JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

هنا ، يتم وصف طريقة كروماتوغرافيا غاز الرأس - قياس الطيف الكتلي الرباعي الترادفي (HS-GC-MS / MS) المناسبة لتحديد ثلاثي ميثيل أمين (TMA) في الأدوية المشتقة من الحيوانات. يتضمن البروتوكول المعالجة المسبقة للعينات، ومعالجة فراغ الرأس، وظروف التحليل، والتحقق المنهجي، وتحديد التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) في الأدوية المشتقة من الحيوانات.

Abstract

الأدوية المشتقة من الحيوانات لها خصائص مميزة وتأثيرات علاجية كبيرة ، ولكن معظمها له رائحة مريبة واضحة ، مما يؤدي إلى ضعف امتثال المرضى السريريين. ثلاثي ميثيل أمين (TMA) هو أحد مكونات الرائحة السمكية الرئيسية في الطب المشتق من الحيوانات. من الصعب تحديد التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) بدقة باستخدام طريقة الكشف الحالية بسبب الضغط المتزايد في قارورة فراغ الرأس الناجم عن التفاعل السريع للحمض القاعدي بعد إضافة الغسول، مما يؤدي إلى هروب التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) من قارورة فراغ الرأس، مما يوقف التقدم البحثي للرائحة السمكية للطب المشتق من الحيوانات. في هذه الدراسة ، اقترحنا طريقة كشف خاضعة للرقابة أدخلت طبقة البارافين كطبقة عزل بين الحمض والغسول. يمكن التحكم في معدل إنتاج التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) بشكل فعال عن طريق تسييل طبقة البارافين ببطء من خلال تسخين الفرن الثرموستاتي. أظهرت هذه الطريقة خطية مرضية ، وتجارب دقيقة ، وعمليات استرداد مع قابلية استنساخ جيدة وحساسية عالية. وقدمت الدعم التقني لإزالة الروائح الكريهة من الأدوية المشتقة من الحيوانات.

Introduction

يحظى علاج الأمراض البشرية باستخدام المنتجات المشتقة من أجزاء الحيوانات و / أو منتجاتها الثانوية (المشار إليها هنا باسم الأدوية المشتقة من الحيوانات) باهتمام متزايد. يلعبون دورا مهما في علاج السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وتليف الكبد والتهاب الضرع وأمراض أخرى ، مع مزايا التأثير القوي والجرعة الصغيرة والفعالية السريرية الهامة والمحددة. ومع ذلك ، فإن الأدوية المشتقة من الحيوانات لها عموما رائحة سمكية بارزة ، مما يؤثر بشكل كبير على امتثال المرضى ، وهي غير مواتية بشكل خاص للأطفال 1,2. تأتي الرائحة السمكية بشكل أساسي من البروتينات والأحماض الأمينية والدهون والمواد الأخرى الموجودة في الدواء ، والتي تتحلل من خلال أكسدة الأحماض الدهنية وتدهور الأحماض الأمينية وطرق أخرى لإنتاج مجموعة متنوعة من المواد ذات الرائحة السمكية2،3،4. من بينها ، ثلاثي ميثيل أمين (TMA) هو غاز متطاير ذو رائحة مريبة موجودة على نطاق واسع في الأطعمة المشتقة من الحيوانات المتعفنةأو الفاسدة 5.

حتى الآن، يشيع استخدام كروماتوغرافيا الغاز (GC)، والكروماتوغرافيا السائلة (LC)، والكروماتوغرافيا الأيونية، والقياس الطيفي، وقياس الطيف اللوني السائل - قياس الطيف الكتلي (LC-MS)، وطرق الاستشعار للكشف عن التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) في البيئة والغذاء والبول6،7،8،9. نظرا للتلوث المنخفض لعمود GC ونظام الحقن ، فضلا عن الحساسية العالية ، وقابلية التكاثر ، وحد الكشف المنخفض (0.1-1 مجم / كجم) ، تم تفضيل طريقة كروماتوغرافيا الغاز الرأسي - قياس الطيف الكتلي (HS-GC-MS) للتحليل الغذائيوالبيولوجي 8. في الوقت الحاضر ، وضعت الصين فقط معيارا وطنيا ل TMA في الغذاء ، و HS-GC-MS هي الطريقة الأولى في معيار GB5009.179-201610. لذلك ، تم اختيار طريقة HS-GC-MS المذكورة أعلاه للكشف عن TMA في الطب المشتق من الحيوانات. في المرحلة المبكرة ، وجدت مجموعتنا البحثية أن معيار الكشف HS-GC-MS ل TMA في الغذاء يمكن أن يكتشف الرائحة السمكية في العديد من الأدوية المشتقة من الحيوانات. بالاقتران مع نتائج الدراسات11،12 ، يمكن إثبات أن TMA هي المادة الرئيسية الشائعة للرائحة السمكية في الأدوية المشتقة من الحيوانات. ومع ذلك ، فقد وجد أن استنساخ النتائج التجريبية كان ضعيفا ، وكانت هناك مشاكل مثل هروب TMA وضعف الاستقرار ، والتي لا يمكن التحقق منها من خلال المنهجية. قد يكون هذا بسبب حقيقة أن الغسول قد تم حقنه في قارورة فراغ الرأس وأدى التفاعل السريع للحمض القاعدي إلى زيادة الضغط في القارورة ، وبالتالي هرب TMA من مسام الحقن ، مما منع الكشف المستقر والدقيق عن TMA. لذلك ، اقترحت هذه الدراسة طريقة محسنة للكشف عن كروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأسي - قياس الطيف الكتلي الرباعي الترادفي (HS-GC-MS / MS) لمعالجة هذه المشاكل.

يعمل البروتوكول على تحسين المعالجة المسبقة للعينة عن طريق فصل المواد المتفاعلة الحمضية القاعدية في المعالجة المسبقة بمساعدة البارافين الصلب ، وهو مادة جيدة لتغيير الطور الصلب والسائل. نظرا لأن البارافين يسيل ببطء مع ارتفاع درجة حرارة الفرن الثرموستاتي ، فقد تم أيضا إطلاق TMA ببطء في قارورة فراغ الرأس المختومة ، وتجنب زيادة الضغط الناتجة عن التفاعل العنيف والسريع للحمض القاعدي وضمان اكتشاف TMA بشكل مستقر ودقيق. علاوة على ذلك ، فإن حقن مساحة الرأس جنبا إلى جنب مع أوضاع مراقبة التفاعل المتعدد (MRM)) في GC-MS / MS قمع بشكل فعال التداخل الكيميائي للمصفوفة وضمان موثوقية النتائج. أثبتت نتائج التحقق المنهجي أن الخطية واختبار الدقة ومعدل الاسترداد لطريقة الكشف المحسنة يمكن أن تلبي المتطلبات ، مع قابلية استنساخ جيدة وحساسية عالية.

Protocol

انظر الجدول 1 للحصول على معلومات حول المواد الطبية لفيرتيما وبيريبلانيتا أمريكانا وهيرودو. تم التعرف عليها من قبل البروفيسور شو رونتشون ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، على أنها أجسام مجففة من Pheretima aspergillum (E.Perrier) و Periplaneta americana L. و Whitmania pigra Whitman.

1. استخراج العينات

  1. سحق Pheretima و Periplaneta americana و Hirudo بمطحنة عشبية (انظر جدول المواد) ، ونخل المسحوق الطبي من خلال رقم 2 (فتحة الغربال: 0.8 مم) ورقم 4 (فتحة الغربال: 0.25 مم) المناخل الدوائية القياسية ، واجمع المسحوق بين الغربالين للحصول على مسحوق العينة المطلوب.
    ملاحظة: Pheretima رقيق بعد التكسير ، لذلك لا يحتاج مسحوقه إلى غربلة.
  2. خذ 1 غرام من المسحوق (دقيق إلى 0.001 جم) في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 50 مل ، وأضف 20 مل من محلول حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) بنسبة 5٪ (انظر جدول المواد) ، وقم بالتجانس عند 1000 rmin-1 لمدة دقيقة واحدة باستخدام خالط تشتت عالي السرعة.
  3. بعد التجانس ، قم باستخدام جهاز طرد مركزي عند 1717 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأضف القليل من القطن الماص في القمع الزجاجي ، وقم بتصفية المادة الطافية في دورق حجمي سعة 50 مل.
  4. كرر عملية الاستخراج المذكورة أعلاه مرتين باستخدام 15 مل و 10 مل من محلول TCA 5٪. الجمع بين المرشح وتخفيفه إلى 50 مل مع محلول TCA 5 ٪.

2. إعداد الكاشف

  1. تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 20٪: تزن 20 جم من هيدروكسيد الصوديوم واستخدم الماء منزوع الأيونات لتثبيت الحجم في دورق حجمي سعة 100 مل.
  2. تحضير محلول TCA بنسبة 5٪: قم بوزن 25 جم من TCA واستخدم الماء منزوع الأيونات لتثبيت الحجم في دورق حجمي سعة 500 مل.

3. إعداد حل المخزون القياسي TMA

  1. قم بإعداد محلول المخزون القياسي TMA: قم بوزن 0.0162 جم من عينة هيدروكلوريد TMA القياسية، وقم بإذابتها في محلول TCA بنسبة 5٪، واثبت الحجم إلى 100 مل، أي ما يعادل تركيز 100 ميكروغرام/مل من محلول المخزون القياسي للتحليل الحراري الميكانيكي (TMA). احفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. تحضير محلول الاستخدام القياسي للتحليل الحراري الميكانيكي (TMA): خذ حجما معينا من محلول المخزون القياسي للتحليل الحراري الميكانيكي (TMA) وقم بتخفيفه خطوة بخطوة باستخدام محلول TCA بنسبة 5٪ إلى تركيزات 0.1 ميكروغرام/مل، و0.5 ميكروغرام/مل، و1 ميكروغرام/مل، و2 ميكروغرام/مل، و5 ميكروغرام/مل، و10 ميكروغرام/مل محلول التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) القياسي.

4. عينة معالجة فراغ الرأس

  1. تزن بدقة 2 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم و 0.5 جم من البارافين الصلب (نقطة الانصهار: 58-60 درجة مئوية) في قارورة فراغ الرأس سعة 20 مل (انظر جدول المواد).
  2. ضع قنينة فراغ الرأس في فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا. البارافين الصلب يذوب تماما.
  3. أخرجه واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة حتى يصلب البارافين. سوف يغلق البارافين المتصلب هيدروكسيد الصوديوم.
  4. خذ 2 مل من كل محلول استخراج عينة وضعه فوق طبقة البارافين ، واضغط على الغطاء ، وأغلق.
  5. ضع قارورة فراغ الرأس المختومة على الجهاز (انظر جدول المواد) للقياس.

5. إعداد شروط تحليل HS-GC-MS / MS

  1. انظر الجدول 2 لمعرفة ظروف فراغ الرأس وظروف GC-MS.
  2. انظر الجدول 3 للحصول على معلومات أيونية.

6. رسم منحنى قياسي

  1. ارجع إلى عينة معالجة فراغ الرأس في الخطوات 4.1-4.3 لتحضير قارورة فراغ الرأس التي تحتوي على طبقة مانعة للتسرب من الغسول والبارافين.
  2. نضح 2 مل من 0.1 ميكروغرام/مل، و0.5 ميكروغرام/مل، و1 ميكروغرام/مل، و2 ميكروغرام/مل، و5 ميكروغرام/مل، و10 ميكروغرام/مل محلول TMA القياسي في قنينة فراغ رأس سعة 20 مل، وأغلق الغطاء، وقم بالقياس على الجهاز.

7. اختبار الدقة

  1. ارجع إلى معالجة فراغ الرأس للعينة في الخطوات 4.1-4.3 لتحضير قارورة فراغ الرأس التي تحتوي على الغسول وطبقة ختم البارافين.
  2. انضح 2 مل من محلول TMA القياسي 0.1 ميكروغرام/مل في قنينة فراغ الرأس سعة 20 مل وأغلق الغطاء. قم بإجراء ستة اختبارات متوازية في الجهاز باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

8. تجربة معدل الاسترداد

  1. خذ مجموعة من Pheretima و Periplaneta Americana و Hirudo (S02 و S05 و S07; الجدول 1) كأدوية تمثيلية لتجربة معدل الاسترداد.
  2. خذ عدة دفعات من مسحوق العينات (S02 ، S05 ، S07) واخبزها في فرن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 72 ساعة حتى لا يتم اكتشاف أي TMA.
  3. راجع طريقة تحضير العينة في الأقسام 4-6 لاكتشاف محتوى التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) في مسحوق الأدوية المخبوزة.
  4. خذ 1 جم من المسحوق المخبوز (دقيق إلى 0.001 جم) ، وضعه في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 50 مل ، وأضف 50 ميكرولتر من محلول TMA القياسي.
    ملاحظة: تركيز محلول التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) القياسي هو 100 ميكروغرام/مل، و1000 ميكروغرام/مل، و10000 ميكروغرام/مل.
  5. أضف 20 مل من محلول TCA 5٪ وقم بالتجانس عند 1000 rmin-1 لمدة دقيقة واحدة.
  6. بعد التجانس ، أجهزة الطرد المركزي عند 1717 × جم لمدة 5 دقائق ، أضف القليل من القطن الماص في القمع الزجاجي وقم بتصفية المادة الطافية في دورق حجمي سعة 50 مل.
  7. كرر عملية الاستخراج المذكورة أعلاه مرتين باستخدام 15 مل و 10 مل من محلول TCA 5٪ ؛ الجمع بين المرشح وتخفيفه إلى 50 مل مع محلول TCA 5 ٪.

9. تحديد حدود الكشف (LOD) والقياس الكمي (LOQ)

  1. حدد LOD بالتركيز المقابل عندما تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N) = 3.
  2. حدد LOQ بالتركيز المقابل عندما يكون S / N = 10.

10. تحديد عينة محتوى التحليل الحراري الميكانيكي (TMA)

  1. خذ حوالي 1 غرام من مسحوق ناعم من Pheretima و Periplaneta americana و Hirudo ، على التوالي ، استخرج العينة وفقا للطريقة المذكورة أعلاه ، وحددها على الجهاز.

النتائج

يتم عرض الرسوم البيانية التخطيطية لمبدأ المعالجة المسبقة وتشغيل هذا البروتوكول في الشكل 1 والشكل 2 ، على التوالي. كان وقت الذروة للتحليل الحراري الميكانيكي (TMA) 2.3 دقيقة، مع شكل ذروة حاد وعدم وجود تداخل من الشوائب الأخرى (الشكل 3). بقياس النطاق...

Discussion

تأتي الأدوية المشتقة من الحيوانات من الجسم كله أو الأعضاء أو الأنسجة أو المنتجات الفسيولوجية أو المرضية أو الإفرازات أو الإفرازات والمنتجات المصنعة للحيوانات. يعد التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) مصدرا مهما للرائحة السمكية في الأدوية المشتقة من الحيوانات. إنها مادة كريهة الرائحة نموذجية ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82173991) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2022YFS0442).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CentrifugeBeckman Coulter Trading (China) Co.SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinderZhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical FactoryHX-200K
Convection ovenSanyo Electric Co., LtdMOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum capsANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncV1750004
Electronic balanceShimadzu Corporation JapanAUW220D
Gas chromatography mass spectrometryShimadzu Corporation JapanTQ-8050 NX
Headspace VialANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc25760200
HomogenizerShanghai biaomo FactoryFJ200-SH
Preassembled CapANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncL4150050
Sample sieveZhenxing Sieve Factory/
SH-Volatile AmineChengdu Meimelte Technology Co., Ltd227-3626-01
Sodium hydroxideChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022101401
Solid paraffin waxShanghai Hualing Kangfu apparatus factory20221112
Trichloroacetic acidChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022102001
Trimethylamine hydrochlorideChengdu Aifa Biotechnology Co., LtdAF22022108
Ultra-pure water systemSichuan Youpu Ultrapure Technology Co., LtdUPR-11-5T

References

  1. Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
  2. Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
  3. Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
  4. Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).
  5. Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
  6. Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318 (2022).
  7. Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
  8. Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).
  9. Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
  10. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. . GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).
  11. Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
  12. Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
  13. Yoshiharu, I. . Odor olfactory measurement. , (2004).
  14. Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).

Erratum


Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd

to:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved