Eine verbesserte Technik zum Nachweis von Trimethylamin in der Tierarzneimittel mittels Headspace-Gaschromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Hier wird eine Headspace-Gaschromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie-Methode (HS-GC-MS/MS) beschrieben, die für die Bestimmung von Trimethylamin (TMA) in tierischen Arzneimitteln geeignet ist. Das Protokoll umfasst die Vorbehandlung der Proben, die Headspace-Behandlung, die Analysebedingungen, die methodische Validierung und die Bestimmung der TMA in Arzneimitteln tierischen Ursprungs.

Zusammenfassung

Arzneimittel tierischen Ursprungs haben charakteristische Eigenschaften und signifikante heilende Wirkungen, aber die meisten von ihnen haben einen offensichtlichen Fischgeruch, was zu einer schlechten Compliance der klinischen Patienten führt. Trimethylamin (TMA) ist eine der wichtigsten Bestandteile des fischigen Geruchs in der tierischen Medizin. Es ist schwierig, TMA mit der bestehenden Nachweismethode genau zu identifizieren, da der erhöhte Druck im Headspace-Fläschchen durch die schnelle Säure-Base-Reaktion nach der Zugabe von Lauge verursacht wird, was dazu führt, dass TMA aus dem Headspace-Fläschchen entweicht und den Forschungsfortschritt des fischigen Geruchs von tierischen Arzneimitteln zum Stillstand bringt. In dieser Studie schlugen wir eine kontrollierte Nachweismethode vor, bei der eine Paraffinschicht als Isolationsschicht zwischen Säure und Lauge eingeführt wurde. Die Geschwindigkeit der TMA-Produktion konnte durch langsame Verflüssigung der Paraffinschicht durch thermostatische Ofenheizung effektiv gesteuert werden. Diese Methode zeigte zufriedenstellende Linearität, Präzisionsexperimente und Wiederfindungen mit guter Reproduzierbarkeit und hoher Empfindlichkeit. Sie leistete technische Unterstützung bei der Desodorierung von Arzneimitteln tierischen Ursprungs.

Einleitung

Die Behandlung menschlicher Krankheiten durch die Verwendung von Produkten, die aus tierischen Teilen und/oder deren Nebenprodukten gewonnen werden (hier als Arzneimittel tierischen Ursprungs bezeichnet), erhält zunehmend Aufmerksamkeit. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Behandlung von Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Leberzirrhose, Mastitis und anderen Krankheiten, mit den Vorteilen einer starken Wirkung, einer geringen Dosierung und einer signifikanten und spezifischen klinischen Wirksamkeit. Tierische Arzneimittel haben jedoch im Allgemeinen einen ausgeprägten Fischgeruch, der die Compliance der Patienten stark beeinträchtigt und besonders für Kinder ungünstig ist ^1,2. Der fischige Geruch kommt hauptsächlich von den Proteinen, Aminosäuren, Fetten und anderen Substanzen, die im Arzneimittel enthalten sind, die durch Fettsäureoxidation, Aminosäureabbau und andere Wege zersetzt werden, um eine Vielzahl von Substanzen mit einem fischigen Geruch zu produzieren ^2,3,4. Unter ihnen ist Trimethylamin (TMA) ein flüchtiges Gas mit einem fischigen Geruch, das in verrottenden oder verdorbenen tierischen Lebensmitteln weit verbreitet ist⁵.

Bisher wurden Gaschromatographie (GC), Flüssigkeitschromatographie (LC), Ionenchromatographie, Spektrophotometrie, Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Sensormethoden verwendet, um TMA in der Umwelt, in Lebensmitteln und im Urin nachzuweisen 6,7,8,9. Angesichts der geringen Kontamination der GC-Säule und des Injektionssystems sowie der hohen Sensitivität, Reproduzierbarkeit und niedrigen Nachweisgrenze (0,1-1 mg/kg) wurde die Headspace-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (HS-GC-MS) für die Lebensmittel- und biologische Analytik bevorzugt⁸. Derzeit hat nur China einen nationalen Standard für TMA in Lebensmitteln festgelegt, und HS-GC-MS ist die erste Methode in der Norm GB5009.179-2016¹⁰. Daher wurde die oben beschriebene HS-GC-MS-Methode ausgewählt, um TMA in tierischen Arzneimitteln nachzuweisen. In einem frühen Stadium fand unsere Forschungsgruppe heraus, dass der HS-GC-MS-Nachweisstandard für TMA in Lebensmitteln den Fischgeruch in mehreren tierischen Arzneimitteln nachweisen kann. In Kombination mit den Ergebnissen der Studien^11,12 konnte nachgewiesen werden, dass TMA die häufigste Schlüsselsubstanz des Fischgeruchs in tierischen Arzneimitteln ist. Es zeigte sich jedoch, dass die Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse schlecht war und es Probleme wie TMA-Entweichen und schlechte Stabilität gab, die durch die Methodik nicht verifiziert werden konnten. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Lauge in das Headspace-Fläschchen injiziert wurde und die schnelle Säure-Base-Reaktion zu einem erhöhten Druck im Fläschchen führte, wodurch TMA aus der Injektionspore entwich, was den stabilen und genauen Nachweis von TMA verhinderte. Daher wurde in dieser Studie eine verbesserte Detektionsmethode der Headspace-Gaschromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie (HS-GC-MS/MS) vorgeschlagen, um diese Probleme anzugehen.

Das Protokoll verbessert die Probenvorbehandlung, indem die Säure-Base-Reaktanten in der Vorbehandlung mit Hilfe von festem Paraffin, einem guten Fest-Flüssig-Phasenwechselmaterial, getrennt werden. Als sich das Paraffin mit dem Temperaturanstieg des thermostatischen Ofens langsam verflüssigte, wurde TMA auch langsam in der versiegelten Headspace-Durchstechflasche freigesetzt, wodurch der durch die heftige und schnelle Säure-Base-Reaktion verursachte Druckanstieg vermieden und ein stabiler und genauer TMA-Nachweis gewährleistet wurde. Darüber hinaus unterdrückte die Headspace-Injektion in Kombination mit MRM-Modi (Multiple Reaction Monitoring) in GC-MS/MS effektiv chemische Interferenzen in der Matrix und stellte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicher. Die Ergebnisse der methodischen Validierung zeigten, dass die Linearität, der Präzisionstest und die Wiederfindungsrate der verbesserten Detektionsmethode die Anforderungen mit guter Reproduzierbarkeit und hoher Empfindlichkeit erfüllen können.

Protokoll

Siehe Tabelle 1 für Informationen über die medizinischen Materialien von Pheretima, Periplaneta americana und Hirudo. Sie wurden von Prof. Xu Runchun von der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine als die getrockneten Körper von Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. und Whitmania pigra Whitman identifiziert.

1. Probenentnahme

1. Zerkleinern Sie Pheretima, Periplaneta americana und Hirudo mit einem Kräutermahlwerk (siehe Materialtabelle), sieben Sie das medizinische Pulver durch die Standard-Medikamentensiebe Nr. 2 (Sieböffnung: 0,8 mm) und Nr. 4 (Sieböffnung: 0,25 mm) und sammeln Sie das Pulver zwischen den beiden Sieben, um das erforderliche Probenpulver zu erhalten.
   HINWEIS: Die Pheretima ist nach dem Zerkleinern fluffig, so dass ihr Pulver nicht gesiebt werden muss.
2. Nehmen Sie 1 g Pulver (auf 0,001 g genau) in ein 50-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen, fügen Sie 20 ml 5%ige Trichloressigsäure (TCA)-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle) und homogenisieren Sie bei 1.000 rmin-1 für 1 Minute mit einem Hochgeschwindigkeits-Dispersionshomogenisator.
3. Nach der Homogenisierung wird bei 1.717 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, ein wenig saugfähige Watte in den Glastrichter gegeben und der Überstand in einen 50-ml-Messkolben filtriert.
4. Wiederholen Sie den obigen Extraktionsvorgang zweimal mit 15 ml und 10 ml 5%iger TCA-Lösung. Kombinieren Sie das Filtrat und verdünnen Sie es auf 50 ml mit 5%iger TCA-Lösung.

2. Vorbereitung der Reagenzien

1. 20%ige Natronlauge herstellen: 20 g Natronlauge abwiegen und mit deionisiertem Wasser das Volumen in einem 100-ml-Messkolben fixieren.
2. 5%ige TCA-Lösung vorbereiten: 25 g TCA abwiegen und mit deionisiertem Wasser das Volumen in einem 500-ml-Messkolben fixieren.

3. Herstellung der TMA-Standardstammlösung

1. Bereiten Sie TMA-Standardstammlösung vor: 0,0162 g TMA-Hydrochlorid-Standardprobe werden abgewogen, in 5%iger TCA-Lösung aufgelöst und das Volumen auf 100 ml festgelegt, was der Konzentration von 100 μg/ml TMA-Standardstammlösung entspricht. Bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie TMA-Standardlösung vor: Nehmen Sie ein bestimmtes Volumen TMA-Standardstammlösung und verdünnen Sie es Schritt für Schritt mit 5%iger TCA-Lösung auf Konzentrationen von 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml und 10 μg/ml TMA-Standardlösung.

4. Headspace-Verarbeitung der Probe

1. 2 ml Natronlauge und 0,5 g festes Paraffin (Schmelzpunkt: 58-60 °C) werden in einem 20-ml-Headspace-Fläschchen genau abgewogen (siehe Materialtabelle).
2. Die Durchstechflasche mit Kopfraum für ca. 30 min bei 70 °C in den Ofen geben. Das feste Paraffin schmilzt vollständig.
3. Nehmen Sie es heraus und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen, damit das Paraffin erstarrt. Das erstarrte Paraffin versiegelt Natriumhydroxid.
4. Nehmen Sie 2 ml jeder Probenextraktionslösung und geben Sie sie auf die Paraffinschicht, drücken Sie die Kappe und versiegeln Sie.
5. Legen Sie das versiegelte Headspace-Fläschchen zur Messung auf das Gerät (siehe Materialtabelle).

5. Einstellung der HS-GC-MS/MS-Analysebedingungen

1. Siehe Tabelle 2 für Headspace-Bedingungen und GC-MS-Bedingungen.
2. Siehe Tabelle 3 für Ioneninformationen.

6. Standard-Kurvenzeichnung

1. Beziehen Sie sich auf die Headspace-Probenverarbeitung in den Schritten 4.1 bis 4.3, um das Headspace-Fläschchen mit Lauge und Paraffinversiegelung vorzubereiten.
2. 2 ml 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml und 10 μg/ml TMA-Standardlösung in eine 20-ml-Headspace-Durchstechflasche einatmen, die Kappe verschließen und auf dem Gerät messen.

7. Präzisionsprüfung

1. Beziehen Sie sich auf die Proben-Headspace-Verarbeitung in den Schritten 4.1 bis 4.3, um das Headspace-Fläschchen mit Lauge und die Paraffinversiegelungsschicht vorzubereiten.
2. 2 ml 0,1 μg/ml TMA-Standardlösung in ein 20-ml-Headspace-Fläschchen geben und die Kappe verschließen. Führen Sie sechs parallele Tests in der Maschine gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Werkstofftabelle).

8. Experiment zur Wiederfindungsrate

1. Man nehme eine Ladung Pheretima, Periplaneta Americana und Hirudo (S02, S05, S07; Tabelle 1) als repräsentative Arzneimittel für das Experiment zur Wiederfindungsrate.
2. Nehmen Sie mehrere Chargen Probenpulver (S02, S05, S07) und backen Sie sie in einem Ofen bei 50 °C für 72 Stunden, bis kein TMA mehr nachgewiesen wird.
3. Beziehen Sie sich auf die Probenvorbereitungsmethode in den Abschnitten 4-6, um den Gehalt an TMA in gebackenem Medizinpulver nachzuweisen.
4. Nehmen Sie 1 g gebackenes Pulver (auf 0,001 g genau), geben Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff und fügen Sie 50 μl TMA-Standardlösung hinzu.
   HINWEIS: Die Konzentration der TMA-Standardlösung beträgt 100 μg/ml, 1000 μg/ml und 10000 μg/ml.
5. 20 ml 5%ige TCA-Lösung zugeben und bei 1000 ^{rmin-1 für 1} min homogenisieren.
6. Nach der Homogenisierung wird bei 1717 x g 5 min zentrifugiert, etwas saugfähige Watte in den Glastrichter gegeben und der Überstand in einen 50-ml-Messkolben filtriert.
7. Wiederholen Sie den obigen Extraktionsvorgang zweimal mit 15 ml und 10 ml 5%iger TCA-Lösung; Kombinieren Sie das Filtrat und verdünnen Sie es auf 50 ml mit 5%iger TCA-Lösung.

9. Bestimmung der Nachweisgrenzen (LOD) und Quantifizierung (LOQ)

1. Bestimmen Sie die Detailgenauigkeit anhand der entsprechenden Konzentration, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) = 3 ist.
2. Bestimmen Sie die LAQ durch die entsprechende Konzentration, wenn die S/N = 10 ist.

10. Bestimmung des TMA-Gehalts der Probe

1. Nehmen Sie etwa 1 g feines Pulver von Pheretima, Periplaneta americana bzw. Hirudo, extrahieren Sie die Probe gemäß der obigen Methode und bestimmen Sie sie auf der Maschine.

Ergebnisse

Schematische Diagramme des Vorverarbeitungsprinzips und der Funktionsweise dieses Protokolls sind in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2 dargestellt. Die Peakzeit der TMA betrug 2,3 Minuten, mit einer scharfen Peakform und ohne Interferenzen durch andere Verunreinigungen (Abbildung 3). Bei der Messung des linearen Bereichs von 0,1-10 μg/ml TMA-Standardlösung mit der TMA-Konzentration als Abszisse und der Peakfläche als Ordinate wurde ei...

Diskussion

Arzneimittel tierischen Ursprungs stammen aus dem ganzen Körper, aus Organen oder Geweben, aus physiologischen oder pathologischen Produkten, aus Ausscheidungen oder Sekreten und aus verarbeiteten Produkten von Tieren. TMA ist eine wichtige Quelle für fischigen Geruch in Arzneimitteln tierischen Ursprungs. Es handelt sich um eine typische übelriechende Substanz mit einer sehr niedrigen Riechschwelle (0,000032 × ^10-6 V/V) und einem starken Fischgeruch¹³. Derzeit kann die gängige HS-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter Trading (China) Co.	SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder	Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory	HX-200K
Convection oven	Sanyo Electric Co., Ltd	MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	V1750004
Electronic balance	Shimadzu Corporation Japan	AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry	Shimadzu Corporation Japan	TQ-8050 NX
Headspace Vial	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	25760200
Homogenizer	Shanghai biaomo Factory	FJ200-SH
Preassembled Cap	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	L4150050
Sample sieve	Zhenxing Sieve Factory	/
SH-Volatile Amine	Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd	227-3626-01
Sodium hydroxide	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022101401
Solid paraffin wax	Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory	20221112
Trichloroacetic acid	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022102001
Trimethylamine hydrochloride	Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd	AF22022108
Ultra-pure water system	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd	UPR-11-5T