تقييم تأثير مبيد الحشرات للفطريات المسببة للأمراض الحشرية ضد الحشرات العذرية ، من الخردل ، Lipaphis erysimi (Kalt.)

Cheng-Ju Yang; Yu-Shin Nai

doi:10.3791/65312

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يقدم هذا البروتوكول نظام فحص حيوي محسن للأوراق المنفصلة لتقييم فعالية الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) ضد من الخردل (Lipaphis erysimi (Kalt.)) ، وهي حشرة بارثينوجينية. تحدد الطريقة عملية جمع البيانات أثناء تجارب طبق بتري ، مما يمكن الباحثين من قياس ضراوة EPF باستمرار ضد حشرات المن الخردل والحشرات البارثينوجينية الأخرى.

Abstract

من الخردل (L. erysimi) هو آفة تصيب العديد من المحاصيل الصليبية وتنقل فيروسات النبات. لتحقيق إدارة الآفات الصديقة للبيئة ، تعد الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) عوامل محتملة لمكافحة الميكروبات للسيطرة على هذه الآفة. لذلك ، فإن فحص الفوعة لعزلات EPF تحت ظروف طبق بتري ضروري قبل التطبيق الميداني. ومع ذلك ، فإن من الخردل هو حشرة بارثينوجينية ، مما يجعل من الصعب تسجيل البيانات أثناء تجارب طبق بتري. تم تطوير نظام معدل للمقايسات الحيوية للأوراق المنفصلة لمعالجة هذه المشكلة ، باستخدام بخاخ دقيق لتلقيح الكونيديا على حشرات المن ومنع الغرق عن طريق تسهيل تجفيف الهواء بعد تعليق البوغ. حافظ النظام على رطوبة نسبية عالية طوال فترة المراقبة ، وظل قرص الأوراق طازجا لأكثر من عشرة أيام ، مما سمح بالتكاثر الجيني لحشرات المن. لمنع تراكم النسل ، تم تنفيذ عملية إزالة يومية باستخدام فرشاة الطلاء. يوضح هذا البروتوكول نظاما مستقرا لتقييم ضراوة عزلات EPF ضد حشرات المن الخردل أو حشرات المن الأخرى ، مما يتيح اختيار العزلات المحتملة لمكافحة المن.

Introduction

من الخردل (L. erysimi) هو آفة سيئة السمعة تصيب مجموعة متنوعة من المحاصيل الصليبية ، مما يتسبب في خسائر اقتصادية كبيرة¹. في حين تمت التوصية بالعديد من المبيدات الحشرية المنهجية لمكافحة تفشي حشرات المن ، فإن الاستخدام المتكرر لهذه المبيدات الحشرية يثير مخاوف بشأن مقاومة مبيدات الآفات ^2,3. لذلك ، من حيث إدارة الآفات الصديقة للبيئة ، يمكن أن تكون الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) بمثابة استراتيجية مكافحة بديلة مناسبة. EPF هو أحد مسببات الأمراض الحشرية التي لديها القدرة على إصابة المضيفين عن طريق اختراق بشرتهم ، مما يجعلها عاملا قويا للسيطرة على حشرات المن والحشرات الأخرى الماصة للنبات⁴. علاوة على ذلك ، أثبت EPF أنه تقنية مجدية ومستدامة لإدارة الآفات ، حيث يقدم فوائد مثل تعارض مسببات الأمراض النباتية وتعزيز نمو النبات⁵.

يمكن الحصول على EPF من خلال اصطياد الحشرات والتربة أو عزلها من جثث الحشرات في الحقل ^6,7. ومع ذلك ، قبل الاستخدام الإضافي للعزلات الفطرية ، من الضروري فحص الإمراضية. تم إجراء العديد من الدراسات حول فعالية EPF ضد حشرات المن ، وهي آفات محصولية كبيرة يمكن أن تسبب أضرارا جسيمة ^8,9. تم اختبار حشرات المن الخردل ، من بين أنواع مختلفة من حشرات المن ، للتأكد من قابليتها لعدة سلالات من Beauveria spp. ، Metarhizium spp. ، Lecanicillium spp. ، Paecilomyces spp. ، وحتى Alternaria ، والتي تعرف في المقام الأول باسم الفطريات المسببة للأمراض النباتية والنباتية ولكنها أظهرت بعض الآثار المميتة ضد حشرات الخردل¹⁰،¹¹^،¹².

لتقييم فعالية EPF ضد حشرات المن في ظل ظروف المختبر ، يمكن تقسيم المقايسات الحيوية إلى قسمين رئيسيين: غرفة التلقيح والتلقيح الفطري. يصف البروتوكول الحالي بناء غرفة التلقيح ، حيث يمكن الحفاظ على حشرات المن باستخدام طرق مختلفة مثل ورقة مستأصلة مع سويقات ملفوفة بالقطن الرطب ، أو قرص أوراق مستأصل مع طبق بتري مبطن بورق ترشيح مبلل ، أو الصيانة المباشرة على نباتات الأواني ، أو قرص أوراق مستأصل مضمن في أجار الماء داخل طبق أو حاوية بتري¹⁰ ^،^11,13. تشمل الطرق الشائعة للتلقيح الفطري رش الكونيديا ، وغمر المن في تعليق الكونيديا ، وغمس الأوراق في تعليق الكونيديا ، وتلقيح النباتات الداخلية¹¹،¹⁴،¹⁵^،¹⁶. على الرغم من وجود طرق تلقيح مختلفة ، يجب أن تحاكي المقايسات الحيوية ظروف التطبيق الميداني. على سبيل المثال ، في حالة طريقة غمس الأوراق^12,17 ، يمكن تقييم كفاءة EPF ، ولكن نظرا لأن حشرات المن تصيب الأوراق المحملة بالفطريات ، فإن الجانب الظهري من المن ، وهو موقع اختراق تفضيلي ، لا يتعرض عادة للفطريات.

لتقييم تأثير مبيد الحشر ل EPF في ظل ظروف المختبر ، يقترح هذا البروتوكول استخدام طريقة الأوراق المنفصلة التي وصفها Yokomi و Gottwald¹⁸ مع بعض التعديلات ، متبوعة بتلقيح الكونيديا باستخدام بخاخ صغير. تحافظ هذه الطريقة على رطوبة 100٪ تقريبا في غرفة الفحص الحيوي لمدة سبعة أيام على الأقل دون الحاجة إلى تجديد إضافي للمياه^18,19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حصر حشرات المن على سطح واحد يضمن تعرضها لرش الكونيديا ويسهل الملاحظات²⁰. ومع ذلك ، قد تعلق حشرات المن في سطح أجار المكشوف أثناء التحرك داخل غرفة التلقيح. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون تسجيل البيانات في تجربة طبق بتري مع حشرات الخردل ، وهي حشرات بارثينوجينية ، أمرا صعبا بسبب تطورها وتكاثرها السريع. من الصعب التمييز بين البالغين الملقحين وذريتهم دون إزالة. نادرا ما يتم ذكر تفاصيل كيفية المضي قدما في هذه الخطوة ، ويجب تحسين بعض العوامل غير المتسقة ، مثل منطقة استهلاك الأوراق.

يوضح هذا البروتوكول نظاما مستقرا لفحص ضراوة عزلات EPF ضد حشرات من الخردل ، مما يتيح اختيار العزلات المحتملة ضد أنواع مختلفة من المن من مكتبة EPF واسعة النطاق. يمكن تحديد حشرات المن التي تم جمعها ميدانيا ، ويمكن إنشاء مجموعة مختبرية كافية من حشرات من الخردل لتقييم التأثير القاتل لمختلف العزلات الفطرية باستخدام منهجية سهلة ومجدية مع نتائج متسقة. طورت حشرات المن آليات تطورية متعددة استجابة للضغوط البشرية الشديدة والمتكررة في النظم الإيكولوجية الزراعية ، مما يشكل تحديات للأمن الغذائي⁹. لذلك ، يمكن توسيع هذه الطريقة الموصوفة لتقييم عزلات EPF المحتملة ضد أنواع مختلفة من المن.

Protocol

ملاحظة: يظهر المخطط الانسيابي الكامل في الشكل 1.

1. جمع وصيانة الخردل المن

مجموعة من حشرات الخردل
1. اقلب الأوراق وتحقق بصريا من إصابة حشرات الخردل على المحاصيل الصليبية في الحقل.
2. تسجيل معلومات موقع أخذ العينات (أي GPS) والنبات (النباتات) المضيفة، وتأكيد تاريخ استخدامات المبيدات الحشرية مع المزارعين.
3. استخدم شفاط الحشرات أو فرشاة الطلاء الدقيقة (انظر جدول المواد) لجمع حوالي 50 حشرة من الخردل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل من المحاصيل الصليبية في الحقل وإحضار العينة إلى المختبر في غضون 3 ساعات.
4. قم بإعداد طبق بتري مؤقت للصيانة بأوراق صليبية مستأصلة وورق ترشيح متسلل بالماء في الأسفل.
5. ضع حشرات المن الخمسة على طبق بتري للصيانة المؤقتة تحت درجة حرارة الغرفة (25 ± 2 درجة مئوية) مع رطوبة نسبية تبلغ 70٪ و 12:12 ساعة (فاتح: داكن) فترة ضوئية لمدة 14 يوما للتأكد من أن المن يجنب العدو الطبيعي خاليا من العدو قبل مزيد من التربية.
  ملاحظة: لضمان خلو حشرات المن التي تم جمعها ميدانيا من الأعداء الطبيعيين مثل الدبابير الطفيلية أو الفطريات المسببة للأمراض الحشرية ، من الأهمية بمكان تأكيد عدم وجود هذه الكائنات قبل الشروع في مزيد من التربية.
الحفاظ على حشرات الخردل
ملاحظة: للحفاظ على حشرات من الخردل ، استخدم الأوراق الصليبية الخالية من المبيدات الحشرية (بما في ذلك المبيدات الحيوية).
1. توفير إمدادات مستقرة وكافية من الأوراق الصليبية (حوالي 25 سم²).
  ملاحظة: احصل على الأوراق الصليبية إما من السوق أو ازرع النباتات. قبل التربية الضخمة طويلة الأجل لحشرات الخردل ، يمكن اختبار عدة أنواع مختلفة من الصليب للعثور على صليب مناسب. بمجرد إصلاح أنواع الورقة الصليبية ، لا تغيرها. في هذه الدراسة ، تم استخدام Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) في مرحلة 6-7 أوراق (انظر جدول المواد). بالإضافة إلى ذلك ، تخلص من أقدم 2-3 أوراق.
2. أضف الماء قبل أن يجف ورق الترشيح في الأسفل تماما.
3. مراقبة الكثافة السكانية من الخردل المن. يجب أن ينمو عدد السكان إلى 2-3 أضعاف بعد 7 أيام.
4. عندما يزداد عدد حشرات المن ، قم بقطع الأوراق المستأصلة أصلا مع حشرات الخردل إلى 4-6 قطع أصغر وضع كل قطعة صغيرة من الأوراق مع حشرات الخردل في طبق بتري واحد مع أوراق مستأصلة طازجة وورق ترشيح مخترق بالماء.
5. ضع طبق بتري في حاضنة عند 25 درجة مئوية مع فترة ضوئية 12:12 ساعة (فاتح: داكن) ولاحظ الكثافة السكانية لحشرات من الخردل يوميا.
6. قم بإزالة الأوراق الأصلية المستأصلة بعد أن تهاجر معظم حشرات المن إلى الأوراق المستأصلة الطازجة قبل أن تتعفن الأوراق الأصلية.

2. التحديد الجزيئي لمن الخردل

ملاحظة: لتأكيد أنواع من من الخردل الذي تم جمعه ميدانيا ، تم إجراء التحديد الجزيئي باستخدام علامتين جزيئيتين: المنطقة المضخمة المميزة للتسلسل (SCAR) المستندة إلى A05Le التي صممها Lu et ^al.21 ، والوحدة الفرعية 1 (COI) من الخردل من السيتوكروم أوكسيديز المنطقة من الخردل.

استخراج الحمض النووي الجينومي لمن الخردل
1. اجمع ما يقرب من 50 حشرة من حشرات المن في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  ملاحظة: يجب أن تكون حشرات المن المستخدمة في التحديد الجزيئي من نسل حشرة من واحدة ، ويمكن أيضا تجميع مراحل مختلفة في نفس الأنبوب لاستخراج الحمض النووي.
2. قم بتجانس حشرات المن باستخدام مدقة بيليه واستخرج الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجينومي Gene-Spin باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
3. تخلص من الحمض النووي الجينومي ب 50 ميكرولتر من الماء المسخن مسبقا والخالي من النيوكلياز.
تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الحمض النووي
1. تضخيم تسلسل الحمض النووي المستهدف من الحمض النووي الجينومي للمن باستخدام PCR Master Mix (2x) مع أزواج التمهيدي A05LeF / A05LeR و LeCO1F / LeCO1R (الجدول 1) مع برامج PCR مختلفة²¹.
  ملاحظة: يتكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر من قالب الحمض النووي الجينومي 2 ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر أمامي و 1 ميكرولتر بادئات عكسية ، و 10 ميكرولتر PCR Master Mix (انظر جدول المواد) ، و 6 ميكرولتر ddH₂O.
2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في دورة حرارية (انظر جدول المواد) مع البرنامج التالي: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 25 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، 61 درجة مئوية (ل A05LeF / A05LeR) و 58 درجة مئوية (ل LeCO1F / LeCO1R) لمدة 45 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، متبوعة بتمديد نهائي 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. قم بتحليل منتج PCR بنسبة 1٪ من هلام الأغاروز الكهربائي لتأكيد هوية من الخردل (الشكل 2).
  ملاحظة: إذا نجح الزوج التمهيدي A05LeF / A05LeR في تضخيم الحجم الصحيح لجزء الحمض النووي ، فقد حدد بشكل مقنع المن الذي تم جمعه ميدانيا على أنه من الخردل²¹. يتم سرد أزواج التمهيدي في الجدول 2.
4. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لأمبليكون COI من الخردل باستخدام مجموعة هلام / تفاعل البوليميراز المتسلسل المتاحة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) ، وقم بتسلسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام خدمة التسلسل التجاري.
تحليل التسلسل
ملاحظة: وفقا ل Lu et ^al.21 ، فإن ثني الحمض النووي ل A05Le هو جزء من الحمض النووي الخاص بمن الخردل. لذلك ، لا يحتاج منتج A05Le PCR إلى مزيد من التسلسل.
1. تحقق من جودة القراءة بواسطة برنامج Chromas (انظر جدول المواد) بعد الحصول على تسلسل LeCO1.
2. قم بقص عمليات القراءة منخفضة الجودة في المنبع والمصب عن طريق فتح ملف fasta (أو txt) وإزالة القراءات منخفضة الجودة مباشرة.
3. أرسل التسلسل المقتطع إلى NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) باستخدام المعلمات الافتراضية.
  ملاحظة: إذا كانت أحجام amplicon لمجموعات التمهيدي A05Le و LeCO1 صحيحة ، من الناحية النظرية ، يجب أن يتطابق بحث انفجار التسلسل مقابل قواعد البيانات القياسية NCBI مع من الخردل.

3. إعداد الفطريات المسببة للأمراض الحشرية

ملاحظة: يرد في الجدول 1 قائمة بمعامل ادخار البرامج المستخدم في هذه الدراسة.

استعادة EPF من مكتبة الفطرية
1. قم بإذابة مخزون الفطريات المحفوظة (كونيديا معلقة في 30٪ جلسرين) من الفريزر -80 درجة مئوية.
2. انقل كمية صغيرة (حوالي 10 ميكرولتر) من معلق الكونيديا إلى 6 سم 1/4 صفيحة سابورود دكستروز أجار (SDA) (0.75 جم من مرق سكر العنب Sabouraud مع 1.5 جم أجار لكل 100 مل ddH₂O) وانشرها بالتساوي باستخدام مفرشة الخلايا في غطاء التدفق الصفحي.
3. ختم طبق بتري مع فيلم البارافين ، واحتضانه في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما.
4. أعد زراعة العزلات الفطرية عن طريق وضع كتلة فطرية على صفيحة SDA واحتضان الفطريات في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما قبل حصاد الكونيديا²².
  ملاحظة: يجب استخدام الثقافة الفطرية قبل 10 أيام تقريبا من تلقيح حشرات المن. لا ينصح باستخدام ثقافة EPF التي يزيد عمرها عن 14 يوما في اختبار الفوعة.
إعداد تعليق كونيديا
1. اكشط الكونيديا من الثقافة الفطرية التي يبلغ عمرها 10-14 يوما على لوحة 1/4 SDA عن طريق تلقيح الحلقة بعد إضافة 2-3 مل 0.03٪ توين 80 (انظر جدول المواد).
2. جمع التعليق الفطري في أنبوب الطرد المركزي.
3. دوامة الحل بأعلى سرعة ، احسب عدد الكونيديا باستخدام مقياس الدم تحت المجهر الضوئي ، واضبط تركيز تعليق الكونيديا إلى 10⁸ كونيديا / مل.
4. نقل تعليق الكونيديا إلى بخاخ صغير معقم بالأشعة فوق البنفسجية.
  ملاحظة: دوامة تعليق الكونيديا مرة أخرى قبل نقلها ، حيث أن الكونيديا عرضة للترسب. يجب أن يتعرض البخاخ الصغير للأشعة فوق البنفسجية في غطاء التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.

4. فحص الفوعة ضد من الخردل

إعداد البالغين الناشئين حديثا
1. انقل البالغين (بدون جناح) و alate (مجنح) من طبق بتري الذي يتم تربيته إلى الأوراق المستأصلة حديثا لإعادة إنتاج ذرية جديدة من نفس العمر. قم بإزالة البالغين بعد 24 ساعة لتجنب الاكتظاظ وتقليل إنتاج ذرية alated^23,24. سيتم استخدام البالغين فقط في مزيد من التجارب.
2. قم بإرجاع النسل إلى مرحلة البلوغ وإزالة النسل الذي لا يتطور إلى مرحلة البلوغ بعد 48 ساعة (الشكل 3) لمنع اختلاف العمر بين حشرات المن للتجربة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإزالة البالغين المرتبطين.
إعداد غرفة التلقيح
ملاحظة: يوصى بإعداد الأوراق الصليبية بقطر 9 سم أولا ، بحيث يمكن تضمين قرص الورقة في أجار الماء قبل التصلب.
1. نظف الأوراق الصليبية بماء الصنبور ، وأزل الأوساخ والبقايا ، وأي مفصليات أخرى إن وجدت.
2. امسح أي ماء زائد بمنشفة ورقية وتحقق من وجود أي مفصليات أخرى على سطح الأوراق الصليبية باستخدام مجهر مجسم. إزالة أي مفصليات إذا كانت موجودة.
3. قطع قرص ورقة قطرها 9 سم إما عن طريق الضغط مباشرة على طبق بتري السفلي على الورقة كقالب أو باستخدام مقص.
  ملاحظة: إذا كان قطر الأوراق أصغر من 9 سم ، فقم بدمج بضع أوراق مستأصلة.
4. تحضير 1.5٪ أجار ماء لكل طبق بتري عن طريق تسخين وإذابة 450 مجم من أجار (انظر جدول المواد) في 30 مل ddH₂O باستخدام الميكروويف.
  ملاحظة: يمكن تعديل كمية أجار الماء بنسبة 1.5٪ اعتمادا على مقياس التجربة.
5. صب 30 مل من 1.5٪ أجار ماء في طبق بتري 9 سم قبل التصلب في غطاء التدفق الصفحي ، ثم انتظر حتى يبرد الآجار إلى ~ 40 درجة مئوية حتى يصبح سطح الآجار شبه صلب.
  ملاحظة: تحقق مما إذا كان السطح شبه صلب عن طريق هز طبق بتري أفقيا برفق.
6. ضع قرص الورقة ، السطح المحوري لأعلى ، أعلى أجار الماء ، وقم بتضمين قرص الورقة في الأجار.
  ملاحظة: قلل من تعرض سطح أجار.
7. بعد أن يصلب أجار الماء تماما ، أغلق غطاء طبق بتري.
  ملاحظة: افتح الغطاء لتبخير الماء إذا تكثفت الكثير من القطرات على الغطاء على الفور.
8. ضع 20 شخصا بالغا على قرص الورقة.
  ملاحظة: يوصى بالعمل تحت المجهر المجسم لمنع تلف أجزاء الفم.
تلقيح EPF ومراقبته
1. افتح غطاء غرفة التلقيح ورش 0.3 مل من تعليق الكونيديا (من الخطوة 3.2) مباشرة على حشرات المن وقرص الأوراق من حوالي 15 سم فوق قرص الورقة.
  ملاحظة: دوامة تعليق كونيديا مرة أخرى قبل الرش. يجب اختبار مناطق الرش قبل التجربة لأنها يمكن أن تختلف بين الرشاشات المختلفة. في هذه الحالة ، يوصى باستخدام 0.3 مل بمسافة 15 سم. يجب أن تغطي منطقة الرش قرص الورقة بالكامل ، ويجب أن تغطي طبقة رقيقة من تعليق الكونيديا قرص الورقة. إذا تقاربت القطرات في الماء الراكد على الورقة ، فيجب تقليل حجم التلقيح. نظف الطاولة بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل التلقيح وبين استخدام عزلات مختلفة.
2. انتظر حتى يجف تعليق الكونيديا ، ثم أغلق الغطاء لمنع حشرات المن الخردل من الغرق.
  ملاحظة: نادرا ما تتجول حشرات المن أثناء التجربة. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري ضمان عدم هروب حشرات المن.
3. أغلق غرفة التلقيح بغشاء البارافين للحفاظ على رطوبة نسبية عالية وضع غرفة التلقيح في حاضنة عند 25 درجة مئوية مع فترة ضوئية 12:12 ساعة (فاتح: داكن).
4. افتح غطاء غرفة التلقيح لحساب الوفيات تحت المجهر المجسم كل 12 ساعة لمدة 5 أيام.
5. امسح المن الملتصق بالغطاء بمنشفة ورقية وقم بإزالة حشرات المن التي ظهرت حديثا بفرشاة طلاء دقيقة. نظف الغطاء بماء الصنبور كل 24 ساعة.
  ملاحظة: قد تختلف فترة المراقبة باختلاف أنواع حشرات المن بناء على طول عمر البالغين.
6. احتفظ بالجثة على قرص الورقة للفطار لتأكيد التلقيح الناجح.
تأكيد معدل إنبات الكونيديا
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. لتأكيد معدل إنبات الكونيديا زوجيا عند إجراء فحص الفوعة لضمان نشاط كونيديا.
1. قم بإسقاط قطرة واحدة من تعليق كونيديا 5 ميكرولتر على 1/4 SDA لثلاث نسخ مكررة.
2. بعد 18 ساعة ، احسب معدل الإنبات باستخدام المجهر الضوئي. عد ما لا يقل عن 100 جراثيم بشكل عشوائي في قطرة واحدة لتأكيد معدل الإنبات الفطري.
  ملاحظة: عادة ، يجب أن يكون معدل إنبات العزلات المستخدمة في التجربة أعلى من 90٪.

5. المقايسة الحيوية لعزلات EPF المختارة

ملاحظة: خضعت عزلات EPF التي أظهرت ضراوة عالية ، والتي تم اختيارها من الخطوة 4 ، لمقايسة حيوية ضد حشرات من الخردل باستخدام أربعة تركيزات من معلقات الكونيديا (تتراوح من 10⁴ إلى 10⁷ كونيديا / مل).

إعداد تعليق كونيديا
1. كرر الخطوة 3.1 لاستعادة عزلات EPF المحددة.
2. كرر الخطوة 3.2 لتحضير أربعة تركيزات من معلق الكونيديا ، بما في ذلك 10⁴ و 10⁵،10⁶ و 10⁷ كونيديا / مل.
إعداد البالغين الناشئين حديثا
1. كرر الخطوة 4.1 لإعداد البالغين الناشئين حديثا.
إعداد غرفة التلقيح
1. كرر الخطوة 4.1. لإعداد غرفة التلقيح.
تلقيح EPF ومراقبته
1. كرر الخطوة 4.3. لإجراء تلقيح EPF والمراقبة مع التركيزات الأربعة لتعليق كونيديا ، على التوالي.

6. التحليل الإحصائي

حساب معدل الوفيات المصحح
1. احسب معدل الوفيات المصحح باستخدام صيغة^{أبوت 25} ، كما هو موضح أدناه:
  معدل الوفيات المصحح (٪) = [(M_T− M C) × 100٪] / (100− M_C)
  يمثل M_T معدل وفيات مجموعة العلاج ، ويمثل M_C معدل وفيات المجموعة الضابطة.
  ملاحظة: يجب ألا يزيد معدل وفيات المجموعة الضابطة عن 20٪.
2. افتح منصة برنامج SPSS (انظر جدول المواد) ، وقم بإنشاء متغيرات بما في ذلك "العلاج" و "cor_mor" (تمثل الوفيات المصححة) ، وأدخل النتائج المحسوبة لتلقيح العزلات المختلفة في نفس النقطة الزمنية بنفس التركيز الملقح.
3. حدد تحليل ، مقارنة الوسائل والنسب ، اختبار t للعينات المستقلة في SPSS لتحليل اختبار t المستقل.
4. في SPSS ، أدخل المعالجة في مربع "تجميع المتغيرات" ، cor_mor في "متغير (متغيرات) الاختبار". تحديد المجموعات بواسطة عزلات فطرية مختلفة. اضغط على موافق للتحليل.
حساب متوسط الوقت المميت (LT 50) ومتوسط التركيز المميت (LC₅₀)
1. افتح SPSS ، وأنشئ المتغيرات "الإجمالي" و "الاستجابة" و "المدة" / "التركيز" ، وأدخل النتيجة المسجلة في جدول البيانات.
2. حدد تحليل ، انحدار ، Probit في SPSS لحساب LT 50 و / أو LC₅₀.
  ملاحظة: إذا لم يتجاوز معدل الوفيات التراكمي 50٪ في النهاية ، فلا يمكن تقدير LT 50 و / أو LC₅₀.
3. أدخل الإجمالي في مربع "إجمالي الملاحظات" ، والاستجابة في مربع "تردد الاستجابة" ، والمدة / التركيز في مربع "المتغير (المتغيرات)". اضغط على موافق للتحليل.
  ملاحظة: بشكل عام ، اضغط على الخيارات واضبط "مستوى الأهمية لاستخدام عامل عدم التجانس" على 0.05.

النتائج

يوضح المخطط الانسيابي المقدم الحالة المستقرة لحشرات من الخردل من الجمع الميداني إلى فحص الفوعة. ضمنت صيانة حشرات المن من الجمع الميداني زيادة مستقرة في مستعمرات المن مع إمدادات غذائية كافية. تم تأكيد حشرات المن التي تم جمعها ميدانيا على أنها حشرات من الخردل من خلال استخدام العلامات الجزي...

Discussion

كثيرا ما تنتشر أنواع متعددة من المن ، بما في ذلك من الخردل (L. erysimi) ومن الملفوف (Brevicoryne brassicae)²⁶. تم الإبلاغ عن كلا النوعين في تايوان²⁷ ، ومن الممكن أن يتعايشا في موقع التجميع. للتمييز بين أنواع المن وثيقة الصلة ، استخدمت هذه الدراسة تقنية تحديد الهوية الجزيئي...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل 109-2313-B-005 -048 -MY3 من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Inoculating Loop	NEST Scientific	718201
100 bp DNA Ladder III	Geneaid	DL007
2x SuperRed PCR Master Mix	Biotools	TE-SR01
50 mL centrifuge tube	Bioman Scientific	ET5050-12
6 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16021
6 mm insect aspirator	MegaView Science	BA6001
70 mm filter paper NO.1	Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16001
Agar	Bioman Scientific	AGR001.1	Microbiology grade
Agarose	Bioman Scientific	PB1200
BioGreen Safe DNA Gel Buffer	Bioman Scientific	SDB001T
Chromas	Technelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR Kit	Geneaid	DFH300	https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit	Protech Technology	PT-GD112-V3	http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
Hemocytometer	Paul Marienfeld	640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)	Tai Cheng Farm	1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brush	Tian Cheng brush company	4716608400352
Parafilm M	Bemis	PM-996
Pellet pestle	Bioman Scientific	GT100R
Sabouraud Dextrose Broth	HiMedia	MH033-500G
SPSS Statistics	IBM
TAE buffer 50x	Bioman Scientific	TAE501000
Tween 80	PanReac AppliChem	142050.1661

References

Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Lipaphis erysimi EPF

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: