הערכת ההשפעה של פטריות אנטומופתוגניות נגד חרק פרתנוגנטי, כנימת חרדל, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Cheng-Ju Yang; Yu-Shin Nai

doi:10.3791/65312

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

פרוטוקול זה מציג מערכת ביו-אסאי אופטימלית של עלים מנותקים להערכת היעילות של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) נגד כנימת החרדל (Lipaphis erysimi (Kalt.)), חרק פרתנוגנטי. השיטה מתארת את תהליך איסוף הנתונים במהלך ניסויים בצלוחית פטרי, ומאפשרת לחוקרים למדוד באופן עקבי את האלימות של EPF נגד כנימות חרדל וחרקים פרתנוגנטיים אחרים.

Abstract

כנימת החרדל (L. erysimi) היא מזיק השורץ גידולים מצליבים שונים ומעביר וירוסים צמחיים. כדי להשיג הדברה ידידותית לסביבה, פטריות אנטומופתוגניות (EPF) הן חומרי הדברה מיקרוביאליים פוטנציאליים להדברת מזיק זה. לכן, יש צורך בבדיקת אלימות של מבודדי EPF בתנאי צלחת פטרי לפני היישום בשטח. עם זאת, כנימת החרדל היא חרק פרתנוגנטי, מה שמקשה על רישום נתונים במהלך ניסויים בצלוחית פטרי. מערכת שונה לבדיקות ביולוגיות של עלים מנותקים פותחה כדי לטפל בבעיה זו, באמצעות מיקרו-מרסס כדי לחסן קונידיה על כנימות ולמנוע טביעה על ידי הקלה על ייבוש באוויר לאחר תרחיף נבגים. המערכת שמרה על לחות יחסית גבוהה לאורך כל תקופת התצפית, ודיסקית העלה נשארה טרייה במשך יותר מעשרה ימים, מה שאפשר רבייה פרתנוגנטית של הכנימות. כדי למנוע הצטברות צאצאים, בוצע תהליך של הסרה יומיומית באמצעות מברשת צביעה. פרוטוקול זה מדגים מערכת יציבה להערכת האלימות של מבודדי EPF נגד כנימות חרדל או כנימות אחרות, ומאפשר בחירה של מבודדים פוטנציאליים להדברת כנימות.

Introduction

כנימת החרדל (L. erysimi) היא מזיק ידוע לשמצה השורץ מגוון גידולים מצליבים^וגורם להפסדים כלכליים משמעותיים 1. בעוד שהומלץ על מספר קוטלי חרקים שיטתיים כדי להילחם בנגיעות כנימות, השימוש התכוף בקוטלי חרקים אלה מעלה חששות לגבי עמידות לחומרי הדברה ^2,3. לכן, במונחים של הדברה ידידותית לסביבה, פטריות אנטומופתוגניות (EPF) יכולות לשמש כאסטרטגיית הדברה חלופית מתאימה. EPF הוא פתוגן חרקים בעל יכולת להדביק פונדקאים על ידי חדירה לציפורניים שלהם, מה שהופך אותו לסוכן רב עוצמה להדברת כנימות וחרקים מוצצי צמחים אחרים⁴. יתר על כן, EPF הוכיחה את עצמה כטכניקת הדברה ישימה ובת קיימא, המציעה יתרונות כגון אנטגוניזם לפתוגנים צמחיים וקידום צמיחת צמחים⁵.

EPF ניתן להשיג באמצעות פיתיון קרקע חרקים או מבודד מגופות חרקים בשדה ^6,7. עם זאת, לפני שימוש נוסף של מבודדים פטרייתיים, בדיקת פתוגניות יש צורך. נערכו מספר מחקרים על יעילות EPF נגד כנימות, שהן מזיקות יבול משמעותיות שעלולות לגרום לנזק חמור ^8,9. כנימות חרדל, בין מינים שונים של כנימות, נבדקו לרגישות למספר זנים של Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., ואפילו Alternaria, הידועה בעיקר כפטרייה פתוגנית ספרופיטית וצמחית, אך הראתה כמה השפעות קטלניות נגד כנימות חרדל^10,11,12.

כדי להעריך את היעילות של EPF נגד כנימות בתנאי מעבדה, bioassays ניתן לחלק לשני חלקים עיקריים: תא החיסון חיסון חיסון פטרייתי. הפרוטוקול הנוכחי מתאר בניית תא חיסון, שבו ניתן לתחזק כנימות בשיטות שונות כגון עלה נכרת עם פטוטרת עטופה בכותנה לחה, דיסק עלה נכרת עם צלחת פטרי מרופדת בנייר פילטר לח, תחזוקה ישירה על עציצים, או דיסק עלה נכרת המוטבע באגר מים בתוך צלחת פטרי או מיכל¹⁰^,^11,13. שיטות נפוצות לחיסון פטרייתי כוללות ריסוס קונידיה, טבילת כנימות בתרחיף קונידיה, טבילת עלים בתרחיף קונידיה וחיסון אנדופיטים^{צמחיים 11,14,15,16}. בעוד שקיימות שיטות חיסון שונות, הבדיקות הביולוגיות אמורות לדמות תנאי יישום בשטח. לדוגמה, במקרה של שיטת טבילת עלים^12,17, ניתן להעריך את יעילות EPF, אך מכיוון שהכנימות שורצות את העלים עמוסי הפטרייה, הצד הגבי של הכנימה, שהוא אתר חדירה מועדף^, אינו נחשף בדרך כלל לפטרייה.

כדי להעריך את ההשפעה של EPF בתנאי מעבדה, פרוטוקול זה מציע להשתמש בשיטת העלה המנותק שתוארה על ידי יוקומי וגוטוולד¹⁸ עם כמה שינויים, ואחריה חיסון קונידיה באמצעות מיקרו-מרסס. שיטה זו שומרת על לחות של כ-100% בתא הבדיקה הביולוגית למשך שבעה ימים לפחות ללא צורך בחידוש נוסף של מים^18,19. בנוסף, כליאת הכנימות למשטח אחד מבטיחה את חשיפתן לריסוס קונידיה ומקלה על תצפיות²⁰. עם זאת, כנימות עלולות להיתקע במשטח האגר החשוף תוך כדי תנועה בתוך תא החיסון. יתר על כן, רישום נתונים בניסוי צלחת פטרי עם כנימות חרדל, שהן חרקים פרתנוגנטיים, יכול להיות מאתגר בשל התפתחותן והתרבותן המהירה. קשה להבחין בין מבוגרים מחוסנים לצאצאיהם ללא הסרה. הפרטים כיצד להמשיך עם צעד זה מוזכרים לעתים רחוקות, וכמה גורמים לא עקביים, כגון שטח צריכת עלים, צריך להיות אופטימלי.

פרוטוקול זה מדגים מערכת יציבה לסינון האלימות של מבודדי EPF נגד כנימות חרדל, המאפשרת בחירה של מבודדים פוטנציאליים נגד מיני כנימות שונים מתוך ספריית EPF נרחבת. ניתן לזהות כנימות שנאספו בשטח, וניתן להקים אוכלוסיית מעבדה מספקת של כנימות חרדל כדי להעריך את ההשפעה של מבודדי פטריות שונים באמצעות מתודולוגיה קלה וישימה עם תוצאות עקביות. כנימות פיתחו מנגנונים אבולוציוניים מרובים בתגובה ללחצים אנתרופוגניים אינטנסיביים וחוזרים ונשנים במערכות אקולוגיות חקלאיות, מה שמציב אתגרים לביטחון המזון⁹. לכן, ניתן להרחיב שיטה מתוארת זו כדי להעריך מבודדי EPF פוטנציאליים כנגד מיני כנימות שונים.

Protocol

הערה: תרשים הזרימה המלא מוצג באיור 1.

1. איסוף ותחזוקת כנימות חרדל

אוסף כנימות חרדל
1. הופכים את העלים ובודקים ויזואלית אם יש התפשטות של כנימות חרדל על גידולים מצליבים בשדה.
2. רשום את פרטי אתר הדגימה (כלומר, GPS) ואת הצמחים המארחים, ואשר את ההיסטוריה של יישומי קוטלי חרקים עם החקלאים.
3. השתמשו בשואב חרקים או במברשת צביעה עדינה (ראו טבלת חומרים) כדי לאסוף כ-50 כנימות חרדל לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל מגידולים מצליבים בשדה ולהביא את הדגימה למעבדה תוך 3 שעות.
4. הכינו צלחת פטרי לתחזוקה זמנית עם עלים ממשפחת המצליבים שנכרתו ונייר פילטר חדור מים בתחתית.
5. הניחו את חמש הכנימות על צלחת הפטרי לתחזוקה זמנית בטמפרטורת החדר (25 ± 2 מעלות צלזיוס) עם לחות יחסית של 70% ותקופת צילום של 12:12 שעות (בהיר: כהה) למשך 14 יום כדי לוודא שהכנימה חסה על אויבים טבעיים לפני גידול נוסף.
  הערה: כדי להבטיח שהכנימות שנאספו בשדה נקיות מאויבים טבעיים כגון צרעות טפיליות או פטריות אנטומופתוגניות, חיוני לוודא את היעדרם של אורגניזמים אלה לפני שממשיכים בגידול נוסף.
תחזוקת כנימות חרדל
הערה: כדי לשמור על כנימות חרדל, השתמשו בעלים ממשפחת המצליבים ללא חומרי הדברה (כולל חומרי הדברה ביולוגיים).
1. לספק אספקה יציבה ומספקת של עלים מצליבים (כ 25 ס"מ²).
  הערה: להשיג את העלים המצליבים או מהשוק או לגדל את הצמחים. לפני גידול מסיבי ארוך טווח של כנימות חרדל, ניתן היה לבדוק כמה סוגים שונים של מצליבים כדי למצוא מצליב מתאים. ברגע שהמין של העלה המצליב קבוע, אל תשנו אותו. במחקר זה נעשה שימוש בקומטסונה (Brassica rapa var. perviridis) בשלב 6-7 עלים (ראו טבלת חומרים). בנוסף, השליכו את 2-3 העלים הוותיקים ביותר.
2. הוסיפו מים לפני שנייר הסינון בתחתית יבש לחלוטין.
3. שימו לב לצפיפות האוכלוסייה של כנימות החרדל מדי יום. האוכלוסייה צריכה לגדול פי 2-3 לאחר 7 ימים.
4. כאשר מספר הכנימות גדל, חותכים את העלים שנכרתו במקור עם כנימות חרדל ל 4-6 חתיכות קטנות יותר ומכניסים כל פיסת עלה קטנה עם כנימות חרדל לצלחת פטרי אחת עם עלה טרי נכרת ונייר סינון חדור מים.
5. הניחו את צלחת הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם פוטופריוד של 12:12 שעות (בהיר: כהה) והתבוננו בצפיפות האוכלוסייה של כנימות החרדל מדי יום.
6. מוציאים את העלים המקוריים שנכרתו לאחר שרוב הכנימות נודדות לעלים טריים שנכרתו לפני שהעלים המקוריים נרקבים.

2. זיהוי מולקולרי של כנימת חרדל

הערה: כדי לאשר את המין של כנימת חרדל שנאספה בשדה, בוצע זיהוי מולקולרי באמצעות שני סמנים מולקולריים: הרצף המאופיין באזור מוגבר (SCAR) המבוסס על A05Le שתוכנן על ידי Lu et ^al.21, ואזור כנימת החרדל cytochrome oxidase subunit 1 (COI) של כנימת החרדל.

מיצוי DNA גנומי של כנימת חרדל
1. אספו כ-50 כנימות בצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  הערה: כנימות המשמשות לזיהוי מולקולרי צריכות להיות צאצאים של כנימה אחת בודדת, וניתן גם לאגד שלבים שונים באותו צינור לצורך מיצוי DNA.
2. הומוגניזציה של הכנימות באמצעות כדורית והפקת הדנ"א באמצעות ערכת בידוד DNA גנומית של Gene-Spin בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
3. יש להקנות את הדנ"א הגנומי עם 50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז שחוממו מראש.
הגברה PCR וריצוף DNA
1. הגבירו את רצפי הדנ"א של המטרה מהדנ"א הגנומי של כנימות באמצעות PCR Master Mix (2x) עם זוגות פריימר A05LeF/A05LeR ו-LeCO1F/LeCO1R (טבלה 1) עם תוכניות PCR שונות²¹.
  הערה: תגובת PCR עם נפח כולל של 20 μL מורכבת מתבנית DNA גנומית של 2 μL כנימות , 1 μL קדימה ופריימרים הפוכים 1 μL, 10 μL PCR Master Mix (ראה טבלת חומרים) ו- 6 μL ddH₂O.
2. בצע את ה-PCR במחזור תרמי (ראה טבלת חומרים) עם התוכנית הבאה: 94°C למשך 5 דקות, 25 מחזורים של 94°C למשך 45 שניות, 61°C (עבור A05LeF/A05LeR) ו-58°C (עבור LeCO1F/LeCO1R) למשך 45 שניות, 72°C למשך דקה אחת, ולאחר מכן הארכה סופית של 72°C למשך 5 דקות.
3. נתח את מוצר ה-PCR על-ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% כדי לאשר את זהותה של כנימת החרדל (איור 2).
  הערה: אם זוג הפריימר A05LeF/A05LeR מצליח להגדיל את הגודל הנכון של מקטע הדנ"א, הוא זיהה בצורה משכנעת את הכנימה שנאספה בשדה ככנימת חרדל²¹. זוגות הפריימר מפורטים בטבלה 2.
4. לטהר את מוצר ה-PCR של אמפליקון COI כנימת חרדל באמצעות ערכת ג'ל/PCR זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים), ולרצף את מוצר ה-PCR באמצעות שירות ריצוף מסחרי.
ניתוח רצף
הערה: על פי Lu et ^al.21, כיפוף הדנ"א של A05Le הוא מקטע DNA ספציפי לכנימת חרדל; לכן, מוצר A05Le PCR אינו צריך להיות רצף נוסף.
1. בדוק את איכות הקריאה על ידי תוכנת Chromas (ראה טבלת חומרים) לאחר קבלת רצף LeCO1.
2. חתוך קריאות באיכות נמוכה במעלה ובמורד על-ידי פתיחת קובץ fasta (או txt) והסרה ישירה של קריאות באיכות נמוכה.
3. שלח את הרצף החתוך ל- NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) באמצעות פרמטרי ברירת מחדל.
  הערה: אם גדלי האמפליקון של ערכות הפריימר A05Le ו- LeCO1 נכונים, תיאורטית, חיפוש פיצוץ הרצף מול מסדי נתונים סטנדרטיים של NCBI חייב להתאים לכנימת חרדל.

3. הכנת פטריות אנטומופתוגניות

הערה: ה-EPF ששימש במחקר זה מופיע בטבלה 1.

שחזור EPF מספרייה פטרייתית
1. הפשירו את ציר הפטריות המשומר (קונידיה מרחפת ב-30% גליצרין) מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C.
2. מעבירים כמות קטנה (כ-10 מיקרוליטר) מתרחיף הקונידיה ל-6 ס"מ 1/4 צלחת אגר דקסטרוז סאבורו (SDA) (0.75 גרם מרק דקסטרוז סאבורו עם 1.5 גרם אגר ל-100 מ"ל ddH₂O) ומפזרים אותו באופן שווה באמצעות מפזר תאים במכסה מנוע זרימה למינרית.
3. אוטמים את צלחת הפטרי עם סרט פרפין, ודגרים אותו בחושך ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10-14 ימים.
4. תרבית מחדש את בידוד הפטרייה על ידי פסים של מסה פטרייתית על צלחת SDA של 1/4 ודגירת פטריות בחושך ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10-14 ימים לפני קציר קונידיה²².
  הערה: יש להשתמש בתרבית הפטרייתית כ-10 ימים לפני חיסון הכנימות. תרבית EPF בת יותר מ-14 יום אינה מומלצת לשימוש בבדיקת האלימות.
הכנת השעיית קונידיה
1. יש לגרד את הקונידיה מהתרבית הפטרייתית בת 10-14 הימים על 1/4 צלחת SDA על ידי לולאת חיסון לאחר הוספת 2-3 מ"ל 0.03% Tween 80 (ראה טבלת חומרים).
2. אספו את המתלה הפטרייתי לתוך צינור צנטריפוגה.
3. מערבלים את התמיסה במהירות הגבוהה ביותר, סופרים את מספר הקונידיה באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור, ומתאימים את ריכוז תרחיף הקונידיה ל 10⁸ קונידיה / מ"ל.
4. מעבירים את מתלה הקונידיה למיקרו-מרסס מעוקר UV.
  הערה: מערבלים שוב את מתלה הקונידיה לפני העברתו, מכיוון שהקונידיה נוטה לזרז. יש לחשוף את המיקרו-מרסס לקרינה אולטרה סגולה במכסה מנוע זרימה למינרית למשך 30 דקות לפני השימוש.

4. סינון אלים נגד כנימת חרדל

הכנת מבוגרים שזה עתה יצאו
1. העבירו בוגרים (ללא כנפיים) ואלטים (מכונפים) מצלחת הפטרי המגודלת לעלים טריים שנכרתו כדי להתרבות צאצאים חדשים בני אותו גיל. הסר את המבוגרים לאחר 24 שעות כדי למנוע צפיפות ולמזער את הייצור של צאצאים alated^23,24. רק מבוגרים אפטריים ישמשו בניסויים נוספים.
2. החזירו את הצאצאים לשלב הבוגר והוציאו את הצאצאים שלא מתפתחים לשלב הבוגר לאחר 48 שעות (איור 3) כדי למנוע שונות גיל בין כנימות לצורך הניסוי. בנוסף, הסר מבוגרים alated.
הכנת תא חיסון
הערה: מומלץ להכין תחילה עלים ממשפחת המצליבים בקוטר 9 ס"מ, כך שניתן יהיה להטמיע את דיסקית העלה באגר המים לפני ההתמצקות.
1. נקו את עלי המצליבים במי ברז, הסירו לכלוך ושאריות וכל פרוק רגליים אחר אם קיים.
2. נגבו את עודפי המים בעזרת מגבת נייר ובדקו אם יש פרוקי רגליים אחרים על פני השטח של העלים המצליבים באמצעות סטריאומיקרוסקופ. הסר פרוקי רגליים אם קיימים.
3. חותכים דיסק עלה בקוטר 9 ס"מ על ידי לחיצה ישירה על צלחת הפטרי התחתונה על העלה כתבנית או באמצעות מספריים.
  הערה: אם קוטר העלים קטן מ-9 ס"מ, ערבבו כמה עלים שנכרתו.
4. הכינו אגר מים 1.5% לכל צלחת פטרי על ידי חימום והמסה של 450 מ"ג אגר (ראו טבלת חומרים) ב-30 מ"ל ddH₂O באמצעות מיקרוגל.
  הערה: ניתן להתאים את הכמות של אגר מים 1.5% בהתאם לסולם הניסוי.
5. יוצקים 30 מ"ל של אגר מים 1.5% בצלחת פטרי 9 ס"מ לפני התמצקות במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, ואז ממתינים שהאגר יתקרר ל~40 מעלות צלזיוס עד שפני השטח של האגר מוצקים למחצה.
  הערה: בדוק אם המשטח מוצק למחצה על-ידי ניעור אופקי עדין של צלחת הפטרי.
6. מניחים את דיסקית העלה, משטח אבקסיאלי למעלה, על גבי אגר המים, ומטמיעים את דיסקית העלה באגר.
  הערה: מזער את החשיפה של משטח האגר.
7. לאחר שאגר המים התמצק לחלוטין, סגרו את מכסה צלחת הפטרי.
  הערה: יש לפתוח את הכיסוי לאידוי מים אם טיפות רבות מתעבות על הכיסוי באופן מיידי.
8. מניחים 20 בוגרים על דיסקית העלה.
  הערה: מומלץ לפעול תחת סטריאומיקרוסקופ כדי למנוע נזק לאיברי הפה.
חיסון ותצפית EPF
1. יש לפתוח את מכסה תא החיסון ולרסס 0.3 מ"ל של תרחיף קונידיה (משלב 3.2) ישירות על הכנימות ודיסקית העלה מגובה של כ-15 ס"מ מעל דיסק העלה.
  הערה: מערבבים שוב את מתלה הקונידיה לפני הריסוס. יש לבדוק את אזורי הריסוס לפני הניסוי מכיוון שהם יכולים להשתנות בין מרססים שונים. במקרה זה, מומלץ 0.3 מ"ל עם מרחק של 15 ס"מ. אזור ההתזה צריך לכסות את כל דיסק העלה, ושכבה דקה של תרחיף קונידיה צריכה לכסות את דיסק העלה. אם טיפות מתכנסות למים עומדים על העלה, יש להקטין את נפח החיסון. נקו את השולחן עם 70% אתנול לפני החיסון ובין שימוש במבודדים שונים.
2. המתן עד שתרחיף הקונידיה יתייבש, ולאחר מכן סגור את המכסה כדי למנוע מכנימות חרדל לטבוע.
  הערה: כנימות משוטטות לעתים רחוקות במהלך הניסוי; עם זאת, עדיין יש צורך להבטיח שהכנימות לא יברחו.
3. אטמו את תא החיסון בסרט פרפין כדי לשמור על לחות יחסית גבוהה ומקמו את תא החיסון באינקובטור בטמפרטורה של 25°C עם פוטופריוד של 12:12 שעות (בהיר:כהה).
4. פתח את מכסה תא החיסון כדי לספור תמותה תחת סטריאומיקרוסקופ כל 12 שעות במשך 5 ימים.
5. נגבו את טל הדבש שנדבק לכיסוי במגבת נייר והוציאו את הכנימות שזה עתה הגיחו בעזרת מברשת צביעה עדינה. נקו את הכיסוי במי ברז כל 24 שעות.
  הערה: תקופת התצפית עשויה להשתנות עבור מינים שונים של כנימות בהתבסס על אריכות ימים של בוגרים.
6. שמור את הגופה על דיסק העלה עבור מיקוזיס כדי לאשר חיסון מוצלח.
אישור קצב נביטת קונידיה
הערה: שלב זה הוא אופציונלי. כדי לאשר את קצב נביטת הקונידיה זוג בעת ביצוע בדיקת האלימות כדי להבטיח את הפעילות של conidia.
1. זרוק טיפה אחת של 5 μL conidia suspension על 1/4 SDA עבור שלושה עותקים משוכפלים.
2. לאחר 18 שעות, לחשב את קצב הנביטה עם מיקרוסקופ אור. ספרו לפחות 100 נבגים באופן אקראי בטיפה אחת כדי לאשר את קצב הנביטה הפטרייתית.
  הערה: בדרך כלל, שיעור הנביטה של המבודדים המשמשים בניסוי צריך להיות גבוה מ -90%.

5. בדיקה ביולוגית של מבודדי EPF נבחרים

הערה: מבודדי EPF שהראו אלימות גבוהה, שנבחרה משלב 4, היו נתונים לבדיקה ביולוגית נגד כנימות חרדל באמצעות ארבעה ריכוזים של תרחיפים של קונידיה (בטווח שבין 10⁴ ל -10⁷ קונידיה / מ"ל).

הכנת השעיית קונידיה
1. חזור על שלב 3.1 כדי לשחזר את מבודדי EPF שנבחרו.
2. חזור על שלב 3.2 כדי להכין ארבעה ריכוזים של תרחיף קונידיה, כולל 10,⁴, 10,⁵, 10,⁶ , ו- 10,⁷ , conidia/mL.
הכנת מבוגרים שזה עתה יצאו
1. חזור על שלב 4.1 כדי להכין מבוגרים שזה עתה הופיעו.
הכנת תא חיסון
1. חזור על שלב 4.1. להכין את תא החיסון.
חיסון ותצפית EPF
1. חזור על שלב 4.3. לבצע את החיסון והתצפית של EPF עם ארבעת הריכוזים של תרחיף קונידיה, בהתאמה.

6. ניתוח סטטיסטי

חישוב התמותה המתוקנת
1. חשב תמותה מתוקנת באמצעות נוסחה²⁵ של Abbott, כפי שמוצג להלן:
  תמותה מתוקנת (%) = [(M_T− M C) × 100%] / (100− M_C)
  M_T מייצג את התמותה של קבוצת הטיפול, ו-M_C מייצג את התמותה של קבוצת הביקורת.
  הערה: התמותה של קבוצת הביקורת לא צריכה להיות גבוהה מ-20%.
2. פתח את פלטפורמת התוכנה SPSS (ראה טבלת חומרים), צור משתנים הכוללים "טיפול" ו- "cor_mor" (המייצגים תמותה מתוקנת), והזן את התוצאות המחושבות לחיסון מבודדים שונים באותה נקודת זמן עם אותו ריכוז מחוסן.
3. בחר לנתח, להשוות אמצעים ופרופורציות, מדגם עצמאי T מבחן SPSS לניתוח עצמאי T-TEST .
4. ב- SPSS, קלט טיפול בתיבה "משתן קיבוץ", ולאחר cor_mor ל"משתני בדיקה". הגדר קבוצות על ידי מבודדים פטרייתיים שונים. לחץ על אישור כדי לנתח.
חישוב הזמן הקטלני החציוני (LT 50) והריכוז הקטלני החציוני (LC₅₀)
1. פתח את SPSS, צור משתנים "סה"כ", "תגובה" ו"משך"/"ריכוז", והזן את התוצאה המוקלטת בגיליון האלקטרוני.
2. בחר ניתוח, רגרסיה, פרוביט ב- SPSS כדי לחשב LT 50 ו / או LC₅₀.
  הערה: אם התמותה המצטברת אינה עולה על 50% בסופו של דבר, לא ניתן להעריך LT 50 ו / או LC₅₀.
3. הזן סכום כולל לתיבה "סה"כ נצפה", תגובה לתיבה "תדירות תגובה ", משך/ריכוז לתיבה "משתנים". לחץ על אישור כדי לנתח.
  הערה: באופן כללי, לחץ על אפשרויות והגדר את "רמת מובהקות לשימוש בגורם הטרוגניות" ל- 0.05.

תוצאות

תרשים הזרימה המוצג ממחיש את מצבן היציב של כנימות החרדל מאיסוף השטח ועד לסינון האלימות. תחזוקת הכנימות מאיסוף השדה הבטיחה גידול יציב במושבות הכנימות עם אספקת מזון נאותה. הכנימות שנאספו בשדה אושרו ככנימות חרדל באמצעות שימוש בסמנים מולקולריים, כולל גודל אמפליקון PCR וריצוף LeCO1. בדיקת האלימות,...

Discussion

המצליבים, קבוצה של ירקות, שורצים לעתים קרובות על ידי מינים רבים של כנימות, כולל כנימת חרדל (L. erysimi) וכנימת כרוב (Brevicoryne brassicae)²⁶. שני המינים דווחו בטייוואן²⁷, וייתכן שהם יתקיימו יחד באתר האיסוף. כדי להבחין בין מיני כנימות קרובים, מחקר זה השתמש בטכניקת זיהוי מו?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בעבודה זו.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי 109-2313-B-005 -048 -MY3 ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL Inoculating Loop	NEST Scientific	718201
100 bp DNA Ladder III	Geneaid	DL007
2x SuperRed PCR Master Mix	Biotools	TE-SR01
50 mL centrifuge tube	Bioman Scientific	ET5050-12
6 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16021
6 mm insect aspirator	MegaView Science	BA6001
70 mm filter paper NO.1	Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dish	Alpha Plus Scientific	16001
Agar	Bioman Scientific	AGR001.1	Microbiology grade
Agarose	Bioman Scientific	PB1200
BioGreen Safe DNA Gel Buffer	Bioman Scientific	SDB001T
Chromas	Technelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR Kit	Geneaid	DFH300	https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit	Protech Technology	PT-GD112-V3	http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
Hemocytometer	Paul Marienfeld	640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)	Tai Cheng Farm	1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brush	Tian Cheng brush company	4716608400352
Parafilm M	Bemis	PM-996
Pellet pestle	Bioman Scientific	GT100R
Sabouraud Dextrose Broth	HiMedia	MH033-500G
SPSS Statistics	IBM
TAE buffer 50x	Bioman Scientific	TAE501000
Tween 80	PanReac AppliChem	142050.1661

References

Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Aphidicidal Lipaphis erysimi EPF

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: