単為生殖昆虫、カラショウアブラムシ、 Lipaphis erysimi (Kalt.)

要約

このプロトコルはマスタードアブラムシ(Lipaphis erysimi (Kalt.))、単為生殖の昆虫に対する昆虫病原性の菌類(EPF)の有効性を評価するための最大限に活用された一戸建ての葉の生物検定システムを示す。この手法は、ペトリ皿実験中のデータ収集プロセスの概要を示しており、研究者はマスタードアブラムシやその他の単為生殖昆虫に対するEPFの病原性を一貫して測定することができます。

要約

カラシナアブラムシ(L. erysimi)は、さまざまなアブラナ科の作物に寄生し、植物ウイルスを媒介する害虫です。環境にやさしい病害虫管理を実現するために、昆虫病原性真菌(EPF)は、この害虫を防除するための微生物防除剤として期待されています。したがって、ペトリ皿条件下でのEPF分離株の病原性スクリーニングは、フィールドアプリケーションの前に必要です。しかし、カラシナアブラムシは単為生殖性の昆虫であるため、ペトリ皿実験中のデータ記録は困難です。この問題に対処するために、マイクロ噴霧器を使用してアブラムシに分生子を接種し、胞子懸濁後の自然乾燥を容易にすることで溺死を防ぐという、分離葉バイオアッセイ用の改良システムを開発しました。観察期間中、高い相対湿度が保たれ、葉の円盤は10日以上新鮮に保たれ、アブラムシの単為生殖が可能であった。子孫の蓄積を防ぐために、ペイントブラシを使用して毎日除去するプロセスが実施されました。このプロトコルは、マスタードアブラムシまたは他のアブラムシに対してEPF分離株の病原性を評価するための安定したシステムを実証し、アブラムシ防除のための潜在的な分離株の選択を可能にします。

概要

カラシナアブラムシ(L. erysimi)は、さまざまなアブラナ科作物に蔓延し、重大な経済的損失を引き起こす悪名高い害虫です¹。アブラムシの蔓延と戦うためにいくつかの体系的な殺虫剤が推奨されていますが、これらの殺虫剤の頻繁な使用は、農薬耐性に関する懸念を引き起こします^2,3。したがって、環境に優しい害虫管理の観点から、昆虫病原性真菌(EPF)は適切な代替防除戦略として役立つ可能性があります。EPFは、宿主のクチクラを貫通して感染する能力を持つ昆虫病原体であり、アブラムシやその他の植物吸引昆虫を駆除するための強力な薬剤となっています⁴。さらに、EPFは実行可能で持続可能な害虫管理技術であることが証明されており、植物病原菌拮抗作用や植物の成長促進などの利点を提供します⁵。

EPFは、昆虫と土壌の餌付けによって得るか、または野外で昆虫の死体から単離することができる^6,7。ただし、真菌分離株をさらに使用する前に、病原性スクリーニングが必要です。深刻な被害を引き起こす可能性のある重大な作物害虫であるアブラムシに対するEPFの有効性について、いくつかの研究が行われています^8,9。マスタードアブラムシは、アブラムシのさまざまな種の中で、Beauveria spp.、Metarhizium spp.、Lecanicillium spp.、Paecilomyces spp.、さらには主に腐生性および植物病原性真菌として知られているが、マスタードアブラムシに対していくつかの致命的な影響を示しているAlternariaのいくつかの株に対する感受性についてテストされています10,11,12。

実験室条件下でアブラムシに対するEPFの有効性を評価するために、バイオアッセイは、接種チャンバーと真菌接種の2つの主要な部分に分けることができます。現在のプロトコルは、湿った綿で包まれた葉柄で切除された葉、湿った濾紙で裏打ちされたペトリ皿を備えた切除された葉の円盤、鉢植えの植物の直接メンテナンス、またはペトリ皿または容器内の水寒天に埋め込まれた切除された葉の円盤などのさまざまな方法を使用してアブラムシを維持できる接種チャンバーの構築を説明しています^10。 11^、13。真菌接種の一般的な方法には、分生子の散布、分生子懸濁液へのアブラムシの浸漬、分生子懸濁液への葉の浸漬、および植物内生菌接種が含まれます11,14,15,16。さまざまな接種方法がありますが、バイオアッセイはフィールドアプリケーション条件をシミュレートする必要があります。例えば、葉浸漬法^12,17の場合、EPFの効率は評価できるが、アブラムシは菌を積んだ葉に寄生するため、優先侵入部位であるアブラムシの背側は、通常、真菌に曝露されない。

実験室条件下でEPFの殺虫効果を評価するために、このプロトコルは、YokomiとGottwald¹⁸によって記述されている分離葉法を使用し、いくつかの修正を加え、マイクロ噴霧器を使用して分生子を接種することを提案しています。この方法は、バイオアッセイチャンバー内の湿度を少なくとも7日間、水の追加補充を必要とせずに約100%に維持する^18,19。さらに、アブラムシを1つの表面に閉じ込めることで、分生子散布への曝露が保証され、観察が容易になります²⁰。しかし、アブラムシは接種室内を移動している間に露出した寒天表面に引っかかってしまうことがあります。さらに、単為生殖の昆虫であるカラシナアブラムシのペトリ皿実験でのデータ記録は、発生と繁殖が速いため、困難な場合があります。接種した成体とその子孫を除去せずに区別することは困難です。このステップの進め方の詳細が言及されることはめったになく、葉の消費面積など、いくつかの一貫性のない要因を最適化する必要があります。

このプロトコルは、マスタードアブラムシに対してEPF分離株の病原性をスクリーニングするための安定したシステムを示しており、広範なEPFライブラリからさまざまなアブラムシ種に対して潜在的な分離株の選択を可能にします。野外で採取されたアブラムシを同定し、マスタードアブラムシの十分な実験室集団を確立して、一貫した結果をもたらす簡単で実行可能な方法論を使用して、さまざまな真菌分離株のアブシド効果を評価することができます。アブラムシは、農業生態系における強烈かつ繰り返される人為的圧力に反応して複数の進化メカニズムを発達させており、食料安全保障に課題をもたらしている⁹。したがって、この記載された方法は、さまざまなアブラムシ種に対する潜在的なEPF分離株を評価するために拡張できます。

プロトコル

メモ: 完全なフローチャートを 図 1 に示します。

1.マスタードアブラムシの収集とメンテナンス

1. カラシナアブラムシのコレクション
   1. 葉をひっくり返して、畑のアブラナ科作物にカラシナアブラムシが蔓延していないかを目視で確認します。
   2. サンプリング場所の情報(GPSなど)と宿主植物を記録し、殺虫剤の散布履歴を農家に確認します。
   3. 昆虫吸引器または細い塗装ブラシ( 材料表を参照)を使用して、圃場のアブラナ科作物から約50匹のマスタードアブラムシを50 mLの遠心分離管に集め、3時間以内にサンプルを実験室に運びます。
   4. アブラナ科の葉を切り取り、底に水を浸透させたろ紙を入れた一時的なメンテナンスペトリ皿を準備します。
   5. 5匹のアブラムシを室温(25±2°C)、相対湿度70%、12:12時間(明暗)の日長で14日間、アブラムシが天敵にならないことを確認してから飼育する。
      注:野外で採集されたアブラムシに寄生バチや昆虫病原菌などの天敵がいないことを確認するためには、飼育を進める前にこれらの生物がいないことを確認することが重要です。
2. カラシナアブラムシの維持
   注:マスタードアブラムシを維持するには、無農薬(生物農薬を含む)のアブラナ科の葉を使用してください。
   1. アブラナ科の葉(約25 cm²)を安定して十分な供給を提供します。
      注:アブラナ科の葉は市場から入手するか、植物を育てます。カラシナアブラムシの長期にわたる大量飼育の前に、いくつかの異なる種類のアブラナ科植物をテストして、適切なアブラナ科を見つけることができました。アブラナ科の葉の種が決まったら、それを変更しないでください。本研究では、6-7葉期の小松菜(Brassica rapa var. perviridis)を用いた( 資料表参照)。さらに、2〜3枚の最も古い葉を処分します。
   2. 底のろ紙が完全に乾く前に水を加えます。
   3. マスタードアブラムシの個体数密度を毎日観察します。人口は7日後に2〜3倍に増加するはずです。
   4. アブラムシの数が増えたら、マスタードアブラムシで最初に切除した葉を4〜6個の小さな小片に切り、マスタードアブラムシを含む小さな葉片を、新鮮な切り取った葉と水を浸透させたろ紙で1つのペトリ皿に入れます。
   5. ペトリ皿を25°Cのインキュベーターに12:12時間(明:暗)の日長で入れ、マスタードアブラムシの個体数密度を毎日観察します。
   6. 元の葉が腐る前に、ほとんどのアブラムシが新鮮な切除された葉に移動した後、元の切除された葉を取り除きます。

2. カラシナアブラムシの分子同定

注:野外で採集されたマスタードアブラムシの種を確認するために、分子同定は、Luらによって設計された配列特性増幅領域(SCAR)ベースのA05Le^{と、マスター}ドアブラムシのマスタードアブラムシシトクロムオキシダーゼサブユニット1(COI)領域の2つの分子マーカーを使用して行われました。

1. カラシナアブラムシゲノムDNAの抽出
   1. 約50匹のアブラムシを1.5 mLの遠心チューブに集めます。
      注:分子同定に使用されるアブラムシは、1つのアブラムシの子孫である必要があり、DNA抽出のためにさまざまな段階を同じチューブにプールすることもできます。
   2. アブラムシをペレット乳棒でホモジナイズし、メーカーの指示に従ってGene-Spin Genomic DNA Isolation Kitを使用してDNAを抽出します( 材料表を参照)。
   3. 50 μLの予熱したヌクレアーゼフリー水でゲノムDNAを溶出します。
2. PCR増幅とDNAシーケンシング
   1. 異なるPCRプログラムでプライマーペアA05LeF/A05LeRおよびLeCO1F/LeCO1R(表1)を含むPCRマスターミックス(2x)を使用して、アブラムシゲノムDNAから標的DNA配列を増幅します²¹。
      注:総容量20 μLのPCR反応は、2 μLのアブラムシゲノムDNAテンプレート、1 μLのフォワードプライマーと1 μLのリバースプライマー、10 μLのPCRマスターミックス( 材料表を参照)、および6 μLのddH₂Oで構成されています。
   2. 94°Cで5分間、94°Cで45秒間、61°C(A05LeF/A05LeRの場合)および58°C(LeCO1F/LeCO1Rの場合)で45秒間、72°Cで1分間、続いて72°Cで5分間延長するプログラムを使用して、サーマルサイクラー( 材料表を参照)でPCRを実行します。
   3. 1%アガロースゲル電気泳動でPCR産物を分析し、マスタードアブラムシの同一性を確認します(図2)。
      注:プライマーペアA05LeF/A05LeRがDNA断片の正しいサイズの増幅に成功した場合、現場で採取されたアブラムシがマスタードアブラムシ²¹として説得力を持って同定されました。プライマーペアを 表2にリストアップします。
   4. マスタードアブラムシCOIアンプリコンのPCR産物を、市販のゲル/PCRキットを用いてメーカーの指示に従って精製し( 材料表を参照)、市販のシーケンシングサービスを用いてPCR産物を配列決定します。
3. 配列解析
   注:Lu et ^al.21によると、A05LeのDNA曲げはマスタードアブラムシ特異的なDNA断片です。したがって、A05Le PCR産物をさらに配列決定する必要はありません。
   1. LeCO1配列を取得した後、Chromasソフトウェア( 材料表を参照)で読み取り品質を確認します。
   2. fasta(またはtxt)ファイルを開き、低品質の読み取りを直接削除することで、アップストリームとダウンストリームの低品質の読み取りをトリミングします。
   3. デフォルトのパラメータを使用して、トリミングされた配列をNCBI web BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)に登録します。
      注:A05LeおよびLeCO1プライマーセットのアンプリコンサイズが正しければ、理論的には、NCBI標準データベースに対するシーケンスブラスト検索はマスタードアプラムシと一致する必要があります。

3. 昆虫病原性真菌の調製

注:この調査で使用したEPFを 表1に示します。

1. 真菌ライブラリーからのEPFの回収
   1. 保存した真菌ストック(30%グリセリンに懸濁した分生子)を-80°Cの冷凍庫から解凍します。
   2. 少量(約10μL)の分生子懸濁液を6 cm 1/4 Sabouraudデキストロース寒天(SDA)プレート(100 mL ddH₂Oあたり1.5 g寒天を含む0.75 gのSabouraudデキストロースブロス)に移し、層流フード内のセルスプレッダーを使用して均等に広げます。
   3. ペトリ皿をパラフィンフィルムで密封し、25°Cの暗闇で10〜14日間インキュベートします。
   4. 1/4 SDAプレート上で真菌塊を縞状にし、分生子を収穫する前に25°Cの暗闇で10〜14日間真菌をインキュベートすることにより、真菌分離株を再培養します²²。
      注:真菌培養は、アブラムシに接種する約10日前に使用する必要があります。14日以上経過したEPF培養物は、病原性試験での使用は推奨されません。
2. 分生子懸濁液の調製
   1. 2〜3 mLの0.03% Tween 80を添加した後、ループを接種することにより、1/4 SDAプレート上の10〜14日齢の真菌培養物から分生子をこすり落とします( 材料表を参照)。
   2. 真菌懸濁液を遠心分離チューブに集めます。
   3. 溶液を最高速度でボルテックスし、光学顕微鏡下で血球計算盤を使用して分生子の数を数え、分生子懸濁液の濃度を10⁸ 分生子/ mLに調整します。
   4. 分生子懸濁液をUV滅菌されたマイクロ噴霧器に移します。
      注:分生子は沈殿しやすいため、分生子懸濁液を移す前に再度ボルテックスします。マイクロ噴霧器は、使用前に層流フードで30分間紫外線にさらす必要があります。

4. カラショウアブラムシに対する病原性スクリーニング

1. 新しく出現した成体の準備
   1. アプテル(翼なし)とアレート(翼のある)成虫を飼育ペトリ皿から切除したばかりの葉に移し、同じ年齢の新しい子孫を繁殖させます。過密状態を避け、alated子孫の生産を最小限に抑えるために、24時間後に成虫を取り除きます^23,24。さらなる実験では、アプテラスな成体のみが使用されます。
   2. 実験のためにアブラムシ間の年齢差を防ぐために、48時間後に成虫段階に成長しない子孫を成虫段階に後付けし(図3)。さらに、アルレートした成体を取り除きます。
2. 接種室の準備
   注:固化する前に葉の円盤を水寒天に埋め込むことができるように、最初に直径9cmのアブラナ科の葉を準備することをお勧めします。
   1. アブラナ科の葉を水道水できれいにし、汚れや残留物、その他の節足動物がある場合は取り除きます。
   2. ペーパータオルで余分な水分を拭き取り、実体顕微鏡を使用してアブラナ科の葉の表面に他の節足動物がいないか確認します。節足動物が存在する場合は、すべて削除します。
   3. 直径9cmの葉の円盤を、下部のシャーレを型として葉に直接押し付けるか、ハサミを使用してカットします。
      注:葉の直径が9 cm未満の場合は、切除した葉を数枚組み合わせます。
   4. 450mgの寒天( 材料表を参照)を30mLのddH₂Oに加熱溶解し、マイクロ波を使用して各ペトリ皿に1.5%の水寒天を調製します。
      注:1.5%水寒天の量は、実験スケールに応じて調整できます。
   5. 層流フードで固化する前に、9cmのシャーレに1.5%水寒天30mLを注ぎ、寒天の表面が半固化するまで寒天が~40°Cまで冷えるのを待ちます。
      注意: ペトリ皿を軽く水平に振って、表面が半固化しているかどうかを確認します。
   6. 葉の円盤を水寒天の上に置き、葉の円盤を寒天に埋め込みます。
      注意: 寒天表面の露出を最小限に抑えます。
   7. 水寒天が完全に固まったら、ペトリ皿の蓋を閉じます。
      注意: すぐにカバーに大量の液滴が結露している場合は、水気化のためにカバーを開いてください。
   8. 葉の円盤に20匹のアプテラス成虫を置きます。
      注意: 口器の損傷を防ぐために、実体顕微鏡で操作することをお勧めします。
3. EPFの接種と観察
   1. 接種チャンバーのカバーを開け、0.3 mLの分生子懸濁液(ステップ3.2から)を、葉のディスクの約15cm上からアブラムシとリーフディスクに直接スプレーします。
      注:スプレーする前に、分生子懸濁液を再度ボルテックスします。噴霧領域は噴霧器によって異なる可能性があるため、実験前にテストする必要があります。この場合、15cmの距離で0.3mLが推奨されます。噴霧領域は葉の円盤全体を覆う必要があり、分生子懸濁液の薄い層が葉の円盤を覆う必要があります。飛沫が葉の上の溜まった水に収束する場合は、接種量を減らす必要があります。接種前および異なる分離株の使用の間に、70%エタノールでテーブルを清掃します。
   2. 分生子懸濁液が乾くのを待ってから、マスタードアブラムシが溺れないようにカバーを閉じます。
      注:実験中にアブラムシが歩き回ることはめったにありません。ただし、アブラムシが逃げないようにすることは依然として必要です。
   3. 接種室をパラフィンフィルムで密閉して相対湿度を高く保ち、接種室を25°Cのインキュベーターに入れ、12:12時間(明:暗)の日長にします。
   4. 接種室のカバーを開けて、実体顕微鏡で12時間ごとに5日間死亡率をカウントします。
   5. カバーに付着した甘露をペーパータオルで拭き取り、新たに出現したアブラムシを細かい絵筆で取り除きます。24時間ごとに水道水でカバーを清掃します。
      注:観察期間は、成虫の寿命に基づいて、アブラムシの種類によって異なる場合があります。
   6. 菌症のために死体を葉の円盤に保管して、接種が成功したことを確認します。
4. 分生子の発芽率の確認
   メモ: この手順はオプションです。分生子の活性を確認するために病原性スクリーニングを実施する際に、分生子の発芽率をペアで確認すること。
   1. 5 μL の分生子懸濁液の 1 滴を 1/4 SDA に 3 回繰り返し滴下します。
   2. 18時間後、光学顕微鏡で発芽率を計算します。1つの液滴で少なくとも100個の胞子をランダムに数えて、真菌の発芽率を確認します。
      注:通常、実験で使用される分離株の発芽率は90%以上である必要があります。

5. 選択されたEPF分離株のバイオアッセイ

注:ステップ4から選択された高毒性を示したEPF分離株は、4つの濃度の分生子懸濁液(10⁴ 〜10⁷ 分生子/ mLの範囲)を使用してマスタードアブラムシに対するバイオアッセイにかけられました。

1. 分生子懸濁液の調製
   1. 手順 3.1 を繰り返して、選択した EPF 分離株を回収します。
   2. ステップ 3.2 を繰り返して、10 4、10 5、10⁶、10⁷ 分生子/mL を含む⁴ つの濃度の分生子懸濁液を調製します。
2. 新しく出現した成体の準備
   1. ステップ4.1を繰り返して、新しく出現した成体を準備します。
3. 接種室の準備
   1. 手順4.1を繰り返します。接種室を準備します。
4. EPFの接種と観察
   1. 手順 4.3 を繰り返します。EPFの接種と4つの濃度の分生子懸濁液の観察をそれぞれ行います。

6. 統計解析

1. 矯正死亡率の計算
   1. 以下に示すように、アボットの式²⁵ を使用して補正死亡率を計算します。
      補正死亡率(%)=[_(MT−MC₎×100%]/(100−MC_{)
      MT}は治療群の死亡率を表し、_MCは対照群の死亡率を表す。
      注:対照群の死亡率は20%を超えてはなりません。
   2. SPSSソフトウェアプラットフォーム( 材料表を参照)を開き、「treatment」や「cor_mor」(補正死亡率を表す)などの変数を作成し、同じ接種濃度で同じ時点で異なる分離株を接種した場合の計算結果を入力します。
   3. 独立したt検定分析には、SPSSで分析、平均と比率の比較、独立サンプルのT検定を選択します。
   4. SPSSでは、「グループ化変数」ボックスに 「treatment 」を入力し、「検定変数」に cor_mor します。異なる真菌分離株によってグループを定義します。 OK を押して分析します。
2. 致死時間の中央値(LT 50)と致死濃度の中央値(LC₅₀)の計算
   1. SPSSを開き、変数「total」、「response」、「duration」/「concentration」を作成し、記録された結果をスプレッドシートに入力します。
   2. SPSSで分析、回帰、プロビットを選択して、LT 50および/またはLC₅₀を計算します。
      注:累積死亡率が最終的に50%を超えない場合、LT50および/または_LC50を推定することはできません。
   3. 「観察された合計」ボックスに 合計 を、「応答頻度」ボックスに 応答 を、「共変量」ボックスに 期間/濃度 を入力します。 OK を押して分析します。
      注: 通常、 オプション を押して、「不均一性係数を使用するための有意水準」を 0.05 に設定します。

結果

提示されたフローチャートは、フィールド収集から病原性スクリーニングまでのマスタードアブラムシの安定した状態を示しています。野外での採集によるアブラムシの維持は、十分な餌の供給とアブラムシのコロニーの安定的な増加を保証しました。野外で採取されたアブラムシは、PCRアンプリコンサイズやLeCO1シーケンシングなどの分子マーカーを使用して、マスタードアブラムシであ?...

ディスカッション

野菜のグループであるアブラナ科は、マスタードアブラムシ(L. erysimi)やキャベツアブラムシ(Brevicoryne brassicae)など、複数のアブラムシ種が頻繁に寄生しています²⁶。台湾では²⁷種とも報告されており、採集地では共存している可能性がある。近縁のアブラムシ種を区別するために、本研究ではマルチプレックスプライマーセット²¹

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Inoculating Loop	NEST Scientific	718201
100 bp DNA Ladder III	Geneaid	DL007
2x SuperRed PCR Master Mix	Biotools	TE-SR01
50 mL centrifuge tube	Bioman Scientific	ET5050-12
6 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16021
6 mm insect aspirator	MegaView Science	BA6001
70 mm filter paper NO.1	Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16001
Agar	Bioman Scientific	AGR001.1	Microbiology grade
Agarose	Bioman Scientific	PB1200
BioGreen Safe DNA Gel Buffer	Bioman Scientific	SDB001T
Chromas	Technelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR Kit	Geneaid	DFH300	https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit	Protech Technology	PT-GD112-V3	http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
Hemocytometer	Paul Marienfeld	640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)	Tai Cheng Farm	1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brush	Tian Cheng brush company	4716608400352
Parafilm M	Bemis	PM-996
Pellet pestle	Bioman Scientific	GT100R
Sabouraud Dextrose Broth	HiMedia	MH033-500G
SPSS Statistics	IBM
TAE buffer 50x	Bioman Scientific	TAE501000
Tween 80	PanReac AppliChem	142050.1661