JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول نهجا عبر الصلبة موجها بالرؤية عبر الحدقة لتقديم الطعوم الخلوية تحت الشبكية بأمان ودقة ، مع معدل منخفض من المضاعفات الجراحية ، في متلقي الفئران مع أو بدون تنكس الشبكية.

Abstract

يوفر زرع الخلايا المستقبلة للضوء والخلايا الظهارية الصبغية للشبكية (RPE) علاجا محتملا لأمراض تنكس الشبكية. يمثل زرع الخلايا تحت الشبكية للخلايا المانحة العلاجية في متلقي الفئران تحديا بسبب المساحة الجراحية المحدودة التي يسمح بها الحجم الصغير لعين الفأر. قمنا بتطوير منصة زرع جراحية عبر الصلبة مع توجيه مباشر للرؤية عبر الحدقة لتسهيل توصيل الخلايا الخارجية تحت الشبكية في متلقي الفئران. تم اختبار المنصة باستخدام معلقات خلايا الشبكية وصفائح الشبكية ثلاثية الأبعاد التي تم جمعها من الفئران الغنية بالقضبان Rho::EGFP و OPN1LW-EGFP الغنية بالمخروط. NRL- / - الفئران ، على التوالي. أظهر الفحص الحي / الميت انخفاض معدل وفيات الخلايا لكلا الشكلين من الخلايا المانحة. تم تسليم ترقيع الشبكية بنجاح إلى الفضاء تحت الشبكية لنموذج فأر من تنكس الشبكية ، Rd1 / NS ، مع الحد الأدنى من المضاعفات الجراحية كما تم اكتشافها بواسطة التصوير بالليزر متعدد الوسائط (cSLO) المسح الضوئي متحد البؤر. بعد شهرين من الزرع ، أظهر التلوين النسيجي دليلا على النضج المتقدم لترقيع الشبكية إلى قضبان ومخاريط "بالغة" (بواسطة تعبير Rho::EGFP و S-opsin و OPN1LW: EGFP ، على التوالي) في الفضاء تحت الشبكية. هنا ، نقدم منصة جراحية يمكنها تمكين توصيل تحت الشبكية بدقة عالية مع معدل منخفض من المضاعفات في متلقي الفئران. توفر هذه التقنية الدقة والسهولة النسبية لاكتساب المهارات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية ليس فقط لدراسات زرع الخلايا تحت الشبكية ولكن أيضا للدراسات العلاجية الأخرى داخل العين بما في ذلك العلاجات الجينية.

Introduction

يوفر زرع الخلايا الظهارية المصطبغة بمستقبلات الضوء والشبكية (RPE) علاجا محتملا للأمراض التنكسية في شبكية العين مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ومرض ستارغاردت والتهاب الشبكية الصباغي (RP)1،2،3،4،5،6،7. لتجديد أو استبدال المستقبلات الضوئية المريضة وخلايا RPE في شبكية العين المتدهورة ، فإن الفضاء تحت الشبكية مناسب بشكل خاص كهدف زرع نظرا للتشريح الصفحي للمستقبلات الضوئية المضيفة وخلايا RPE. في حين أن الإجراءات الجراحية لزراعة الشبكية الفرعية لخلايا RPE راسخة في الكبيرة8،9،10 والتجارب السريرية11،12،13 ، فإن التحديات التي تواجه أبحاث زرع مستقبلات الضوء تشمل ندرة النماذج الحيوانية الكبيرة المعدلة وراثيا والفهم المحدود لآليات تكوين المشابك المتعمقة المشاركة في زرع الخلايا العصبية ، من بين مخاوف أخرى. توفر نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، مع أنواع مختلفة من طفرات تنكس الشبكية ، أدوات مفيدة لدراسة الآليات الجزيئية في سياق الزرع وتوجيه تطوير علاجات فعالة لاستبدال الخلايا في المرحلة قبل السريرية14،15،16،17،18.

على عكس العين الكبيرة نسبيا والعدسة البلورية الصغيرة في الكبيرة (مثل الخنزير) ، فإن الحجم الصغير والعدسة البلورية الكبيرة لعيون الفأر تجعلها أهدافا جراحية صعبة ، خاصة بالنسبة لزراعة الشبكية حيث تكون قيود المساحة المادية والتصور المباشر المحدود هي التحديات الأساسية.

يمكن تصنيف الأساليب الحالية إلى ثلاثة أنواع رئيسية بناء على مسار الحقن. أولا ، في حالة النهج عبر القرنية ، يتم تمرير الإبرة عبر القرنية إلى التجويف الزجاجي ثم إلى الفضاء تحت الشبكية19,20. يمكن تحقيق الولادة الناجحة تحت الشبكية باستخدام هذه الطريقة ولكن الضرر الذي يلحق بهياكل الجزء الأمامي (أي القرنية والقزحية والعدسة) يمثل خطرا كبيرا قد يعيق بشدة تحليل مجرى النهر في الجسم الحي. ثانيا ، في حالة النهج عبر الجسم الزجاجي ، تدخل الإبرة إلى التجويف الزجاجي من خلال pars plana ثم إلى الفضاء تحت الشبكية21. يستخدم هذا النهج على نطاق واسع في البشر الكبيرة. ومع ذلك ، هناك خطر محتمل لتلف العدسة في القوارض حيث تشغل العدسة حجما نسبيا أكبر من التجويف الزجاجي. والجدير بالذكر أن كلا من البروتوكولات عبر القرنية وعبر الجسم الزجاجي تتطلب اختراق الشبكية العصبية للوصول إلى الفضاء تحت الشبكية ، مما يتسبب في تلف شبكية العين المضيفة ويزيد من خطر ارتجاع الخلايا المانحة من خلال ثقب الاختراق. ثالثا ، في حالة النهج عبر الصلبة22,23 ، تخترق الإبرة مجمع RPE الصلب-المشيمية-وتدخل مباشرة إلى الفضاء تحت الشبكية. يقلل هذا النهج من الصدمة المحتملة لهياكل الجزء الأمامي والتجويف الزجاجي. ومع ذلك ، بدون تصور مباشر لقاع المضيف ، يتم اكتشاف الفشل الجراحي الناجم عن الثقوب عبر الشبكية ، وانفصال RPE ، ونزيف المشيمية.

هنا ، قمنا بتطوير منصة جراحية عبر الصلبة مع توجيه مباشر للرؤية عبر الحدقة لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران. التحقق من صلاحية صفائح شبكية المتبرع ومعلقات الخلايا قبل إجراء الزرع. تم تأكيد التسليم الناجح للخلايا المانحة في الفضاء تحت الشبكية لنموذج فأر تنكس الشبكية. تم الكشف عن المضاعفات الجراحية النادرة فقط. بالإضافة إلى ذلك ، نجت المستقبلات الضوئية المزروعة في ترقيع الشبكية وأظهرت دليلا على النضج المتقدم في قضبان ومخاريط "بالغة" بعد شهرين من الزرع.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، المنقحة عام 1978) وبيان ARVO لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام بجامعة جونز هوبكنز (الموافقة M021M459).

1.

  1. استخدم فئران Rho::EGFP (الذين تتراوح أعمارهم بين P3-P6) كمتبرعين بمعلقات خلايا الشبكية.
    ملاحظة: كانت هذه السلالة هدية كريمة من الدكتور تي وينسل ، كلية بايلور للطب.
  2. استخدم OPN1LW-EGFP / NRL - / - الفئران14 (الذين تتراوح أعمارهم بين P3) كمتبرعين بصفائح الشبكية.
  3. استخدم الفئران البالغة الضمور Rd1 / NS المصابة بنقص المناعة (أي من الجنسين) كمتلقين.
  4. إيواء جميع الفئران في أقفاص تحت دورة 12:12 ساعة من الضوء والظلام مع إمكانية الوصول إلى الماء والطعام حسب الحاجة.

2. جمع شبكية العين العصبية (الشكل 1)

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة. يتم توفير معلومات المورد لأدوات البحث والمنتجات في جدول المواد.

  1. إعداد الفئران المانحة: القتل الرحيم للفئران المانحة بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون وتأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم.
  2. عزل مقل عيون الفئران. للقيام بذلك ، اتبع الخطوات أدناه.
    1. افتح جفون الجراء بعناية باستخدام مقص دقيق لكشف مقلة العين.
    2. استخدم ملقط أملس للإمساك بالعصب البصري وسحب مقلة العين بزوج من الملقط.
  3. عزل الشبكية العصبية
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة تحت مجهر التشريح.
    1. شق ثقب في وسط القرنية باستخدام إبرة معقمة 25 جرام.
    2. قطع القرنية ، من خلال الفتحة ، إلى النصف وتكبير الشق إلى الصلبة و RPE ، ثم إزالة الصلبة و RPE.
    3. استخدم ملقط ذو أسنان دقيقة لإزالة العدسة برفق والجسم الزجاجي لعزل الشبكية العصبية.
    4. تابع القسم 3 لإعداد تعليق شبكية المتبرع أو القسم 4 لإعداد ورقة شبكية المتبرع ، كما هو مطلوب.

3. تحضير تعليق شبكية المتبرع (الشكل 1)

  1. احتضان الشبكية العصبية في محلول غراء عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة حتى لا يتم الكشف عن كتل خلوية.
    ملاحظة: ماصة بلطف خليط الخلية 15x كل 10 دقائق.
  2. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة تفكك غراء لجمع الخلايا المفردة.

4. تحضير صفائح شبكية المتبرع (الشكل 1)

ملاحظة: تتبع هذه الخطوة القسم 2 ويتم تنفيذها تحت مجهر التشريح.

  1. ضع كوب الشبكية العصبية المعزولة في طبق بتري 35 مم مع برنامج تلفزيوني معقم مبرد.
  2. استخدم مقص دقيق لقطع كوب الشبكية العصبي إلى صفائح شبكية متعددة (حوالي 1 مم × 2 مم).

5. إعداد الفئران المتلقية

  1. تخدير الفئران المتلقية بالحقن داخل الصفاق للكيتامين (100 مغ/كغ من وزن الجسم) وزيلازين هيدروكلوريد (20 مغ/كغ من وزن الجسم).
  2. تأكيد المستوى الجراحي للتخدير من خلال ضمان فقدان منعكسات الرمش والألم والتنفس المنتظم والتنفس.
  3. تقييم عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرصة الذيل أو انسحاب ردود فعل الدواسة.
  4. أعد فحص عمق التخدير دائما أثناء إجراء العملية واضبط عمق التخدير إذا كان يستجيب للألم. احتفظ بالفئران على طاولة الجراحة التي تم تسخينها مسبقا لمنع انخفاض حرارة الجسم.
  5. تمدد التلاميذ المتلقيين مع قطرات العين تروبيكاميد 1٪ (الوزن / الحجم) قبل 5 دقائق من الجراحة. يمكن للتلميذ المتوسع جيدا تسهيل التصور عبر الحدقة تحت مجهر التشغيل.
  6. تطهير عين الفأر العاملة والأنسجة العينية المحيطة مع البوفيدون اليود ، وغسل مع برنامج تلفزيوني معقمة.
  7. ضع 0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد على عين الفأر للتسكين.

6. زرع الطعوم تحت الشبكية (الشكل 2)

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة. تم تعقيم الأدوات الجراحية (استخدم صواني الأدوات لحماية أطراف الأدوات وإخراج المكبس من المحاقن الدقيقة لمنعها من التعلق في التجويف). يتم توفير معلومات المورد لأدوات البحث والمنتجات في جدول المواد.

  1. بزل الغرفة الأمامية: اختراق القرنية المحيطية في الغرفة الأمامية بإبرة الأنسولين للسماح للخلط المائي بالخروج السلبي ، لمنع ارتفاع ضغط العين (IOP) أثناء الزرع.
    ملاحظة: يشار إلى البزل الناجح من خلال تدفق الفكاهة المائية من خلال ثقب القرنية.
  2. ضع قطرة من هيالورونات الصوديوم وغطاء زجاجي (قطره 5 مم) فوق القرنية لتمكين التصور عبر الحدقة للقاع تحت المنظار الجراحي.
  3. استخدم ملقط مسنن لكشف موضع الحقن (1 مم بعد القرنية) عن طريق الضغط إما على جدار العين العلوي أو السفلي ، كما هو مطلوب في التجربة ، نحو مركز الرؤية عبر الحدقة.
  4. استخدم إبرة الحقن المجهري لاختراق الصلبة بشكل عمودي.
  5. قم بتدوير اتجاه الإبرة بعناية بشكل عرضي للسماح بالاختراق الكامل لمركب الصلبة المشيمية RPE في الفضاء تحت الشبكية.
  6. أدخل الإبرة بشكل عرضي للوصول إلى موضع الحقن الطرفي.
    ملاحظة: تحقق من الموضع الكامل لشطبة الإبرة عن طريق توجيه الرؤية عبر الحدقتين. استخدم الأوعية الشبكية السطحية كمرجع تشريحي لتحديد موضع الإبرة بدقة داخل الفضاء تحت الشبكية.
  7. حقن ترقيع الشبكية
    ملاحظة: يمكن أن يسهل وجود فقاعات صغيرة محملة مسبقا في المحقنة التحقق من صحة الوضع الدقيق تحت الشبكية للخلايا المانحة. يزيد ارتفاع IOP الناتج عن الحقن تحت الشبكية من خطر ارتجاع خلايا المتبرع.
    1. إذا أصبحت القرنية غائمة24,25 ، وهو مؤشر على ارتفاع IOP ، احتفظ بالإبرة في الفضاء تحت الشبكية لمدة 3 دقائق على الأقل حتى تختفي القرنية ، وهو مؤشر على أن IOP قد انخفض بشكل كاف.
      ملاحظة: في حالات نادرة ، قد يستغرق IOP وقتا أطول للتطبيع ، ويوصى بإبقاء الإبرة في مكانها حتى يتم استعادة وضوح القرنية حتى لو استغرق ذلك من 8 إلى 10 دقائق. مراقبة تحت المجهر الجراحي لمنع تلف هياكل الشبكية.
  8. أمسك حافة فتحة الحقن بالملقط ذي الأسنان الدقيقة واسحب الإبرة بسرعة.
    ملاحظة: معايير التوصيل الناجح تحت الشبكية لمعلق خلية الشبكية والصفيحة هي فقاعة ثابتة وصفيحة بيضاء مرئية في الفضاء تحت الشبكية ، على التوالي.
  9. تنظيف المنطقة الجراحية للعين بالدموع الاصطناعية وتطبيق مرهم إذا لزم الأمر.
  10. إدارة ما بعد الجراحة
    1. ضع الفئران المزروعة في قفص استرداد نظيف تم تسخينه مسبقا (37 درجة مئوية) وراقبه بعناية بحثا عن الضيق.
    2. ضع قطرة من بروباراكائين هيدروكلوريد الموضعي 0.5٪ على العين الجراحية 2-3 مرات في حالة حدوث ضائقة.
    3. أعد الفئران إلى قفص المنزل بعد أن تكون الفئران في حالة تأهب تام ومتحركة. ضع عددا صغيرا من كريات الطعام وكوب جل في القفص إذا واجهت الفئران مشكلة في الوصول إلى قادوس الطعام.
      ملاحظة: حافظ على سطح العين رطبا حتى يزول التخدير لمنع تكوين إعتام عدسة العين.

7. التصوير بالليزر بالمسح متعدد الوسائط لتنظير العين بالليزر (cSLO)

  1. بعد شهرين من الزرع ، قم بتخدير الفئران Rd1 / NS المتلقية (ن = 5) عن طريق الحقن داخل الصفاق للكيتامين (100 مجم / كجم من وزن الجسم) وزيلازين هيدروكلوريد (20 مجم / كجم من وزن الجسم) للتصوير.
  2. تمدد حدقة العين باستخدام قطرات العين تروبيكاميد 1٪ (بالوزن / الحجم).
  3. قم بإجراء تصوير متعدد الوسائط قياسي بزاوية 55 درجة باستخدام نظام منظار العين بالليزر cSLO22.
  4. احصل على صور MR و SD-OCT باستخدام متوسط 30 إطارا من ART.

8. تلطيخ الأنسجة

  1. قم بإعداد شرائح مجمدة من عيون الفئران Rd1 / NS المزروعة كما تم الإبلاغ عنه سابقا 14.
  2. قم بسد واختراق الشرائح المجمدة لشبكية العين المزروعة باستخدام مزيج من 5٪ مصل الماعز و 1٪ Triton X100 في PBS.
  3. احتضان العينات بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية واشطفها في برنامج تلفزيوني (5 دقائق ، 3x). تشمل الأجسام المضادة الأولية الماعز المضاد ل GFP-FITC (1: 200) ، ومضاد الأرنب للتعافي (1: 1000) ، ومضاد الأرنب S-opsin (1: 500).
  4. احتضان العينات بالأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للأرانب Cy3 ، 1: 500) ومضادتها ب DAPI.
    ملاحظة: يتم سرد موردي الأجسام المضادة الأولية والثانوية في جدول المواد.

النتائج

يتم تسليم ترقيع الشبكية بنجاح إلى الفضاء تحت الشبكية والبقاء على قيد الحياة في الجسم الحي.
تم تقييم أداء منصة زرع تحت الشبكية لدينا في الفئران المتلقية Rd1 / NS الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع عندما كانت شبكية العين المتبقية ضعيفة للغاية بسبب تنكس الطبقة النووية الخارجية شبه الكامل (ONL). ونظرا لهشاشة شبكية العين، وندرة المستقبلات الضوئية المخروطية، وضعف صلاحية الخلايا المعلقة نسبيا مقارنة بالجهات المانحة للصفائح والفئران الغنية بالمخروط (OPN1LW-EGFP; تم استخدام NRL-/-)14 كمصادر لصفائح شبكية المتبرع والفئران الغنية بالقضبان (Rho::EGFP) كمتبرع لمعلقات الخلايا. تم تسليم صفائح الشبكية الغنية بالمخروط ومعلقات الخلايا الغنية بالقضيب بنجاح إلى الفضاء تحت الشبكية لجميع الفئران المتلقية باستخدام منصتنا الجراحية ، كما أكدت الفقاعة تحت الشبكية والصفيحة البيضاء التي شوهدت باستخدام التصور عبر الحدقة مباشرة بعد الحقن. بعد شهرين من الزرع ، تم إجراء تصوير cSLO متعدد الوسائط لتتبع حالات ترقيع الشبكية في الجسم الحي. أظهر مسح OCT المستعرض أن ترقيع الشبكية نجا في الفضاء تحت الشبكية وأعاد تشكيل ONL في جميع الفئران المتلقية (الشكل 3 أ). لم يكتشف التصوير بالأشعة تحت الحمراء أي إعتام عدسة العين الواضح في جميع العيون المزروعة (الشكل 3 ب). نادرا ما تم اكتشاف مضاعفات جراحية أخرى بما في ذلك النزف في شبكية العين المزروعة (ن = 1/10 عيون) عن طريق التصوير العاكس متعدد الألوان بعد شهرين من الزرع (الشكل 3C). أجرينا تلطيخا نسيجيا لإجراء مزيد من التقييم لبقاء ومدى نضج المستقبلات الضوئية في ترقيع الشبكية. لوحظت مستقبلات ضوئية مخروطية وفيرة تعبر عن OPN1LW: EGFP و S-opsin في صفائح الشبكية المزروعة. وبالمثل ، أظهرت معلقات خلايا الشبكية المزروعة نسبة كبيرة من مستقبلات Rec + الضوئية في الجسم الحي ، بما في ذلك العديد من قضبان Rho::EGFP + (الشكل 3D). أظهرت الفئران الضابطة غير المزروعة تنكسا شديدا ل ONL مع مستقبلات ضوئية مخروطية متفرقة (Rec +). لم يتم الكشف عن أي إشارة EGFP في شبكية العين Rd1 / NS غير المزروعة (الشكل 3D).

figure-results-2211
الشكل 1: رسم تخطيطي لجمع صفائح شبكية المتبرع ومعلقات الخلايا. مخططات توضح الخطوات الرئيسية لجمع معلقات خلايا الشبكية والصفائح من الفئران المانحة Rho::EGFP . أظهر التصوير الساطع والفلورسنت صورا تمثيلية لخلايا منفصلة وصفيحة تشريح معزولة من فئران Rho::EGFP . الخط المنقط الأصفر: الهامش الجراحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2871
الشكل 2: إجراءات زرع صفائح الشبكية تحت الشبكية وتعليق الخلايا في الفئران Rd1 / NS . (أ) صور تخطيطية لإعداد الفئران المتلقية. (ب) العمليات الجراحية الرئيسية والرسوم البيانية المقابلة التي توضح زراعة الخلايا تحت الشبكية لمعلقات الخلايا الشبكية وأوراقها. تشمل الخطوات الجراحية ما يلي: 1. اختراق الغرفة الأمامية. 2. إسقاط هيالورونات الصوديوم على القرنية ، ثم تركيب غطاء على رأس هيالورونات الصوديوم لتسهيل التصور عبر الحدقة. 3. اختراق الطبقات الخارجية لجدار العين (مجمع الصلبة المشيمية RPE). توجد زوايا اختراق الإبرة في أعلى اللوحة اليمنى من الرسم التوضيحي ؛ 4. إدراج إبرة الحقن. 5. حقن الطعوم. تظهر الصور التمثيلية التسليم الناجح لمعلقات خلايا الشبكية والورقة في اثنين من المتلقين الفرديين ، على التوالي. النجمة: رأس العصب البصري. رؤوس الأسهم الحمراء: الأوعية الدموية في شبكية العين. رأس السهم الأبيض: طرف إبرة مخترق ؛ الأسهم البيضاء: معلقات الشبكية المطعمة أو ورقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4129
الشكل 3: التوصيل الناجح لترقيع الشبكية إلى الفضاء تحت الشبكية والبقاء على قيد الحياة في الجسم الحي. (أ) أظهرت صور SD-OCT التمثيلية التوزيع تحت الشبكي لصفائح الشبكية المزروعة ومعلقات الخلايا في فأرين فرديين من Rd1 / NS ، على التوالي. تم جمع الفئران Rd1 / NS غير المزروعة كعنصر تحكم. يشار إلى منطقة الاهتمام (ROI) بواسطة مربعات صفراء منقطة على صور قاع العين بالأشعة تحت الحمراء (IR). يتم تعيين الشبكية الداخلية على أنها صفيحة لطبقة خلايا العقدة الشبكية (RGC) وطبقة الضفيرة الداخلية (IPL) والطبقة النووية الداخلية (INL). (ب) أظهرت صورة الأشعة تحت الحمراء التمثيلية (IR) لفأر Rd1 / NS المزروع عدم وجود إعتام عدسة العين من خلال التلميذ المتوسع. (ج) صور انعكاس تمثيلية متعددة الألوان (MR) لعيون Rd1 / NS المزروعة وغير المزروعة. لم تظهر العيون المزروعة أي مضاعفات جراحية واضحة بما في ذلك النزيف. (د) تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) للفئران المزروعة (الصفيحة والمعلقة) وغير المزروعة (الضابطة) Rd1 / NS . أظهرت البيانات العديد من المستقبلات الضوئية المطعمة التي تعبر عن علامات محددة للمستقبلات الضوئية (Rec) ، والقضبان (Rho::EGFP) ، ومخاريط L / M (OPN1LW: EGFP) ، والأقماع S (S-opsin) بعد شهرين من الزرع. تم تحديد الصفيحة الشبكية المتلقية من خلال تلطيخ DAPI (الأزرق). تم تحديد ترقيع الشبكية من قبل مراسل EGFP (أخضر). أظهرت شبكية الفئران غير المزروعة تنكسا شديدا ل ONL مع مستقبلات ضوئية مخروطية متفرقة متفرقة (Rec +). لم يتم الكشف عن أي إشارة EGFP في شبكية العين Rd1 / NS غير المزروعة. تم عرض صور مكبرة على اللوحتين الأيمنتين. الاختصارات: RGC: طبقة خلايا العقدة الشبكية. INL: الطبقة النووية الداخلية. ONL: الطبقة النووية الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يمثل زرع تحت الشبكية في الفئران تحديا تقنيا بسبب صغر حجم عيون الفأر. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير منصة بسيطة وقابلة للتكرار لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران. تسمح المنصة بالاتساق في حماية قدرة المانحين على البقاء ، والولادة الناجحة تحت الشبكية ، وتضمن معدل مضاعفات منخفض.

تم تطوير تقنية زرع تحت الشبكية الموضحة هنا بناء على الطريق عبر الصلبة ، حيث تخترق إبرة الحقن الطبقات الخارجية (مجمع الصلبة المشيمية RPE) لجدار العين. بالمقارنة مع النهج عبر القرنية19،20 وعبر الجسم الزجاجي21،26،27 ، يدخل النهج عبر الصلبة مباشرة إلى الفضاء تحت الشبكية دون اختراق هياكل الجزء الأمامي والشبكية العصبية ، مما يتيح عملية زرع غير ضارة وتقليل خطر ارتجاع الخلايا المانحة من خلال ثقب الاختراق. يتمثل أحد تحديات النهج عبر الصلبة في ضمان انتشار طرف الإبرة على طول الفضاء تحت الشبكية قبل الوصول إلى موقع التسليم النهائي ، مع تجنب الاضطراب المحتمل لطبقات RPE والمشيمية المجاورة. من الصعب تحقيق هذه الأهداف من خلال نهج تقليدي عبر الصلبة28,29 دون توجيه بصري مباشر. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير منصة موجهة بالرؤية عبر الحدقة باستخدام مجهر جراحي وإضاءة خارجية للشبكية لتسهيل زرع تحت الشبكية في نماذج الفئران. تسمح المنصة للمشغل بتتبع العملية الجراحية وحالة شبكية العين لدى المتلقين من خلال توفير تصور في الوقت الفعلي لقاع العين تحت المجهر الجراحي. على سبيل المثال ، يمكن التحقق من الاختراق الناجح لمجمع sclera-choroid-RPE ببساطة من خلال انعكاس ساطع نسبيا لطرف الإبرة عبر التصور عبر الحدقتين. الأهم من ذلك ، عند الاسترشاد بالتصور عبر الحدقة ، يمكن للمشغل تعديل زاوية وعمق الحقن بدقة وفقا للموضع النسبي بين الإبرة والهياكل التشريحية في شبكية العين المتلقية (على سبيل المثال ، أوعية الشبكية ورأس العصب البصري). علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي الإدارة الدقيقة للمواد باستخدام هذه التقنية إلى تقليل RPE وصدمة المشيمية والمضاعفات الجراحية الأخرى. في الواقع ، وجدنا أنه يمكن تقليل النزيف عن طريق تجنب المناورات على مقربة من الأوعية الدموية في شبكية العين بمساعدة التصور عبر الحدقتين.

ارتجاع الخلايا المانحة هو سبب رئيسي للفشل الجراحي بعد الحقن29,30. هناك العديد من العوامل المشاركة في تعزيز ارتجاع خلايا المتبرع. يعد ارتفاع ضغط العين (IOP) للعيون المتلقية الناجم عن مخاليط خلايا المتبرع المحقونة عاملا مهما يعزز ارتداد الخلايا خارج العين. يقلل بروتوكولنا من IOP للمتلقين عن طريق اختراق الغرفة الأمامية في بداية الجراحة ويمكن IOP من الانخفاض تلقائيا عن طريق خروج السائل المائي قبل سحب الإبرة الزجاجية من التجويف الزجاجي. العامل الثاني هو نفق الحقن غير المختوم في عيون المتلقين. لمنع ارتداد الكسب غير المشروع مرة أخرى عبر نفق الحقن ، نستخدم إبرة حقن دقيقة صغيرة الحجم (34G) لإنشاء نفق ذاتي الإغلاق عند اختراق جدار العين وملقط دقيق مسنن لتثبيت حواف فتحة النفق الخارجي عند سحب الإبرة. في عمليات الزرع التقليدية ، بالكاد يتم اكتشاف الطعوم المرتدة لأنها قد تحدث بسرعة أو تتبدد بسرعة. هيالورونات الصوديوم ، عند تطبيق غطاء الغطاء ، ينزلق دائما تقريبا من القرنية لتغطية معظم الأطراف والصلبة بما في ذلك موقع بضع التصلب. بعد حقن الخلايا ، يمكن أن تساعد هيالورونات الصوديوم في موقع بضع التصلب في إبطاء التدفق الأكبر للمحتويات المرتجلة ، إن وجدت ، وتساعد على جعلها قابلة للكشف بصريا تحت المجهر الجراحي. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا التحقق من عدم وجود ارتجاع من خلال تتبع ثبات الفقاعة تحت الشبكية لتعليق الخلايا والموقع داخل العين لورقة الشبكية باستخدام بروتوكولنا ، والذي قد يكون مفيدا للمختبرات التي لا يتوفر فيها التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT).

في حين نجا عدد كبير من الخلايا المستقبلة للضوء في صفائح الشبكية المزروعة ، لا يمكن اكتشاف أي اتجاه خلوي واضح أو اتجاه الصفيحة. على الرغم من أن تسليم صفائح الشبكية ثلاثية الأبعاد للحيوانات الكبيرة قد تم تأسيسه26،31،32 ، فإن الفضاء تحت الشبكية في الفئران ، إلى جانب عدم وجود قدرة تصوير شبكية أثناء العملية ، يجعل من الصعب للغاية ضمان الحفاظ على اتجاه الورقة أثناء الجراحة وكذلك في فترة ما بعد الجراحة مباشرة التي قد تصبح خلالها الخلايا أو الأوراق المزروعة غير مستقرة مع استعادة الفأر للإسعاف.

نحن نصف منصة جراحية عبر الصلبة مع توجيه الرؤية المباشرة عبر الحدقة لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران. تتيح هذه المنصة دقة عالية للحقن ومعدل منخفض من المضاعفات الجراحية. تتيح هذه المنصة التوصيل الدقيق للجرعات المعروفة من الخلايا ، وهي سهلة التعلم نسبيا ، وتسهل التوصيل تحت الشبكية بالإضافة إلى الحقن داخل الشبكية أو داخل الجسم الزجاجي لأنواع مختلفة من العوامل العلاجية بما في ذلك العلاج الجيني.

Disclosures

MSS هي / كانت مستشارا مدفوعا الأجر لشركة Revision Therapeutics و Johnson & Johnson و Third Rock Ventures و Bayer Healthcare و Novartis Pharmaceuticals و WL Gore and Associates و Deerfield و Trinity Partners و Kala Pharmaceuticals و Acucela. تتلقى MSS دعما بحثيا برعاية من Bayer. تمت مراجعة هذه الترتيبات والموافقة عليها من قبل جامعة جونز هوبكنز وفقا لسياساتها المتعلقة بتضارب المصالح. تم تسمية KVL كمخترعين في طلبات براءات الاختراع في جامعة كولورادو. تم تسمية MSS و YVL كمخترعين في طلبات براءات الاختراع في جامعة جونز هوبكنز.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال التمويل التالي: NEI R01EY033103 (MSS) ، مؤسسة مكافحة العمى (MSS) ، مؤسسة Shulsky (MSS) ، صندوق جوزيف ألبرت حكيميان (MSS) ، مؤسسة Juliette RP Vision (YVL) ، أبحاث للوقاية من العمى (منحة غير مقيدة لمعهد ويلمر للعيون في جامعة جونز هوبكنز ومعهد كولين للعيون في كلية بايلور للطب). نشكر الدكتورة ماليا إدواردز (كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز) على تفضلها بتوفير التدريب على المجهر.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Artificial tearsCareAllP31447-04
Coverslips (5mm in diameter)DeckglaserN/A
Goat anti-GFP (FITC)AbcamAb6662
Goat-anti-rabbit Cy3 InvitrogenA10520
Insulin syringe (30G)Easy Touch08496-3015-11
KetamineVETone ZetamineAH2017J
Live Dead Viability KitThermo Fisher ScientificL3224
Micro scissorHarvard Apparatus72-8503
Micro smooth forcepsASICOAE-4360
Micro toothed forcepsWorld Precision Instruments555041FT
Microinjection needle (26G)Hamilton7804-03
Microinjection needle (34G)Hamilton207434
Microinjection syringeHamilton7633-01
Papain dissociation kitWorthington BiochemicalLK003150
Petri-dish (35 mm)Thermo Fisher ScientificFB012920
Povidone-iodine (10%)Betadine SolutionN/A
Proparacaine Hydrochloride (0.5%)KeelerAX0500
Rabbit anti-recoverinMilliporeAb5585
Rabbit anti-S-opsinMilliporeAb5407
Sodium hyaluronateJohnson & Johnson Vision 10-2400-11
Sterile cotton swabsPuritan25-806 2PC
Sterile needle (25G)BD PrecisionGlide Needle305122
Sterile towel drapesDynarex4410
Surgical materials/reagents
Tropicamide ophthalmic solutionHenry Schein112-7192
XylazineAnaSed InjectionN/A

References

  1. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  2. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).
  3. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Sci Transl Med. 10 (435), (2018).
  4. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  5. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  6. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Sci Transl Med. 11 (475), (2019).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).
  8. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).
  9. Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
  10. Klassen, H., et al. Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients. Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).
  11. Das, T., et al. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study. Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).
  12. Humayun, M. S., et al. Human neural retinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).
  13. Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).
  14. Liu, Y. V., et al. Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line. Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).
  15. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
  16. Ortin-Martinez, A., et al. Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material. EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Singh, M. S., et al. Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion. Nat Commun. 7, 13537 (2016).
  19. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
  20. Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).
  21. Fang, Y., et al. Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).
  22. Liu, Y. V., et al. Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation. Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).
  23. Liu, Y. V., et al. Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin. Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).
  24. Park, S., et al. Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies. Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).
  25. Li, X., et al. Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells. Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).
  26. Chao, J. R., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate. Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).
  27. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  28. Zhao, C., et al. Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J Vis Exp. (126), e55220 (2017).
  29. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), e4286 (2012).
  30. Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).
  31. Luo, Z., et al. Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors. Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).
  32. Luo, Z., et al. Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates. Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved