Bölgeye Özgü Desellülarize Akciğer Dokusunun Diseksiyonu ve İzolasyonu

Özet

Burada bölgesel desellülarize akciğer dokusunun izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, hücre dışı matris ve hücre-matris etkileşimlerindeki karmaşıklıkları incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Özet

Akciğer transplantasyonu, şiddetli akciğer hastalığının sonraki aşamalarındaki hastalar için genellikle tek seçenektir, ancak bu hem uygun donör akciğerlerin beslenmesi hem de transplantasyon sonrası hem akut hem de kronik rejeksiyon nedeniyle sınırlıdır. Hastalıklı akciğerlerin replasmanı için yeni biyomühendislik yaklaşımlarının belirlenmesi, hasta sağkalımını iyileştirmek ve mevcut transplantasyon metodolojileriyle ilişkili komplikasyonlardan kaçınmak için zorunludur. Alternatif bir yaklaşım, tipik olarak akut ve kronik rejeksiyonun nedeni olan hücresel bileşenlerden yoksun desellülarize tüm akciğerlerin kullanımını içerir. Akciğer çok karmaşık bir organ olduğundan, vaskülatür, hava yolları ve alveoler doku dahil olmak üzere belirli bölgelerin hücre dışı matriks bileşenlerini incelemek ilgi çekicidir. Bu yaklaşımın amacı, araştırmacıların bölgeye özgü dokuyu tamamen desellülarize akciğerlerden diseke edebilecekleri ve izole edebilecekleri basit ve tekrarlanabilir yöntemler oluşturmaktır. Mevcut protokol domuz ve insan akciğerleri için tasarlanmıştır, ancak diğer türlere de uygulanabilir. Bu protokol için dokunun dört bölgesi belirlendi: hava yolu, vaskülatür, alveoller ve toplu akciğer dokusu. Bu prosedür, geleneksel toplu analiz yöntemlerinin aksine, desellülarize akciğer dokusunun içeriğini daha doğru bir şekilde temsil eden doku örneklerinin elde edilmesini sağlar.

Giriş

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), idiyopatik pulmoner fibroz (İPF) ve kistik fibroz (KF) dahil olmak üzere akciğer hastalıkları şu anda kürsüz^kalmaktadır 1,2,3,4. Akciğer transplantasyonu genellikle daha sonraki aşamalardaki hastalar için tek seçenektir, ancak bu hem uygun donör akciğerlerin temini hem de transplantasyon sonrası hem akut hem de kronik rejeksiyon nedeniyle sınırlı bir seçenek olmaya devam etmektedir ^3,5,6. Bu nedenle, yeni tedavi stratejilerine kritik bir ihtiyaç vardır. Solunum biyomühendisliğinde umut verici bir yaklaşım, desellülarize edilmiş doğal akciğer dokusundan hazırlanan doku kaynaklı iskelelerin uygulanmasıdır. Asellüler bütün akciğer iskeleleri, doğal hücre dışı matris (ECM) kompozisyonunun ve biyoaktivitesinin karmaşıklığının çoğunu koruduğundan, tüm organ mühendisliği için ve akciğer hastalığı mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiş modeller olarak yoğun bir şekilde çalışılmıştır 7,8,9,10. Buna paralel olarak, organoid ve diğer doku kültürü modellerinde hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için hidrojeller ve diğer substratlar olarak akciğerler de dahil olmak üzere farklı organlardan desellülarize dokuların kullanılmasına yönelik artan ilgi vardır 11,12,13,14,15,16,17. Bunlar, tümör kaynaklarından türetilen Matrigel gibi ticari olarak temin edilebilen substratlardan daha alakalı modeller sağlar. Bununla birlikte, insan akciğer kaynaklı hidrojeller hakkındaki bilgiler şu anda nispeten sınırlıdır. Daha önce desellülarize domuz akciğerlerinden elde edilen hidrojelleri tanımladık ve hem mekanik hem de malzeme özelliklerini karakterize ettik ve hücre kültürü modelleri olarak faydalarını gösterdik^18,19. Yakın tarihli bir raporda, desellülarize normal ve hastalıklı (KOAH, İPF) insan akciğerlerinden türetilen hidrojellerin başlangıçtaki mekanik ve viskoelastik karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır²⁰. Ayrıca, desellülarize normal ve KOAH insan akciğerlerinin glikozaminoglikan içeriğini karakterize eden ilk verileri ve bunların hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için uygulanabilirliklerini sunduk¹¹.

Bu örnekler, desellülarize insan akciğer ECM'lerinin araştırma amaçlı kullanılmasının gücünü göstermektedir. Bununla birlikte, akciğer karmaşık bir organdır ve hem yapı hem de fonksiyon, ECM bileşimi ve sertlik^21,22 gibi diğer özellikler de dahil olmak üzere akciğerin farklı bölgelerinde değişir. Bu nedenle, ECM'yi trakea ve büyük hava yolları, orta ve küçük hava yolları ve alveollerin yanı sıra büyük, orta büyüklükte ve küçük kan damarları da dahil olmak üzere akciğerin bireysel bölgelerinde incelemek ilgi çekicidir. Bu amaçla, desellülarize insan ve domuz akciğerlerini diseksiyon etmek ve daha sonra bu anatomik bölgelerin her birini izole etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Bu, hem normal hem de hastalıklı akciğerlerde bölgesel protein içeriğinin ayrıntılı diferansiyel analizine izin vermiştir²¹.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Vermont Üniversitesi IACUC'ye (UVM) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm insan akciğerleri UVM Otopsi Servislerinden edinilmiş ve ilgili çalışmalar UVM IRB kılavuzlarına göre yapılmıştır.

NOT: Domuz ve insan akciğerlerinin desellülarizasyonu daha önce grubumuz 7,8,9,10,21 tarafından tanımlanmıştır. Kısacası, tüm akciğer lobları, peristaltik bir pompa kullanılarak bir dizi 2 L deterjan ve enzim çözeltisi ile hava yollarının ve vaskülatürün sıralı perfüzyonu yoluyla desellülarize edilir:% 0.1 Triton-X 100,% 2 sodyum deoksikolat, 1 M sodyum klorür, 30 μg / mL DNaz / 1.3 mM MgSO 4/2 mM CaCl₂,% 0.1 perasetik asit /%₄ etanol, ve deiyonize su yıkama. Etkili desellülarizasyonu doğrulamak için standart yöntemler, desellülarize akciğerlerde <50 ng / mg kalıntı çift sarmallı DNA'nın belirlenmesini ve jel elektroforezi ile DNA fragmanlarının bulunmamasını ve hematoksilin ve eozin (H &E) boyaması ile nükleer boyamayı içerir ^9,21.

1. Kurulum

1. Bir cam güveç kabı, iki çift cerrahi cımbız, bir çift forseps ve bir çift cerrahi makas ve otoklav dahil olmak üzere diseksiyon prosedürü için gerekli tüm ekipmanları kullanmadan önce toplayın.
2. Akciğerin bir bölümünü alın, cam güveç kabına yerleştirin ve hava yolunun üst ucunun net bir şekilde görülebilmesi için yönlendirin.
3. Vaskülatürün proksimal ucunu tanımlayın ve sonraki adımlara kadar bozulmadan tutun. Vaskülatürün ucu açıkça görülebilmeli ve tamamen opak beyaz renkte olmalıdır.
4. Bir çift cımbız ve cerrahi makas kullanarak, akciğerin dışını kaplayan herhangi bir plevrayı çıkarın ve atın.

2. Hava yolunun açığa çıkarılması

1. Cerrahi makasla bir yayılma tekniği kullanarak, ek hava yolunu ortaya çıkarmak için yavaşça çalışın.
   1. Tipik olarak yaklaşık 2-4 cm çapa sahip olacak en büyük hava yolunu bulun. Bir hava yolunu tanımlamanın bir başka yolu, görsel olarak veya dokunun palpasyonu yoluyla tespit edilebilen kıkırdak halkalarının gözlemlenmesidir.
   2. Bir çift forseps kullanarak, görünmeyen hava yolunun yerini yaklaşık 1 inç derinliğe kadar belirlemek için hava yolunun uzunluğunu palpe edin.
      NOT: Kıkırdak halkaları ile kaplı olan hava yolu, karakteristik olarak diğer akciğer dokularından daha serttir. Bu nedenle, görünmeyen hava yolunu bulmak ve palpe etmek nispeten basit olmalıdır.
   3. Cerrahi makası hava yoluna paralel tutarak, kapalı uçları görünmeyen hava yolunu doğrudan çevreleyen dokuya yerleştirin.
   4. Çevreleyen zarı yavaşça ayırmak için cerrahi makası yavaşça açın. Daha sonra, cerrahi makası çıkarın ve herhangi bir dokuyu kesmekten kaçının.
   5. Hava yolunu açığa çıkarmaya devam etmek için diseksiyon prosedürü boyunca bu işlemi aralıklı olarak tekrarlayın.
2. Cerrahi makası kullanarak, hava yolunu dallanma noktalarında kesin ve her iki dal boyunca bağımsız olarak diseke edin.
   NOT: Dallanma noktası, bir hava yolunun iki ayrı hava yoluna bölündüğü bir konumdur.
3. Hava yolunun kopuk bölgeleri bir zamanlar sağlam uçların tanımlanabilir kalacağından ve daha fazla diseksiyon için kolayca yerleştirileceğinden emin olurlar.
4. Hava yolunun kopmuş bölgelerini ilgili tüpe yerleştirin. Kopan bölgelerin büyüklüğü numuneye bağlı olarak değişecektir, ancak genel olarak uzunluğu 1-5 cm arasında değişecektir. Genişlik, hava yolu ağacı boyunca göreceli konuma bağlı olarak değişir, distal bölgeler daha proksimal bölgelerden daha küçük genişlikleri korur.

3. Vaskülatür bölgelerinin açığa çıkarılması ve çıkarılması

1. Vaskülatüre hafif basınç uygulayın ve yavaşça hava yolundan uzaklaşın. Vaskülatürün hafifçe gerilmesine izin verin ve vaskülatürü hava yolundan daha da ayırmak için cerrahi makas kullanın.
   NOT: Çok fazla basınç vaskülatürü yırtacaktır. Vaskülatür yırtılırsa, vaskülatürün bu bölümünü ilgili etiketli tüpe yerleştirin ve sağlam ucunu tanımlayın.
2. Vasküler ağaçta bir dallanma noktası ortaya çıktığında, vaskülatürdeki daha aşağı bölgeleri ortaya çıkarmak için cerrahi makas ve cımbız kullanın.
   1. Cerrahi makasın kapalı uçlarını bir dallanma noktasının hemen altına ve karşılık gelen iki vaskülatür bölgesi arasına yerleştirerek başlayın.
   2. Altta yatan dokuları ayırmak için makası yavaşça açın.
   3. Aralıklı olarak, cerrahi makas kullanılarak birbirinden ayrılan dokuyu ve ayrıca vaskülatürü doğrudan çevreleyen diğer dokuları çıkarmak için bir çift cımbız kullanın.
3. Vaskülatür hava yolunun bölgelerini kapladığında veya diseksiyon prosedüründeki herhangi bir adım için hantal hale geldiğinde, vaskülatürü bir dallanma noktasında kesin ve her iki dal boyunca bağımsız olarak diseke edin.
4. Vaskülatürün şiddetli bölgeleri bir zamanlar sağlam uçların tanımlanabilir kalacağından ve daha fazla diseksiyon için kolayca yerleştirileceğinden emin olurlar.

4. Alveoler dokunun tanımlanması ve çıkarılması

1. Bir çift forseps veya cımbız kullanarak, alveolar dokunun küçük bölgelerini sıkıştırın ve sonra yavaşça yırtın.
   1. Hava yolunun veya vaskülatür doğrudan yakınında olmayan bir doku bölgesi bulun.
   2. Cımbızları kullanarak, dokunun herhangi bir vaskülatür veya hava yolundan yoksun görünen küçük bir bölgesini sıkıştırın.
   3. Dokunun sıkışmış bölgesini akciğerden yırtın.
2. Çıkarılan doku bölgesini gözlemleyin ve alveoler doku olup olmadığını doğrulayın.
   NOT: Alveoler doku akciğer boyunca mevcuttur, bu nedenle diseksiyon prosedürü boyunca çıkarılabilir ve çıkarılmalıdır. Öncelikle alveoller, vaskülatür veya hava yolu olarak kolayca tanımlanamayan herhangi bir doku, dökme doku olarak kategorize edilmeli ve ilgili etiketli tüpe yerleştirilmelidir.

Sonuçlar

Protokolün genel bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, desellülarize akciğer dokusunun bölgesel diseksiyonu kolayca tekrarlanabilir. Her kopan doku örneğinin kategorizasyonunun belirlenmesi, diseksiyon prosedürünün başarısı için zorunludur. Vasküler doku hava yolundan önemli ölçüde daha elastiktir, bu nedenle dokuyu germek için forseps kullanmak genellikle belirli bir numunenin vaskülatür veya hava yolu olup olmadığının güçlü bi...

Tartışmalar

İnsanlardan ve diğer türlerden alınan desellülarize dokular, ECM kompozisyonunu incelemek için biyomateryal olarak sıklıkla kullanılır ve 3D hidrojeller^12,13 dahil olmak üzere ex vivo kültür modellerinde hücre-ECM etkileşimlerini inceler. Diğer organlara benzer şekilde, desellülarize akciğerler daha önce sağlıklı ve hastalıklı (yani amfizematöz ve İPF) akciğerlerde ECM kompozisyon farklılıklarını belirlemek için kullanıl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10