: الأنسجة السنخية موجودة في جميع أنحاء الرئة ، لذلك يمكن ويجب إزالتها طوال عملية التشريح. يجب تصنيف أي نسيج لا يمكن تحديده بسهولة على أنه الحويصلات الهوائية أو الأوعية الدموية أو مجرى الهواء بشكل أساسي على أنه نسيج سائب ووضعه في الأنبوب المسمى المقابل.

النتائج

يوضح الشكل 1 مخططا عاما للبروتوكول. بمجرد إتقانها ، يمكن بسهولة استنساخ التشريح الإقليمي لأنسجة الرئة منزوعة الخلايا. يعد تحديد تصنيف كل عينة من الأنسجة المقطوعة أمرا ضروريا لنجاح إجراء التشريح. الأنسجة الوعائية أكثر مرونة بكثير من مجرى الهواء ، لذا فإن استخدام الملقط لتم...

Discussion

كثيرا ما تستخدم الأنسجة المنزوعة الخلايا من البشر والأنواع الأخرى كمواد حيوية لدراسة تكوين ECM وكذلك تفاعلات الخلايا ECM في نماذج الاستزراع خارج الجسم الحي ، بما في ذلك الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد^12،13. على غرار الأعضاء الأخرى ، تم استخدام الرئتين من...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10