헤드스페이스 가스 크로마토그래피-탠덤 사중극자 질량분석법에 의한 동물 유래 의학의 트리메틸아민 검출을 위한 개선된 기술

요약

여기에서는 동물 유래 의약품에서 트리메틸아민(TMA) 측정에 적합한 헤드스페이스 가스 크로마토그래피-탠덤 사중극자 질량분석법(HS-GC-MS/MS) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 샘플 전처리, 헤드스페이스 처리, 분석 조건, 방법론적 검증 및 동물 유래 의약품의 TMA 측정이 포함됩니다.

초록

동물 유래 의약품은 특유의 특성과 상당한 치료 효과를 가지고 있지만 대부분 명백한 비린내이가 있어 임상 환자의 순응도가 낮습니다. 트리메틸아민(TMA)은 동물 유래 의약품의 주요 비린내 성분 중 하나입니다. 잿물 첨가 후 급격한 산-염기 반응으로 인한 헤드스페이스 바이알의 압력 증가로 인해 TMA가 헤드스페이스 바이알에서 빠져나가 동물유래 의약품의 비린내에 대한 연구 진행이 지연되어 기존 검출 방법으로는 TMA를 정확하게 식별하기 어렵습니다. 본 연구에서는 산과 잿물 사이의 격리층으로 파라핀층을 도입한 제어된 검출 방법을 제안하였다. TMA 생산 속도는 자동 온도 조절 용광로 가열을 통해 파라핀 층을 천천히 액화시킴으로써 효과적으로 제어 할 수 있습니다. 이 방법은 우수한 재현성과 높은 감도로 만족스러운 선형성, 정밀 실험 및 회수율을 보여주었습니다. 동물 유래 의약품의 탈취에 대한 기술 지원을 제공했습니다.

서문

동물 부위 및/또는 그 부산물에서 추출한 제품(여기서는 동물 유래 의약품이라고 함)을 활용하여 인간의 질병을 치료하는 것이 점점 더 주목받고 있습니다. 암, 심혈관 질환, 간경변, 유방염 및 기타 질병을 치료하는 데 중요한 역할을 하며 강력한 효과, 소량, 중요하고 구체적인 임상 효능의 장점이 있습니다. 그러나 동물성 의약품은 일반적으로 비린내가 두드러져 환자의 순응도에 큰 영향을 미치며 특히 어린이 ^1,2에게 불리합니다. 비린내는 주로 약에 함유된 단백질, 아미노산, 지방 및 기타 물질에서 비롯되며, 지방산 산화, 아미노산 분해 및 기타 비린내를 가진 다양한 물질을 생성하는 기타 방법을 통해 분해됩니다 ^2,3,4. 그 중 트리메틸아민(TMA)은 썩거나 썩은 동물 유래 식품에 널리 존재하는 비린내를 동반한 휘발성 가스이다⁵.

지금까지, 가스 크로마토그래피 (GC), 액체 크로마토 그래피 (LC), 이온 크로마토 그래피, 분광 광도법, 액체 크로마토 그래피 - 질량 분광법 (LC-MS) 및 센서 방법은 환경, 식품 및 소변에서 TMA를 검출하기 위해 일반적으로 사용되어 왔다 6,7,8,9. GC 컬럼 및 주입 시스템의 낮은 오염과 높은 감도, 재현성 및 낮은 검출 한계(0.1-1 mg/kg)를 고려할 때, 헤드스페이스 가스 크로마토그래피-질량분석법(HS-GC-MS) 방법은 식품 및 생물학적 분석에 선호되었다⁸. 현재 중국만이 식품의 TMA에 대한 국가 표준을 제정했으며 HS-GC-MS는 GB5009.179-2016 표준¹⁰의 첫 번째 방법입니다. 따라서 동물유래 의약품에서 TMA를 검출하기 위해 상기 HS-GC-MS 방법을 선택하였다. 초기 단계에서 우리 연구 그룹은 식품의 TMA에 대한 HS-GC-MS 검출 표준이 여러 동물 유래 의약품에서 비린내를 감지할 수 있음을 발견했습니다. 연구^{결과와 11,12} TMA가 동물 유래 의약품에서 비린내를 유발하는 일반적인 핵심 물질임을 증명할 수 있습니다. 그러나 실험 결과의 재현성이 떨어지고 TMA 이탈, 안정성 불량 등의 문제가 있어 방법론으로 검증할 수 없는 문제점이 있는 것으로 나타났다. 이는 잿물이 헤드스페이스 바이알에 주입되고 빠른 산-염기 반응으로 인해 바이알의 압력이 증가하여 TMA가 주입 기공에서 빠져나와 TMA의 안정적이고 정확한 검출을 방해했기 때문일 수 있습니다. 따라서 본 연구에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 개선된 헤드스페이스 가스 크로마토그래피-탠덤 사중극자 질량분석법(HS-GC-MS/MS) 검출 방법을 제안했습니다.

이 프로토콜은 우수한 고체-액체 상 변화 물질인 고체 파라핀의 도움으로 전처리에서 산-염기 반응물을 분리하여 샘플 전처리를 개선합니다. 온도 조절로의 온도 상승에 따라 파라핀이 서서히 액화됨에 따라 TMA도 밀봉된 헤드스페이스 바이알에서 천천히 방출되어 격렬하고 빠른 산-염기 반응으로 인한 압력 증가를 방지하고 안정적이고 정확한 TMA 검출을 보장합니다. 또한 GC-MS/MS에서 다중 반응 모니터링(MRM) 모드와 결합된 헤드스페이스 주입은 매트릭스 화학적 간섭을 효과적으로 억제하고 결과의 신뢰성을 보장했습니다. 방법론적 검증의 결과는 개선된 검출 방법의 선형성, 정밀 테스트 및 회수율이 우수한 재현성과 높은 감도로 요구 사항을 충족할 수 있음을 입증했습니다.

프로토콜

Pheretima, Periplaneta americana 및 Hirudo의 의약 재료에 대한 정보는 표 1을 참조하십시오. 그들은 청두 중국 전통 의학 대학의 Xu Runchun 교수에 의해 Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. 및 Whitmania pigra Whitman의 건조 된 시체로 확인되었습니다.

1. 검체 추출

1. Pheretima, Periplaneta americana 및 Hirudo를 허브 분쇄기(재료 표 참조)로 부수고 약용 분말을 2번(체 구멍: 0.8mm) 및 4번(체 구멍: 0.25mm) 표준 약물 체를 통해 체로 치고 두 체 사이에 분말을 수집하여 필요한 샘플 분말을 얻습니다.
   알림: Pheretima 는 분쇄 후 푹신하므로 분말을 체질할 필요가 없습니다.
2. 50mL 플라스틱 원심분리기 튜브에 분말 1g(정확 0.001g)을 넣고 5% 트리클로로아세트산(TCA) 용액 20mL( 재료 표 참조)를 넣고 고속 분산 균질기로 1,000rmin-1에서 ¹ 분 동안 균질화합니다.
3. 균질화 후, 실온에서 5분 동안 1,717 x g 로 원심분리하고, 유리 깔때기에 약간의 흡수성 면을 첨가하고, 상층액을 50mL 용량 플라스크에 여과한다.
4. 5% TCA 용액 15mL와 10mL로 위의 추출 과정을 두 번 반복합니다. 여과액을 합하고 5% TCA 용액으로 50mL로 희석합니다.

2. 시약 준비

1. 20% 수산화나트륨 용액 준비: 수산화나트륨 20g을 칭량하고 탈이온수를 사용하여 100mL 부피 플라스크에 부피를 고정합니다.
2. 5 % TCA 용액 준비 : TCA 25g의 무게를 측정하고 탈 이온수를 사용하여 500mL 용량 플라스크에 부피를 고정합니다.

3. TMA 표준 원액 준비

1. TMA 표준 원액 준비: TMA 염산염 표준시료 0.0162g의 무게를 측정하여 5% TCA 용액에 녹이고 부피를 TMA 표준액 100μg/mL 농도와 동일한 100mL로 고정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. TMA 표준 사용 용액 준비: 일정량의 TMA 표준 원액을 취하여 5% TCA 용액으로 단계적으로 희석하여 0.1μg/mL, 0.5μg/mL, 1μg/mL, 2μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL TMA 표준 용액.

4. 샘플 헤드스페이스 처리

1. 20mL 헤드스페이스 바이알에 수산화나트륨 용액 2mL와 고체 파라핀 0.5g(융점: 58-60°C)을 정확하게 칭량합니다( 재료 표 참조).
2. 헤드스페이스 바이알을 70°C의 오븐에 약 30분 동안 넣습니다. 고체 파라핀이 완전히 녹습니다.
3. 꺼내서 실온으로 식혀 파라핀이 굳도록 한다. 응고된 파라핀은 수산화나트륨을 밀봉합니다.
4. 각 샘플 추출 용액 2mL를 취하여 파라핀 층 위에 놓고 캡을 누르고 밀봉합니다.
5. 측정을 위해 밀봉된 헤드스페이스 바이알을 기계에 올려 놓습니다( 재료 표 참조).

5. HS-GC-MS/MS 분석 조건 설정

1. 헤드스페이스 조건 및 GC-MS 조건에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.
2. 이온 정보는 표 3 을 참조하십시오.

6. 표준 곡선 그리기

1. 4.1-4.3 단계의 샘플 헤드스페이스 처리를 참조하여 잿물 및 파라핀 밀봉층을 함유하는 헤드스페이스 바이알을 준비한다.
2. 0.1μg/mL, 0.5μg/mL, 1μg/mL, 2μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL TMA 표준 용액 2mL를 20mL 헤드스페이스 바이알에 흡인하고 캡을 밀봉하고 기계에서 측정합니다.

7. 정밀도 시험

1. 4.1-4.3 단계의 샘플 헤드스페이스 처리를 참조하여 잿물과 파라핀 밀봉층이 포함된 헤드스페이스 바이알을 준비합니다.
2. 0.1μg/mL TMA 표준 용액 2mL를 20mL 헤드스페이스 바이알에 흡인하고 캡을 밀봉합니다. 제조업체의 지침에 따라 기계에서 6 개의 병렬 테스트를 수행하십시오 ( 재료 표 참조).

8. 회수율 실험

1. Pheretima, Periplaneta Americana 및 Hirudo(S02, S05, S07; 표 1) 회수율 실험을 위한 대표적인 의약품으로.
2. 샘플 분말(S02, S05, S07)의 여러 배치를 가져다가 TMA가 감지되지 않을 때까지 50°C의 오븐에서 72시간 동안 굽습니다.
3. 섹션 4-6의 샘플 준비 방법을 참조하여 구운 약 분말에서 TMA 함량을 검출합니다.
4. 구운 분말 1g(정확 0.001g)을 취하여 50mL 플라스틱 원심분리기 튜브에 넣고 TMA 표준액 50μL를 추가합니다.
   참고: TMA 표준 용액의 농도는 100μg/mL, 1000μg/mL 및 10000μg/mL입니다.
5. 5% TCA 용액 20mL를 넣고 1000rmin-1에서 ¹ 분 동안 균질화합니다.
6. 균질화 후, 1717 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 유리 깔때기에 약간의 흡수성 면을 첨가하고, 상청액을 50mL 부피 플라스크에 여과한다.
7. 15 mL 및 10 mL의 5% TCA 용액으로 위의 추출 과정을 두 번 반복하십시오. 여과액을 합하고 5% TCA 용액으로 50mL로 희석합니다.

9. 검출 한계(LOD) 및 정량화(LOQ) 결정

1. 신호 대 잡음비(S/N) = 3일 때 해당 농도로 LOD를 결정합니다.
2. S/N = 10일 때 해당 농도로 LOQ를 결정합니다.

10. 시료 TMA 함량 측정

1. Pheretima, Periplaneta americana 및 Hirudo의 미세 분말 약 1g을 각각 취하여 위의 방법에 따라 샘플을 추출하고 기계에서 결정합니다.

결과

이 프로토콜의 전처리 원리와 작동에 대한 개략도는 각각 그림 1과 그림 2에 나와 있습니다. TMA의 피크 시간은 2.3분이었고, 피크 모양이 뚜렷하고 다른 불순물의 간섭이 없었습니다(그림 3). 0.1-10 μg/mL TMA 표준용액의 선형 범위를 측정하고, TMA 농도를 가로좌표로, 피크 면적을 세로좌표로 하여 표준 곡선을 그렸습니다. 선형 회귀 ?...

토론

동물 유래 의약품은 전신, 장기 또는 조직, 생리학적 또는 병리학적 산물, 배설물 또는 분비물, 동물의 가공 제품에서 유래합니다. TMA는 동물성 의약품에서 비린내를 유발하는 중요한 원인입니다. 후각 역치가 매우 낮고(0.000032 × ^10-6 V/V) 강한 비린내를 풍기는 전형적인 악취 물질이다¹³. 현재 일반적으로 사용되는 HS-GC-MS 방법은 동물 유래 의약품에서 TMA를 안정적이고 정?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter Trading (China) Co.	SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder	Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory	HX-200K
Convection oven	Sanyo Electric Co., Ltd	MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	V1750004
Electronic balance	Shimadzu Corporation Japan	AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry	Shimadzu Corporation Japan	TQ-8050 NX
Headspace Vial	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	25760200
Homogenizer	Shanghai biaomo Factory	FJ200-SH
Preassembled Cap	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	L4150050
Sample sieve	Zhenxing Sieve Factory	/
SH-Volatile Amine	Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd	227-3626-01
Sodium hydroxide	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022101401
Solid paraffin wax	Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory	20221112
Trichloroacetic acid	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022102001
Trimethylamine hydrochloride	Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd	AF22022108
Ultra-pure water system	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd	UPR-11-5T