Uma Técnica Aprimorada para Detecção de Trimetilamina em Medicina Derivada de Animais por Cromatografia Gasosa Headspace-Espectrometria de Massas em Tandem Quadrupolo

Resumo

Aqui, um método de cromatografia gasosa headspace-espectrometria de massas quadrupolo em tandem (HS-GC-MS/MS) adequado para a determinação de trimetilamina (TMA) em medicamentos derivados de animais é descrito. O protocolo inclui pré-tratamento da amostra, tratamento com headspace, condições de análise, validação metodológica e determinação de TMA em medicamentos derivados de animais.

Resumo

Os medicamentos de origem animal têm características distintas e efeitos curativos significativos, mas a maioria deles tem um odor de peixe óbvio, resultando na baixa adesão dos pacientes clínicos. A trimetilamina (TMA) é um dos principais componentes de odor de peixe na medicina de origem animal. É difícil identificar com precisão a TMA usando o método de detecção existente devido ao aumento da pressão no frasco para injetáveis de headspace causado pela rápida reação ácido-base após a adição de lixívia, o que faz com que a TMA escape do frasco para injetáveis de headspace, atrasando o progresso da pesquisa do odor de peixe da medicina derivada de animais. Neste estudo, propusemos um método de detecção controlada que introduziu uma camada de parafina como camada de isolamento entre o ácido e a soda cáustica. A taxa de produção de TMA pode ser efetivamente controlada pela liquefação lenta da camada de parafina através do aquecimento termostático do forno. Este método apresentou linearidade satisfatória, experimentos de precisão e recuperações com boa reprodutibilidade e alta sensibilidade. Prestou apoio técnico para a desodorização de medicamentos derivados de animais.

Introdução

O tratamento de doenças humanas utilizando produtos derivados de partes animais e/ou seus subprodutos (aqui referidos como medicamentos derivados de animais) está recebendo atenção crescente. Eles desempenham um papel importante no tratamento de câncer, doenças cardiovasculares, cirrose hepática, mastite e outras doenças, com as vantagens de um forte efeito, pequena dosagem e eficácia clínica significativa e específica. No entanto, medicamentos de origem animal geralmente apresentam odor proeminente de peixe, o que afeta sobremaneira a adesão dos pacientes, sendo especialmente desfavoráveis para crianças ^1,2. O odor de peixe provém principalmente das proteínas, aminoácidos, gorduras e outras substâncias contidas no medicamento, que são decompostas através da oxidação de ácidos graxos, degradação de aminoácidos e outras formas de produzir uma variedade de substâncias com odor de peixe ^2,3,4. Dentre eles, a trimetilamina (TMA) é um gás volátil com odor de peixe que existe amplamente em alimentos de origem animal em decomposição ou apodrecidos⁵.

Até o momento, cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida (CL), cromatografia iônica, espectrofotometria, cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) e métodos sensores têm sido comumente utilizados para detectar TMA no ambiente, alimentos e urina 6,7,8,9. Tendo em vista a baixa contaminação da coluna GC e do sistema de injeção, bem como a alta sensibilidade, reprodutibilidade e baixo limite de detecção (0,1-1 mg/kg), o método de cromatografia gasosa headspace-espectrometria de massas (HS-GC-MS) foi preferido para análise biológica e de alimentos⁸. Atualmente, apenas a China estabeleceu um padrão nacional para TMA em alimentos, e HS-GC-MS é o primeiro método no padrão GB5009.179-2016¹⁰. Portanto, o método HS-GC-MS acima foi selecionado para detectar TMA em medicina derivada de animais. No estágio inicial, nosso grupo de pesquisa descobriu que o padrão de detecção de HS-GC-MS para TMA em alimentos poderia detectar o odor de peixe em vários medicamentos derivados de animais. Combinado com os resultados dos estudos^11,12, pôde-se provar que a MAT é a substância-chave comum do odor de peixe em medicamentos derivados de animais. No entanto, verificou-se que a reprodutibilidade dos resultados experimentais foi pobre, havendo problemas como escape de ATM e baixa estabilidade, o que não pôde ser verificado pela metodologia. Isso pode ser devido ao fato de que a lixívia foi injetada no frasco do headspace e a rápida reação ácido-base levou ao aumento da pressão no frasco, escapando assim da TMA do poro de injeção, impedindo a detecção estável e precisa da MAT. Portanto, este estudo propôs um método aprimorado de detecção por cromatografia gasosa em headspace-espectrometria de massas quadrupolo em tandem (HS-GC-MS/MS) para resolver esses problemas.

O protocolo melhora o pré-tratamento da amostra separando os reagentes ácido-base no pré-tratamento com a ajuda de parafina sólida, um bom material de mudança de fase sólido-líquido. Como a parafina se liquefez lentamente com o aumento da temperatura do forno termostático, a TMA também foi liberada lentamente no frasco do headspace selado, evitando o aumento de pressão causado pela violenta e rápida reação ácido-base e garantindo uma detecção estável e precisa da TMA. Além disso, a injeção de headspace combinada com os modos de monitoramento de reação múltipla (MRM) em GC-MS/MS efetivamente suprimiu a interferência química da matriz e garantiu a confiabilidade dos resultados. Os resultados da validação metodológica comprovaram que a linearidade, o teste de precisão e a taxa de recuperação do método de detecção aprimorado podem atender aos requisitos, com boa reprodutibilidade e alta sensibilidade.

Protocolo

Ver Tabela 1 para informações sobre os medicamentos de Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo. Eles foram identificados pelo Prof. Xu Runchun, da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, como os corpos secos de Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. e Whitmania pigra Whitman.

1. Extração do espécime

1. Esmague Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo com um moedor de ervas (ver Tabela de Materiais), peneire o pó medicinal através das peneiras padrão nº 2 (abertura da peneira: 0,8 mm) e nº 4 (abertura da peneira: 0,25 mm) e colete o pó entre as duas peneiras para obter o pó de amostra necessário.
   OBS: A Pheretima é fofa após o esmagamento, portanto seu pó não precisa ser peneirado.
2. Tomar 1 g de pó (com precisão de 0,001 g) num tubo de centrífuga de plástico de 50 ml, adicionar 20 ml de solução de ácido tricloroacético (TCA) a 5% (ver Tabela de Materiais) e homogeneizar a 1.000 ^{rmin-1 durante 1} min com um homogeneizador de dispersão de alta velocidade.
3. Após homogeneização, centrifugar a 1.717 x g por 5 min à temperatura ambiente, adicionar um pouco de algodão absorvente no funil de vidro e filtrar o sobrenadante em um balão volumétrico de 50 mL.
4. Repetir o processo de extração acima duas vezes com 15 mL e 10 mL de solução de TCA a 5%. Combinar o filtrado e diluí-lo a 50 ml com solução de TCA a 5%.

2. Preparação dos reagentes

1. Preparar solução de hidróxido de sódio a 20%: pesar 20 g de hidróxido de sódio e utilizar água deionizada para fixar o volume num balão volumétrico de 100 ml.
2. Preparar solução de ATA a 5%: pesar 25 g de ATA e utilizar água deionizada para fixar o volume num balão volumétrico de 500 ml.

3. Preparação da solução-mãe padrão TMA

1. Preparar solução-mãe padrão de TMA: pesar 0,0162 g de amostra-padrão de cloridrato de TMA, dissolvê-la em solução de TCA a 5% e fixar o volume em 100 mL, igual à concentração de 100 μg/mL de solução-mãe padrão de TMA. Conservar a 4 °C.
2. Preparar a solução padrão de TMA: tomar um determinado volume de solução-mãe padrão de TMA e diluí-la passo a passo com solução padrão de TCA a 5% para concentrações de 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL de solução padrão de TMA.

4. Processamento do headspace da amostra

1. Pesar com precisão 2 ml de solução de hidróxido de sódio e 0,5 g de parafina sólida (ponto de fusão: 58-60 °C) num frasco para injetáveis de 20 ml de headspace (ver Tabela de Materiais).
2. Coloque o frasco para injetáveis headspace num forno a 70 °C durante cerca de 30 min. A parafina sólida derrete completamente.
3. Retire-o e deixe esfriar até a temperatura ambiente para que a parafina se solidifique. A parafina solidificada selará o hidróxido de sódio.
4. Pegue 2 mL de cada solução de extração de amostra e coloque-a sobre a camada de parafina, pressione a tampa e lacre.
5. Coloque o frasco para injetáveis de headspace selado na máquina (ver Tabela de Materiais) para medição.

5. Definição das condições de análise de HS-GC-MS/MS

1. Consulte a Tabela 2 para condições de headspace e condições de GC-MS.
2. Consulte a Tabela 3 para obter informações sobre íons.

6. Desenho de curva padrão

1. Consulte o processamento do headspace da amostra nas etapas 4.1-4.3 para preparar o frasco para injetáveis de headspace contendo lixívia e camada de vedação de parafina.
2. Aspirar 2 mL de 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL de solução padrão de TMA em um frasco para injetáveis de 20 mL, selar a tampa e medir na máquina.

7. Teste de precisão

1. Consulte o processamento do headspace da amostra nas etapas 4.1-4.3 para preparar o frasco para injetáveis de headspace contendo lixívia e a camada de vedação em parafina.
2. Aspirar 2 ml de solução-padrão de 0,1 μg/ml de TMA para um frasco para injetáveis de 20 ml de headspace e selar a tampa. Realizar seis testes paralelos na máquina seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).

8. Experimento de taxa de recuperação

1. Tome um lote de Pheretima, Periplaneta Americana e Hirudo (S02, S05, S07; Tabela 1) como os medicamentos representativos para o experimento de taxa de recuperação.
2. Tomar vários lotes de amostra de pó (S02, S05, S07) e assar-os num forno a 50 °C durante 72 h até não ser detectado TMA.
3. Consulte o método de preparação da amostra nas secções 4-6 para detectar o teor de TMA no pó de medicamento cozido.
4. Tome 1 g de fermento em pó (com precisão de 0,001 g), coloque-o num tubo de centrífuga de plástico de 50 ml e adicione 50 μL de solução padrão de TMA.
   NOTA: A concentração da solução padrão de TMA é de 100 μg/mL, 1000 μg/mL e 10000 μg/mL.
5. Adicionar 20 mL de solução de ATA a 5% e homogeneizar a 1000 ^{rmin-1 por 1} min.
6. Após homogeneização, centrifugar a 1717 x g por 5 min, adicionar um pouco de algodão absorvente no funil de vidro e filtrar o sobrenadante em um balão volumétrico de 50 mL.
7. Repetir o processo de extração acima duas vezes com 15 mL e 10 mL de solução de TCA a 5%; combinar o filtrado e diluí-lo a 50 ml com solução de TCA a 5%.

9. Determinação dos limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ)

1. Determine o LOD pela concentração correspondente quando a relação sinal-ruído (S/N) = 3.
2. Determinar o LOQ pela concentração correspondente quando a S/N = 10.

10. Determinação do teor de TMA da amostra

1. Pegue cerca de 1 g de pó fino de Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo , respectivamente, extraia a amostra de acordo com o método acima e determine-a na máquina.

Resultados

Diagramas esquemáticos do princípio de pré-processamento e operação deste protocolo são mostrados na Figura 1 e na Figura 2, respectivamente. O tempo de pico da MAT foi de 2,3 min, com forma acentuada do pico e sem interferência de outras impurezas (Figura 3). Medindo-se a faixa linear de 0,1-10 μg/mL de solução padrão de TMA, com concentração de TMA como abscissa e área de pico como ordenada, uma curva padrão foi tra...

Discussão

Os medicamentos de origem animal provêm de todo o corpo, órgãos ou tecidos, produtos fisiológicos ou patológicos, excreções ou secreções e produtos transformados de animais. A TMA é uma importante fonte de odor de peixe em medicamentos derivados de animais; é uma substância malcheirosa típica com um limiar olfatório muito baixo (0,000032 × ^10-6 V/V) e um forte odor de peixe¹³. Atualmente, o método HS-GC-MS comumente usado não pode detectar TMA em medicamentos derivados ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter Trading (China) Co.	SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder	Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory	HX-200K
Convection oven	Sanyo Electric Co., Ltd	MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	V1750004
Electronic balance	Shimadzu Corporation Japan	AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry	Shimadzu Corporation Japan	TQ-8050 NX
Headspace Vial	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	25760200
Homogenizer	Shanghai biaomo Factory	FJ200-SH
Preassembled Cap	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	L4150050
Sample sieve	Zhenxing Sieve Factory	/
SH-Volatile Amine	Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd	227-3626-01
Sodium hydroxide	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022101401
Solid paraffin wax	Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory	20221112
Trichloroacetic acid	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022102001
Trimethylamine hydrochloride	Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd	AF22022108
Ultra-pure water system	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd	UPR-11-5T