Dissection et isolement de tissu pulmonaire décellularisé spécifique à une région

Résumé

Un protocole pour l’isolement du tissu pulmonaire décellularisé régional est présenté ici. Ce protocole fournit un outil puissant pour étudier les complexités de la matrice extracellulaire et des interactions cellule-matrice.

Résumé

La transplantation pulmonaire est souvent la seule option pour les patients aux derniers stades d’une maladie pulmonaire grave, mais elle est limitée à la fois en raison de l’approvisionnement en poumons de donneurs appropriés et du rejet aigu et chronique après la transplantation. Il est impératif de déterminer de nouvelles approches de bio-ingénierie pour le remplacement des poumons malades afin d’améliorer la survie des patients et d’éviter les complications associées aux méthodologies actuelles de transplantation. Une approche alternative implique l’utilisation de poumons entiers décellularisés dépourvus de constituants cellulaires qui sont généralement la cause du rejet aigu et chronique. Étant donné que le poumon est un organe si complexe, il est intéressant d’examiner les composants de la matrice extracellulaire de régions spécifiques, y compris le système vasculaire, les voies respiratoires et le tissu alvéolaire. Le but de cette approche est d’établir des méthodes simples et reproductibles par lesquelles les chercheurs peuvent disséquer et isoler des tissus spécifiques à une région à partir de poumons entièrement décellularisés. Le protocole actuel a été conçu pour les poumons de porc et d’homme, mais peut également être appliqué à d’autres espèces. Pour ce protocole, quatre régions du tissu ont été spécifiées: les voies respiratoires, le système vasculaire, les alvéoles et le tissu pulmonaire en vrac. Cette procédure permet d’obtenir des échantillons de tissus qui représentent plus précisément le contenu du tissu pulmonaire décellularisé par opposition aux méthodes traditionnelles d’analyse en vrac.

Introduction

Les maladies pulmonaires, y compris la bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC), la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) et la fibrose kystique (FK), demeurent actuellement sans remède 1,2,3,4. La transplantation pulmonaire est souvent la seule option pour les patients à un stade avancé, mais cela reste une option limitée à la fois en raison de l’approvisionnement en poumons de donneurs appropriés et du rejet aigu et chronique après la transplantation ^3,5,6. En tant que tel, il existe un besoin critique de nouvelles stratégies de traitement. Une approche prometteuse en bio-ingénierie respiratoire est l’application d’échafaudages dérivés de tissus préparés à partir de tissus pulmonaires natifs décellularisés. Comme les échafaudages pulmonaires entiers acellulaires conservent une grande partie de la complexité de la composition et de la bioactivité de la matrice extracellulaire native (ECM), ils ont été étudiés de manière intensive pour l’ingénierie des organes entiers et comme modèles améliorés pour étudier les mécanismes des maladies pulmonaires 7,8,9,10. Parallèlement, on s’intéresse de plus en plus à l’utilisation de tissus décellularisés provenant de différents organes, y compris les poumons, comme hydrogels et autres substrats pour étudier les interactions cellule-cellule et cellule-ECM dans les modèles organoïdes et autres modèles de culture tissulaire 11,12,13,14,15,16,17 . Ceux-ci fournissent des modèles plus pertinents que les substrats disponibles dans le commerce, tels que Matrigel, dérivés de sources tumorales. Cependant, les informations sur les hydrogels d’origine pulmonaire humaine sont relativement limitées à l’heure actuelle. Nous avons déjà décrit des hydrogels dérivés de poumons de porcs décellularisés et avons caractérisé à la fois leurs propriétés mécaniques et matérielles, ainsi que démontré leur utilité en tant que modèles de culture cellulaire^18,19. Un rapport récent a détaillé la caractérisation mécanique et viscoélastique initiale des hydrogels dérivés de poumons humains normaux et malades décellularisés (BPCO, FPI)²⁰. Nous avons également présenté des données initiales caractérisant la teneur en glycosaminoglycanes des poumons humains normaux et des BPCO décellularisés, ainsi que leur applicabilité pour étudier les interactions cellule-cellule et cellule-ECM¹¹.

Ces exemples illustrent la puissance de l’utilisation d’ECM pulmonaires humains décellularisés à des fins d’investigation. Cependant, le poumon est un organe complexe, et la structure et la fonction varient dans différentes régions du poumon, y compris la composition ECM et d’autres propriétés telles que la rigidité^21,22. En tant que tel, il est intéressant d’étudier l’ECM dans des régions individuelles du poumon, y compris la trachée et les grandes voies respiratoires, les voies respiratoires de taille moyenne et petite, et les alvéoles, ainsi que les grands, moyens et petits vaisseaux sanguins. À cette fin, nous avons développé une méthode fiable et reproductible pour disséquer les poumons humains et porcins décellularisés et isoler ensuite chacune de ces régions anatomiques. Cela a permis une analyse différentielle détaillée de la teneur en protéines régionales dans les poumons normaux et malades²¹.

Protocole

Toutes les études animales ont été réalisées conformément à l’IACUC de l’Université du Vermont (UVM). Tous les poumons humains ont été acquis auprès des services d’autopsie UVM et des études connexes ont été réalisées conformément aux directives de l’IRB de l’UVM.

NOTE: La décellularisation des poumons de porc et humain a déjà été décrite par notre groupe 7,8,9,10,21. En bref, les lobes pulmonaires entiers sont décellularisés par perfusion séquentielle des voies respiratoires et du système vasculaire avec une série de solutions détergentes et enzymatiques de 2 L à l’aide d’une pompe péristaltique : 0,1% Triton-X 100, désoxycholate de sodium 2%, chlorure de sodium 1 M, 30 μg/mL DNase/1,3 mM MgSO₄/2 mM CaCl2, acide peracétique 0,1%/éthanol 4%, et un lavage à l’eau désionisée. Les méthodes standard pour confirmer une décellularisation efficace comprennent la détermination de <50 ng / mg d’ADN double brin résiduel dans les poumons décellularisés et l’absence de fragments d’ADN par électrophorèse sur gel, et la coloration nucléaire par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) ^9,21.

1. Configuration

1. Rassemblez tout l’équipement nécessaire à la procédure de dissection, y compris une cocotte en verre, deux paires de pinces chirurgicales, une paire de pinces et une paire de ciseaux chirurgicaux, ainsi qu’un autoclave avant utilisation.
2. Procurez-vous une section du poumon, placez-la dans la cocotte en verre et orientez-la de manière à ce que l’extrémité supérieure des voies respiratoires puisse être vue clairement.
3. Identifiez l’extrémité proximale du système vasculaire et gardez-la intacte jusqu’aux étapes ultérieures. L’extrémité du système vasculaire doit être clairement visible et de couleur blanche entièrement opaque.
4. À l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux chirurgicaux, retirez toute plèvre qui pourrait tapisser l’extérieur du poumon et jetez-la.

2. Exposition des voies respiratoires

1. À l’aide d’une technique d’étalement avec les ciseaux chirurgicaux, travaillez doucement pour exposer les voies respiratoires supplémentaires.
   1. Localisez la plus grande voie respiratoire, qui aura généralement un diamètre d’environ 2 à 4 cm. Une autre façon d’identifier une voie respiratoire consiste à observer des anneaux cartilagineux, qui peuvent être détectés visuellement ou par palpation du tissu.
   2. À l’aide d’une paire de pinces, palper le long des voies respiratoires afin de déterminer l’emplacement des voies respiratoires invisibles à une profondeur d’environ 1 po.
      REMARQUE: Étant tapissée d’anneaux cartilagineux, les voies respiratoires sont généralement plus dures que les autres tissus pulmonaires. En tant que tel, trouver et palper les voies respiratoires invisibles devrait être relativement simple.
   3. En tenant les ciseaux chirurgicaux parallèles aux voies respiratoires, insérez les extrémités fermées dans le tissu entourant directement les voies respiratoires invisibles.
   4. Ouvrez lentement les ciseaux chirurgicaux pour séparer doucement la membrane environnante. Par la suite, retirez les ciseaux chirurgicaux et évitez de couper quelque tissu que ce soit.
   5. Répétez ce processus par intermittence tout au long de la procédure de dissection pour continuer à exposer les voies respiratoires.
2. À l’aide des ciseaux chirurgicaux, coupez les voies respiratoires aux points de ramification et disséquez indépendamment l’une ou l’autre branche.
   REMARQUE : Un embranchement est un endroit où une voie aérienne se divise en deux voies respiratoires distinctes.
3. Sectionner les régions des voies respiratoires une fois confiant que les extrémités intactes resteront identifiables et facilement localisées pour une dissection ultérieure.
4. Placez les régions sectionnées des voies respiratoires dans le tube correspondant. La taille des régions sectionnées varie selon l’échantillon mais, en général, varie entre 1 et 5 cm de longueur. La largeur varie en fonction de l’emplacement relatif le long de l’arbre des voies respiratoires, les régions distales conservant des largeurs plus petites que les régions plus proximales.

3. Exposer et exciser les régions du système vasculaire

1. Appliquez une légère pression sur le système vasculaire et éloignez-vous lentement des voies respiratoires. Laissez le système vasculaire s’étirer légèrement et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour séparer davantage le système vasculaire des voies respiratoires.
   NOTE: Trop de pression déchirera le système vasculaire. Si le système vasculaire se déchire, placez simplement cette section du système vasculaire dans le tube étiqueté correspondant et identifiez son extrémité intacte.
2. Lorsqu’un point de ramification de l’arbre vasculaire a été exposé, utilisez des ciseaux chirurgicaux et une pince à épiler pour exposer des régions plus inférieures du système vasculaire.
   1. Commencez par insérer les extrémités fermées des ciseaux chirurgicaux juste en dessous d’un point de ramification et entre les deux régions vasculaires correspondantes.
   2. Ouvrez lentement les ciseaux pour écarter les tissus sous-jacents.
   3. Par intermittence, utilisez une pince à épiler pour enlever le tissu qui a été écarté à l’aide des ciseaux chirurgicaux, ainsi que tout autre tissu entourant directement le système vasculaire.
3. Lorsque le système vasculaire couvre des régions des voies respiratoires ou devient encombrant à n’importe quelle étape de la procédure de dissection, coupez le système vasculaire à un point de ramification et disséquez davantage le long de l’une ou l’autre branche indépendamment.
4. Séparer les régions du système vasculaire une fois confiant que les extrémités intactes resteront identifiables et facilement localisées pour une dissection ultérieure.

4. Identification et excision du tissu alvéolaire

1. À l’aide d’une paire de pinces ou d’une pince à épiler, pincez puis arrachez doucement de petites régions de tissu alvéolaire.
   1. Localisez une région de tissu qui n’est pas à proximité directe des voies respiratoires ou du système vasculaire.
   2. À l’aide de la pince à épiler, pincez une petite région du tissu qui semble être dépourvue de tout système vasculaire ou des voies respiratoires.
   3. Déchirez la région pincée du tissu du poumon.
2. Observez la région du tissu prélevé et confirmez s’il s’agit ou non de tissu alvéolaire.
   REMARQUE: Le tissu alvéolaire est présent dans tout le poumon, de sorte qu’il peut et doit être enlevé tout au long de la procédure de dissection. Tout tissu qui ne peut pas être facilement identifié comme étant principalement des alvéoles, des systèmes vasculaires ou des voies respiratoires doit être classé comme tissu en vrac et placé dans le tube marqué correspondant.

Résultats

Un schéma général du protocole est illustré à la figure 1. Une fois maîtrisée, la dissection régionale du tissu pulmonaire décellularisé est facilement reproductible. La détermination de la catégorisation de chaque échantillon de tissu sectionné est impérative pour le succès de la procédure de dissection. Le tissu vasculaire est beaucoup plus élastique que les voies respiratoires, de sorte que l’utilisation de forceps pour étirer le tissu est souvent un indicateur fort d...

Discussion

Les tissus décellularisés provenant d’humains et d’autres espèces sont fréquemment utilisés comme biomatériaux pour étudier la composition de la MEC ainsi que les interactions cellule-MCE dans des modèles de culture ex vivo, y compris les hydrogels 3D^12,13. À l’instar d’autres organes, les poumons décellularisés ont déjà été utilisés pour déterminer les différences de composition de la MCE dans les poumons sains par rapport aux ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10